Биологическая химия - часть 33

Рис. 4.13. Кривая уравнения Михаэли-

са-Ментен: гиперболическая зависи-

мость начальных скоростей катализиру-

емой ферментом реакции от концентра-

ции субстрата.

В числителе представлены константы скоростей распада комплекса ES

в двух направлениях (в сторону исходных Е и S и в сторону конечных

продуктов реакции Е и Р). Отношение  k

– 1

/ k

+ 1

 представляет собой

константу диссоциации ферментсубстратного комплекса K

S

, тогда:

Отсюда вытекает важное следствие: константа Михаэлиса всегда больше

константы диссоциации фермент-субстратного комплекса K

S

 на величину

k

+ 2

/ k

+ 1

.

Для определения численного значения К

m

 обычно находят ту концент-

рацию субстрата, при которой скорость ферментативной реакции v состав-

ляет половину от максимальной V

max

, т.е. если v =

 1

/

2

 V

maх

. Подставляя

значение v в уравнение Бриггса–Холдейна, получаем:

разделив обе части уравнения на V

mах

, получим

или К

m

 + [S] = 2[S], откуда K

m

 = [S].

Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации

субстрата (моль/л), при которой скорость данной ферментативной реакции

составляет половину от максимальной *.

Определение величины К

m

 имеет важное значение при выяснении меха-

низма действия эффекторов на активность ферментов и т.д. Константу

Михаэлиса можно вычислить по графику (рис. 4.13). Отрезок на абсциссе,

соответствующий скорости, равной половине максимальной, будет пред-

ставлять собой К

m

.

Пользоваться графиком, построенным в прямых координатах зависи-

мости начальной скорости реакции v

0

 от начальной концентрации субстрата

[S

0

], неудобно, поскольку максимальная скорость V

max

 является в данном

случае асимптотической величиной и определяется недостаточно точно.

* Экспериментальные значения К

m

 для большинства ферментативных реакций с участием

одного субстрата обычно в пределах 10

– 2

–10

– 5

 М.

137

Рис. 4.14. График Лайнуивера-

Бэрка.

Для более удобного графического представления экспериментальных

данных Г. Лайнуивер и Д. Бэрк преобразовали уравнение Бриггса–Хол-

дейна по методу  д в о й н ы х  о б р а т н ы х  в е л и ч и н исходя из того прин-

ципа, что если существует равенство между двумя какими-либо величи-

нами, то и обратные величины также будут равны. В частности, если

то

или

то после преобразования получаем уравнение:

которое получило название  у р а в н е н и я  Л а й н у и в е р а – Б э р к а . Это урав-

нение прямой линии: у = ах + b. Если теперь в соответствии с этим

уравнением построить график в координатах 1/v (y) от l/[S] (x), то получим

прямую линию (рис. 4.14), тангенс угла наклона который будет равен

величине K

m

/V

max

; отрезок, отсекаемый прямой от оси ординат, пред-

ставляет собой l/V

max

 (обратная величина максимальной скорости). Если

продолжить прямую линию за ось ординат, тогда на абсциссе отсекается

отрезок, соответствующий обратной величине константы Михаэлиса – 1/К

m

(см. рис. 4.14). Таким образом, величину К

m

 можно вычислить из данных

наклона прямой и длины отрезка, отсекаемого от оси ординат, или из

длины отрезка, отсекаемого от оси абсцисс в области отрицательных

значений.

Следует подчеркнуть, что значения V

max

, как и величину К

m

, более точно,

чем по графику, построенному в прямых координатах, можно определить

по графику, построенному по методу двойных обратных величин. Поэтому

данный метод нашел широкое применение в современной энзимологии.

Предложены также аналогичные графические способы определения К

m

и V

max

 в координатах зависимости v от v/[S] и [S]/v от [S].

Следует отметить некоторые ограничения применения уравнения Ми-

хаэлиса–Ментен, обусловленные множественными формами ферментов

и аллостерической природой фермента. В этом случае график зависимости

начальной скорости реакции от концентрации субстрата (кинетическая

138

Наклон

Рис. 4.15. Сигмоидная кинети-
ческая кривая насыщения суб-
стратом.

кривая) имеет не гиперболическую форму, а сигмоидный характер (рис.

4.15) наподобие кривой насыщения гемоглобина кислородом. Это означает,

что связывание одной молекулы субстрата в одном каталитическом центре

повышает связывание субстрата с другим центром, т.е. имеет место

кооперативное взаимодействие, как и в случае присоединения кислорода

к 4 субъединицам гемоглобина. Для оценки концентрации субстрата, при

которой скорость реакции составляет половину максимальной, в условиях

сигмоидного характера кинетической кривой обычно применяют преобра-

зованное уравнение Хилла:

где К' – константа ассоциации; n – число субстратсвязывающих центров.

ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

К ферментам применимы три основных критерия, характерных и для

неорганических катализаторов. В частности, они остаются неизмененными

после реакции*, т.е. освобождаясь, могут вновь реагировать с новыми

молекулами субстрата (хотя нельзя исключить побочных влияний условий

среды на активность фермента). Ферменты способны оказывать действие

в ничтожно малых концентрациях (например, одна молекула фермента

реннина, содержащегося в слизистой оболочке желудка теленка, створажи-

вает около 10

6

 молекул казеиногена молока за 10 мин при температуре

37°С). Наличие либо отсутствие фермента или любого другого катализа-

тора не оказывает влияния на величину константы равновесия и свободной

энергии (ΔG). Катализаторы лишь повышают скорость, с которой система

приближается к термодинамическому равновесию, не сдвигая точки равно-

весия. Химические реакции с высокой константой равновесия и отрица-

тельной величиной ΔG принято называть  э к з е р г о н и ч е с к и м и . Реакции

с низкой константой равновесия и соответственно положительной величи-

ной ΔG (они обычно не протекают спонтанно) называются эндерго-

ническими. Для начала и завершения этих реакций необходим приток

* Доказано, что некоторые ферменты в процессе химической реакции подвергаются

модификации и даже распаду под действием конечных продуктов реакции, а не освобождаются

в неизмененном виде, как утверждал Л. Михаэлис; типичный пример – цитохромы класса Р450.

139

Рис. 4.16. Зависимость скорости
катализируемой ферментом реак-
ции от температуры.
а - повышение скорости реакции как

функция температуры; б - снижение ско-

рости реакции как функция денатура-

ции белка-фермента; стрелка указывает

оптимум температуры.

энергии извне. В живых системах экзергонические процессы обычно сопря-

жены с эндергоническими реакциями, обеспечивая последние необходимым

количеством энергии.

Ферменты, являясь белками, обладают рядом характерных для этого

класса органических соединений свойств, отличающихся от свойств неор-

ганических катализаторов.

Термолабильность ферментов. Скорость химических реакций зависит от

температуры, поэтому катализируемые ферментами реакции также чувст-

вительны к изменениям температуры. Установлено, что скорость боль-

шинства биохимических реакций повышается в 2 раза при повышении

температуры на 10°С и, наоборот, снижается в 2 раза при понижении

температуры на 10°С. Этот показатель получил название  т е м п е р а т у р -

н о г о  к о э ф ф и ц и е н т а . Однако вследствие белковой природы фермента

тепловая денатурация при повышении температуры будет снижать эффек-

тивную концентрацию фермента с соответствующим снижением скорости

реакции. Так, при температуре, не превышающей 45–50°С, скорость реак-

ции увеличивается согласно теории химической кинетики. При температуре

выше 50°С на скорость реакции большое влияние начинает оказывать

тепловая денатурация белка-фермента, приводящая к полному прекра-

щению ферментативного процесса (рис. 4.16).

Таким образом, термолабильность, или чувствительность к повышению

температуры, является одним из характерных свойств ферментов, резко

отличающих их от неорганических катализаторов. В присутствии последних

скорость реакции возрастает экспоненциально при повышении температуры

(см. кривую «а» на рис. 4.16). При температуре 100°С почти все ферменты

утрачивают свою активность (исключение составляет, очевидно, только

один фермент мышечной ткани – миокиназа, которая выдерживает нагре-

вание до 100°С). Оптимальной для действия большинства ферментов

теплокровных животных является температура 40°С; в этих условиях

скорость реакции оказывается максимальной вследствие увеличения кине-

тической энергии реагирующих молекул. При низких температурах (0°С

и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает

почти до нуля. Во всех случаях имеет значение время воздействия соот-

ветствующей температуры. В настоящее время для пепсина, трипсина

и ряда других ферментов доказано существование прямой зависимости

140