Биологическая химия - часть 34

Рис. 4.17. Зависимость скоро-

сти катализируемой ферментом

реакции от рН (стрелка указы-

вает оптимум рН).

между скоростью инактивации фермента и степенью денатурации белка.

Следует отметить, что на термолабильность ферментов определенное

влияние оказывает концентрация субстрата, рН среды и другие факторы.

Зависимость активности ферментов от рН среды. Ферменты обычно

наиболее активны в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов,

соответствующей для животных тканей в основном выработанным в про-

цессе эволюции физиологическим значениям рН среды 6,0–8,0. При гра-

фическом изображении на кривой колоколообразной формы имеется опре-

деленная точка, в которой фермент проявляет максимальную активность;

эту точку называют оптимумом рН среды для действия данного фермента

(рис. 4.17). При определении зависимости активности фермента от концент-

рации водородных ионов реакцию проводят при разных значениях рН

среды, обычно при оптимальной температуре и наличии достаточно высо-

ких (насыщающих) концентраций субстрата. В табл. 4.3 приводятся опти-

мальные значения рН среды для ряда ферментов.

Т а б л и ц а 4.3. Оптимальные значения рН для некоторых ферментов

Фермент

Пепсин

Катепсин В

Амилаза из солода

Сахараза кишечная

Амилаза слюны

рН

1,5–2,5

4,5–5,0

4,9–5,2

5,8–6,2

6,8–7,0

Фермент

Каталаза

Уреаза

Липаза

панкреатическая

Трипсин

Аргиназа

рН

6,8–7,0

7,0–7,2

7,0–8,5

7,5–8,5

9,5–10,0

Из данных табл. 4.3 видно, что рН-оптимум действия ферментов лежит

в пределах физиологических значений. Исключение составляют пепсин,

рН-оптимум которого 2,0 (при рН 6,0 он не активен и не стабилен).

Объясняется это, во-первых, структурной организацией молекулы фермента

и, во-вторых, тем, что пепсин является компонентом желудочного сока,

содержащего свободную соляную кислоту, которая создает оптимальную

кислую среду для действия этого фермента. С другой стороны, рН-оптимум

аргиназы лежит в сильнощелочной зоне (около 10,0); такой среды нет

в клетках печени, следовательно, in vivo аргиназа функционирует, по-ви-

димому, не в своей оптимальной зоне рН среды.

Согласно современным представлениям, влияние изменений рН среды

на молекулу фермента заключается в воздействии на состояние и степень

141

ионизации кислотных и основных групп (в частности, СООН-группы дикар-

боновых аминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гисти-

дина, NH

2

-группы лизина и др.). При резких сдвигах от оптимума рН среды

ферменты могут подвергаться конформационным изменениям, приводя-

щим к потере активности вследствие денатурации или изменения заряда

молекулы фермента. При разных значениях рН среды активный центр

может находиться в частично ионизированной или неионизированной

форме, что сказывается на третичной структуре белка и соответственно на

формировании активного фермент-субстратного комплекса. Имеет зна-

чение, кроме того, состояние ионизации субстратов и кофакторов.

Специфичность ферментов. Ферменты обладают высокой специфич-

ностью действия. Это свойство часто существенно отличает их от неорга-

нических катализаторов. Так, мелкоизмельченные платина и палладий

могут катализировать восстановление (с участием молекулярного водо-

рода) десятков тысяч химических соединений различной структуры. Высо-

кая специфичность ферментов обусловлена, как было отмечено, конфор-

мационной и электростатической комплементарностью между молекулами

субстрата и фермента и уникальной структурной организацией активного

центра, обеспечивающими «узнавание», высокое сродство и избиратель-

ность протекания одной какой-либо реакции из тысячи других химических

реакций, осуществляющихся одновременно в живых клетках.

В зависимости от механизма действия различают ферменты с отно-

с и т е л ь н о й (или  г р у п п о в о й ) и  а б с о л ю т н о й  с п е ц и ф и ч н о с т ь ю . Так,

для действия некоторых гидролитических ферментов наибольшее значение

имеет тип химической связи в молекуле субстрата. Например, пепсин

в одинаковой степени расщепляет белки животного и растительного проис-

хождения, несмотря на то что эти белки существенно отличаются друг от

друга как по химическому строению и аминокислотному составу, так и по

физико-химическим свойствам. Однако пепсин не расщепляет ни углеводы,

ни жиры. Объясняется это тем, что точкой приложения, местом действия

пепсина является пептидная —СО—NH-связь. Для действия липазы, ка-

тализирующей гидролиз жиров на глицерин и жирные кислоты, подобным

местом является сложноэфирная связь. Аналогичной групповой специфич-

ностью обладают трипсин, химотрипсин, пептидазы, ферменты, гидроли-

зующие α-гликозидные связи (но не β-гликозидные связи, имеющиеся

в целлюлозе) в полисахаридах, и др. Обычно эти ферменты участву-

ют в процессе пищеварения, и их групповая специфичность, вероятнее

всего, имеет определенный биологический смысл. Относительной специ-

фичностью наделены также некоторые внутриклеточные ферменты, на-

пример гексокиназа, катализирующая в присутствии АТФ фосфорилиро-

вание почти всех гексоз, хотя одновременно в клетках имеются и спе-

цифические для каждой гексозы ферменты, выполняющие такое же фос-

форилирование (см. главу 10).

Абсолютной специфичностью действия называют способность фермента

катализировать превращение только единственного субстрата. Любые из-

менения (модификации) в структуре субстрата делают его недоступным для

действия фермента. Примерами таких ферментов могут служить аргиназа,

расщепляющая в естественных условиях (в организме) аргинин, уреаза,

катализирующая распад мочевины, и др.

Имеются экспериментальные доказательства существования так назы-

ваемой  с т е р е о х и м и ч е с к о й  с п е ц и ф и ч н о с т и , обусловленной сущест-

вованием оптически изомерных L- и D-форм или геометрических (цис-

и транс-) изомеров химических веществ. Так, известны оксидазы L-

142

и D-аминокислот, хотя в природных белках обнаружены только L-ами-

нокислоты. Каждый из видов оксидаз действует только на свой спе-

цифический стереоизомер *.

Наглядным примером стереохимической специфичности является бак-

териальная аспартатдекарбоксилаза, катализирующая отщепление СО

2

только от L-аспарагиновой кислоты с превращением ее в L-аланин. Сте-

реоспецифичность проявляют ферменты, катализирующие и синтетические

реакции. Так, из аммиака и α-кетоглутарата во всех живых организмах

синтезируется L-изомер глутаминовой кислоты, входящей в состав при-

родных белков. Если какое-либо соединение существует в форме цис-

и транс-изомеров с различным расположением групп атомов вокруг двой-

ной связи, то, как правило, только один из этих геометрических изомеров

может служить в качестве субстрата для действия фермента. Например,

фумараза катализирует превращение только фумаровой кислоты (транс-

изомер), но не действует на малеиновую кислоту (цис-изомер):

Таким образом, благодаря высокой специфичности действия ферменты

обеспечивают протекание с большой скоростью лишь определенных хи-

мических реакций из огромного разнообразия возможных превращений

в микропространстве клеток и целостном организме, регулируя тем самым

интенсивность обмена веществ.

ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ

В этом разделе кратко рассмотрены общие факторы, в частности зави-

симость скорости ферментативной реакции от времени, влияние концент-

раций субстрата и фермента на скорость реакций, катализируемых фер-

ментами, и более подробно – вопросы об активировании и ингибировании

ферментов. Ранее была отмечена существенность для активности фермен-

тов таких факторов, как температура, рН, т.е. факторов, которые опре-

деляют в оптимальных условиях сохранность пространственной конфор-

мации молекулы фермента, когда она приобретает максимальную ак-

тивность.

Как известно, скорость любой химической реакции уменьшается со

* Имеется, однако, небольшая группа ферментов – рацемазы, катализирующие изменение

стерической конфигурации субстрата. Так, бактериальная аланин-рацемаза обратимо превра-

щает как L-, так и D-аланин в оптически неактивную смесь обоих изомеров – DL-аланин

(рацемат).

143

Фумаровая кислота

Малеиновая кислота

L-аминокислота

+

 1

/

2

О

2

Оксидаза L-аминокислот

α-Кетокислота + NH

3

 + Н

2

О;

D-аминокислота

+

 1

/

2

О

2

Оксидаза D-аминокислот

α-Кетокислота + NH

3

 + H

2

О.

Рис. 4.18. Зависимость скорости

ферментативной реакции от вре-

мени.

временем, однако кривая зависимости скорости ферментативных реакций

от времени не имеет обычно той общей формы, которая характерна для

гомогенных химических реакций (рис. 4.18). Такое снижение скорости

ферментативных реакций со временем может быть обусловлено тормо-

зящим действием продуктов реакции, уменьшением степени насыщения

фермента субстратом (поскольку по мере протекания реакции концентрация

субстрата снижается) или частичной инактивацией фермента при заданных

значениях температуры и рН среды. Следует учитывать, кроме того,

влияние скорости обратной реакции, которая может оказаться сущест-

венной по мере увеличения концентрации продуктов ферментативной реак-

ции. Учитывая эти обстоятельства, при исследовании скорости фермента-

тивных реакций в тканях и биологических жидкостях обычно определяют

н а ч а л ь н у ю  с к о р о с т ь  р е а к ц и и в условиях, когда скорость фермента-

тивной реакции приближается к линейной (в том числе при достаточно

высокой для насыщения фермента концентрации субстрата).

Влияние концентраций субстрата и фермента

на скорость ферментативной реакции

Из приведенного ранее материала вытекает важное заключение: одним из

наиболее существенных факторов, определяющих скорость ферментатив-

ной реакции, является концентрация субстрата (или субстратов) и продукта

(продуктов). При постоянной концентрации фермента скорость реакции

постепенно увеличивается, достигая определенного максимума (см. рис.

4.12, 4.13), когда дальнейшее увеличение количества субстрата практически

не оказывает влияния на скорость ферментативной реакции. В таких

случаях принято считать, что субстрат находится в избытке, а фермент

полностью насыщен, т.е. все молекулы фермента связаны с субстратом.

Ограничивающим скорость реакции фактором в последнем случае ста-

новится концентрация фермента. Именно при этих условиях определяют

величину максимальной скорости (V

max

) и значения константы Михаэлиса

(K

m

) (см. рис. 4.13; 4.14).

Скорость любой ферментативной реакции непосредственно зависит от

концентрации фермента (рис. 4.19). Существующая линейная зависимость

между этими величинами, когда скорость реакции прямо пропорциональна

количеству присутствующего фермента, справедлива только в определен-

ных условиях, например в начальный период ферментативной реакции, так

как в этот период практически не происходит обратной реакции, а концент-

рация продукта оказывается недостаточной для обратимости реакции.

Именно в этом случае скорость реакции (точнее, начальная скорость

реакции v) будет пропорциональна концентрации фермента. Как было

144

Количеств

о

 продукт

а

Время