Биологическая химия - часть 35

Рис. 4.19. Зависимость скорости

реакции от концентрации фермен-

та в присутствии насыщающих

концентраций субстрата.

отмечено, фермент является одной из реагирующих молекул в химической

реакции и при взаимодействии с субстратом образует промежуточный

фермент-субстратный комплекс, который далее подвергается распаду на

продукт и свободный фермент:

Если упростить это уравнение, исключив промежуточный ES-комплекс:

то в уравнениях для скоростей прямой и обратной реакций обязательным

компонентом является концентрация фермента:

v

+1

 = k

+1

[E]•[S]; v

+2

 = k

–1

[E]•[Р].

Однако в уравнениях для константы равновесия (K

eq

 или К

р

) концент-

рация фермента уже не имеет значения:

Как видно, константа равновесия (K

р

) ферментативной реакции не

зависит от концентрации фермента. Определяя скорость и направление

химической реакции, фермент тем не менее не оказывает влияния на

конечные (равновесные) концентрации реагирующих молекул и продуктов,

определяющих величину константы равновесия.

Активирование и ингибирование ферментов

Скорость ферментативной реакции, как и активность фермента, в значи-

тельной степени определяется также присутствием в среде активаторов

и ингибиторов: первые повышают скорость реакции, а вторые тормозят эту

реакцию. Активирующее влияние на скорость ферментативной реакции

оказывают разнообразные вещества органической и неорганической приро-

ды. Так, соляная кислота активирует действие пепсина желудочного сока;

145

Количеств

о

 продукт

а

Время

Повышени

е

концентраци

и

 фермент

а

4х

3х

2х

1х

желчные кислоты повышают активность панкреатической липазы; неко-

торые тканевые ферменты (оксидоредуктазы, катепсины, аргиназа), расти-

тельная протеиназа и др. в значительной степени активируются соеди-

нениями, содержащими свободные SH-группы (глутатион, цистеин), а ряд

ферментов – также витамином С. Особенно часто активаторами выступают

ионы двухвалентных и, реже, одновалентных металлов. Получены дока-

зательства, что около четверти всех известных ферментов для проявления

полной каталитической активности нуждаются в присутствии металлов.

Многие ферменты вообще не активны в отсутствие металлов. Так, при

удалении цинка угольная ангидраза (карбоангидраза), катализирующая

биосинтез и распад Н

2

СО

3

, практически теряет свою ферментативную

активность; более того, цинк при этом не может быть заменен никаким

другим металлом. Известны ферменты *, действие которых активируется

ионами нескольких металлов; в частности, енолаза активируется Mg

2+

,

Mn

2+

, К

+

 (табл. 4.4).

Таблица 4.4. Ферменты, активируемые металлами

Фермент

Цитохромы

Каталаза

Пероксидаза

Триптофаноксидаза

Гомогентизиказа

Аскорбатоксидаза

Тирозиназа

Фенолоксидаза

Ксантиноксидаза

Нитратредуктаза

Альдегидоксидаза

Некоторые пептидазы

Металл

Fe

Fe

Fe

Fe

Fe

Cu

Cu

Cu

Mo

Mo

Mo

Co

Фермент

Амилаза

Липаза

Карбоангидраза

Лактатдегидрогеназа

Уриказа

Карбоксипептидаза

Пируваткарбоксилаза

Фосфатазы

Фосфоглюкокиназа

Аргиназа

Фосфоглюкомутаза

Холинэстераза

Металл

Са

Са

Zn

Zn

Zn

Zn

Mg

Mg

Mg

Mn

Mn

Mn

Молекулярный механизм действия металлов в энзиматическом катализе,

или роль металлов в активировании ферментами. В ряде случаев ионы

металлов (Со

2+

, Mg

2+

, Zn

2 +

, Fe

2+

) выполняют функции простетических

групп ферментов, или служат акцепторами и донаторами электронов, или

выступают в качестве электрофилов либо нуклеофилов, сохраняя реактив-

ные группы в необходимой ориентации. В других случаях они способствуют

присоединению субстрата к активному центру и образованию фермент-

субстратного комплекса. Например, ионы Mg

2+

 через отрицательно заря-

женную фосфатную группу обеспечивают присоединение монофосфатных

эфиров органических веществ к активному центру фосфатаз, катализирую-

щих гидролиз этих соединений. Иногда металл соединяется с субстратом,

образуя истинный субстрат, на который действует фермент. В частности,

ионы Mg

2+

 активируют креатинфосфокиназу благодаря образованию ис-

тинного субстрата – магниевой соли АТФ. Наконец, имеются эксперимен-

тальные доказательства прямого участия металлов (например, ионов Са

2+

* Обычно трудно провести границу между металлоферментами (когда металл связан

прочно с белком и незаменим) и ферментами, активируемыми металлами (последние лишь

ускоряют реакцию и легко диссоциируют).

146

в молекуле амилазы слюны) в формировании и стабилизации активного

центра и всей трехмерной структуры молекулы фермента. Следует отме-

тить также, что металлы нередко выступают в роли аллостерических

модуляторов (эффекторов; см. рис. 4.22). Взаимодействуя с аллостеричес-

ким центром, подобный металл (эффектор) способствует образованию

наиболее выгодной пространственной конфигурации фермента и активного

фермент-субстратного комплекса.

Анионы в физиологических концентрациях обычно неэффективны или

оказывают небольшое активирующее влияние на ферменты. Исключение

составляют пепсин, некоторые оксидоредуктазы, активируемые анионами,

а также амилаза слюны, катализирующая гидролиз крахмала, активность

которой повышается при действии ионов хлора, и аденилатциклаза, кото-

рая активируется анионами галогенов.

И н г и б и т о р ы ферментов обычно принято делить на два больших

класса: обратимые и необратимые. Это вещества, вызывающие частичное

(обратимое) или полное торможение реакций, катализируемых фермента-

ми. Недавно открыты  а н т и ф е р м е н т ы (антиэнзимы, или антизимы),

представляющие собой белки (или полипептиды), действующие как инги-

биторы ферментов. К подобным веществам относятся, например, инги-

битор трипсина, обнаруженный в соевых бобах, и сывороточный анти-

трипсин. Недавно открыт в печени животных антифермент орнитинде-

карбоксилазы (см. главу 12). Антизимы, вероятнее всего, образуют трудно-

диссоциируемые комплексы с соответствующими ферментами, выключая

их из химических реакций. Иногда ингибитор является составным компо-

нентом предшественника фермента, например пепсина (см. главу 12), или

входит в состав сложных комплексов ферментов, например в состав

протеинкиназы и протеинфосфатазы, катализирующих процессы фосфо-

рилирования-дефосфорилирования в живых организмах. Однако до сих

пор не выяснено, являются ли подобные антиферменты истинными инги-

биторами или регуляторными субъединицами, в частности, какова разница

в назначении регуляторной (R) субъединицы в составе протеинкиназы

и ингибиторной (I) субъединицы в составе протеинфосфатазы.

Ферменты являются белками, поэтому любые агенты, вызывающие

денатурацию белка (кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов, нагревание),

приводят к необратимой инактивации фермента. Однако подобное инак-

тивирование относительно неспецифично, оно не связано с механизмом

действия ферментов. Гораздо большую группу составляют так называемые

специфические ингибиторы, которые оказывают свое действие на какой-

либо один фермент или группу родственных ферментов, вызывая обрати-

мое или необратимое ингибирование. Исследование этих ингибиторов

имеет важное значение. Во-первых, ингибиторы могут дать ценную инфор-

мацию о химической природе активного центра фермента, а также о составе

его функциональных групп и природе химических связей, обеспечивающих

образование фермент-субстратного комплекса. Известны вещества, вклю-

чая лекарственные препараты, специфически связывающие ту или иную

функциональную группу в молекуле фермента, выключая ее из химической

реакции. Так, йодацетат IСН

2

—СООН, его амид и этиловый эфир, пара-

хлормеркурибензоат ClHg—С

6

Н

4

—СООН и другие реагенты сравнитель-

но легко вступают в химическую связь с некоторыми SH-группами фер-

ментов. Если такие группы имеют существенное значение для акта ката-

лиза, то добавление подобных ингибиторов приводит к полной потере

активности фермента:

R-SH + IСН

2

—СООН —> НI + R—S—CH

2

—COOH

147

Действие ряда других ферментов (холинэстераза, трипсин и химотрип-

син) сильно тормозится некоторыми фосфорорганическими соединениями,

например ДФФ, вследствие блокирования ключевой гидроксильной группы

серина в активном центре (см. ранее).

Во-вторых, ингибиторы нашли широкое применение в энзимологии при

исследовании природы множественных форм ферментов и изоферментов,

различающихся не столько электрофоретической подвижностью, сколько

различной чувствительностью к одному и тому же ингибитору.

При помощи ингибиторов, выключающих отдельные стадии многосту-

пенчатого метаболического процесса, могут быть точно установлены не

только последовательность химических реакций, но и природа участвую-

щих в этих превращениях ферментов. Этим путем, применяя йодацетат,

фториды и другие специфические ингибиторы, был расшифрован глико-

литический путь окислительно-восстановительных превращений глюкозы

до стадии образования молочной кислоты в мышечной ткани, насчиты-

вающий 11 стадий с участием 11 ферментов и 10 промежуточных ме-

таболитов.

С ингибированием ферментов связан механизм действия многих токси-

нов и ядов на организм. Известно, что при отравлениях солями сенильной

кислоты смерть наступает вследствие полного торможения и выключения

дыхательных ферментов (цитохромная система) тканей, особенно клеток

мозга. Токсическое влияние на организм человека и животных некоторых

инсектицидов обусловлено торможением активности холинэстеразы – фер-

мента, играющего ключевую роль в деятельности нервной системы.

Современная, так называемая рациональная, химиотерапия (направлен-

ное применение лекарственных препаратов в медицине) должна основы-

ваться на точном знании механизма действия лекарственных средств на

биосинтез ферментов, на активность уже синтезированных ферментов или

на регуляцию их активности в организме. Иногда для лечения некоторых

болезней используют избирательно действующие ингибиторы. Так, инги-

битор ряда протеиназ (трипсина, химотрипсина и калликреина) трасилол

широко применяется для лечения острого панкреатита – болезни, при ко-

торой уровень трипсина и химотрипсина в крови резко возрастает. Знание

избирательного ингибиторного действия некоторых природных и синте-

тических соединений (так называемых антиметаболитов) на ферменты

может служить методологической основой для разработки эффективных

методов синтеза химиотерапевтических препаратов. Этот путь открывает

широкие возможности для направленного воздействия на синтез ферментов

в организме и регуляции интенсивности метаболизма при патологии.

Типы ингибирования. Различают обратимое и необратимое ингибиро-

вание. Если ингибитор вызывает стойкие изменения пространственной

третичной структуры молекулы фермента или модификацию функциональ-

ных групп фермента, то такой тип ингибирования называется необрати-

мым. Чаще, однако, имеет место  о б р а т и м о е  и н г и б и р о в а н и е , под-

дающееся количественному изучению на основе уравнения Михаэлиса-

Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на кон-

курентное и неконкурентное в зависимости от того, удается или не удается

преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения кон-

центрации субстрата.

К о н к у р е н т н о е  и н г и б и р о в а н и е может быть вызвано веществами,

имеющими структуру, похожую на структуру субстрата, но несколько

отличающуюся от структуры истинного субстрата. Такое ингибирование

основано на связывании ингибитора с субстратсвязывающим (активным)

148