Биологическая химия - часть 6

Ионообменная хроматография. Ионообменные смолы являются поли-

мерными органическими соединениями, содержащими функциональные

группы, способные вовлекаться в ионный обмен. Различают положительно

заряженные анионообменники, представленные органическими основания-

ми и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие

фенольные, сульфо- или карбоксильные группы. Из сильно- и слабооснов-

ных анионообменников чаще используют производные полистирола и цел-

люлозы, несущие функциональные группы:

Триметиламинополистирол

Диэтиламиноэтилцеллюлоза

(ДЭАЭ-целлюлоза)

Аналогичные функциональные группы содержат триэтиламиноэтил

(ТЭАЭ)- и аминоэтил (АЭ)-целлюлозы.

Катионообменники представлены сульфонированными полистиролами

(производные винилбензола или дивинилбензола) и карбоксиметилцеллю-

лозой, имеющими следующие функциональные группы:

В зависимости от заряда разделяемых белков используют подходящую

ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается

и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки

беспрепятственно элюируются с колонки. «Осажденные» на колонке белки

снимают с колонки, применяя более концентрированные солевые растворы

или изменяя рН элюента.

Новейшие методы ионообменной хроматографии, в частности высоко-

эффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), широко используются

в фармакологии (при создании и определении лекарственных веществ),

в клинической биохимии (при определении биологически активных веществ

в физиологических жидкостях), в биотехнологических процессах и произ-

водствах и других областях: они позволяют определять вещества в нано-,

пико- и фемтаграммных количествах.

Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана

аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия

белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными)

на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут

быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент),

антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. Благодаря высокой

специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носи-

телем (которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется

только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка

осуществляют элюированием буферными смесями с измененным рН или

29

измененной ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов,

ослабляющих связи между белками и лигандами. Несомненным достоинст-

вом метода является возможность одноэтапно выделить заданный белок

или другой биополимер высокой степени чистоты. При помощи аффинной

хроматографии, например, удалось сравнительно легко выделить очищен-

ные препараты аминоацил-тРНК-синтетаз на полиакрилгидразидагаровом

геле, к которому в качестве лигандов были присоединены определенные

тРНК (транспортные РНК).

Гель-хроматография. В препаративных целях, особенно при очистке

белков от примесей, широко используют метод молекулярных сит, или

гель-хроматографию. При обработке эпихлоргидрином полисахарида дек-

страна * образуются различной степени выраженности поперечные связи,

приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нераствори-

мых в воде и называемых сефадексами. Благодаря большому сродству

к воде зерна сильно набухают в водной среде с образованием геля, которым

заполняют хроматографическую колонку. Разделение веществ этим мето-

дом основано на том, что большие молекулы не проникают во внутреннюю

водную фазу геля, являющуюся стационарной, и остаются снаружи, дви-

гаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки; небольшие молекулы,

напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновесную

систему между подвижной и стационарной фазами, и соответственно

с меньшей скоростью двигаются вдоль колонки (рис. 1.5). Обычно момент

появления веществ в вытекающем из колонки с сефадексом элюенте

выражают формулой:

V = V

0

 + K•V

i

где V – объем элюирующей жидкости вещества с данным К, мл; V

0

 – свобод-

ный объем колонки или общий объем внешнего растворителя (вне зерен

геля), мл; V

i

 – объем растворителя внутри геля, мл; K – коэффициент распре-

деления для растворенного вещества между растворителем внутри зерен

геля и окружающим растворителем. Если анализируемую пробу, содержа-

щую одно растворенное вещество с К = 1 и второе с К = 0, внести

в колонку с сефадексом, то второе вещество появится в элюирующей

жидкости сразу после выхода из колонки V

0

, а первое – только после

выхода объема V

0

 + V

i

.

Поскольку молекулы белков, обладающие большими молекулярной

массой и размерами, не диффундируют внутрь зерен сефадекса, они

первыми вымываются из колонки после выхода свободного объема колон-

ки V

0

, в то время как все остальные вещества (включая низкомолекулярные

примеси) вымываются после выхода объема, равного V

0

 + К • V

i

.

Метод нашел широкое применение в препаративной энзимологии.

С помощью сефадекса можно разделить белки с разной молекулярной

массой.

Электрофорез. Метод свободного электрофореза, детально разработан-

ный лауреатом Нобелевской премии А. Тизелиусом, основан на различии

в скорости движения (подвижности) белков в электрическом поле, которая

* Декстран является полисахаридом, синтезируемым микроорганизмами. Сефадекс –

коммерческий препарат, свое название получил от начальных слогов трех слов: separation

(разделение), Pharmacia (наименование фармацевтической фирмы в Швеции), dextran (дек-

стран). Наряду с сефадексом для разделения белков и других биомолекул используют также

сефарозу, сефакрил, биогели, молселект, акрилекс и др.

30

Рис. 1.5. Гель-хроматография

на колонке с сефадексом (схема).

Большие светлые кружки с крести-

ками - зерна сефадекса; малые чер-

ные и красные кружки и треуголь-

ники - белки с различной молеку-

лярной массой; А - колонка в нача-

ле работы; Б, В, Г - колонка в раз-

личные периоды времени. На гра-

фике элюции четко видно разделе-

ние белковых компонентов.

определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН

и ионной силы раствора. В последнее время более широкое распространение

получили методы  з о н а л ь н о г о  э л е к т р о ф о р е з а белков на различных

носителях, в частности на твердых поддерживающих средах: гелях крахма-

ла и полиакриламида, целлюлозе. Преимущества их по сравнению с мето-

дом свободного электрофореза состоят в том, что исключается размывание

границы белок-растворитель в результате диффузии и конвекции, не

требуется налаживания сложной аппаратуры для определения положения

границы, а для анализа необходимо небольшое количество белка (подробно

эти методы и соответствующая аппаратура рассматриваются в практиче-

ских руководствах по биохимии).

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования бел-

ков (как и методов оценки гомогенности) является  д и с к - э л е к т р о ф о р е з

(от англ. discontinuous – прерывистый, перемежающийся) в полиакриламид-

ном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными

значениями рН и разной степени пористости гель. Следует отметить

высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при элект-

рофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего

6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле – 10, а в полиакрил-

амидном геле – до 18 разных белковых фракций.

Для выявления белков при электрофорезе в гелях их обрабатывают

одним из следующих красителей: бромфеноловым синим, амидо черным

10В, кислотным синим 83, кумасси бриллиантовым голубым R-250 и др.

Интенсивность окраски и соответственно относительное содержание каж-

дой белковой фракции обычно определяют денситометрически путем пря-

мого сканирования на денситометре. В последние годы стали применять

методы электрофореза белков с градиентом концентрации геля, что зна-

чительно повышает разрешающую способность, особенно при фракциони-

ровании белков с высокой молекулярной массой, превышающей 50000–

100000.

Весьма перспективными методами разделения белков (как и определе-

ния ряда физико-химических свойств) оказались разные варианты метода

и з о э л е к т р и ч е с к о г о  ф о к у с и р о в а н и я – изотахофореза, основанные на

проведении электрофореза в поддерживающих средах (на колонке или

в тонком слое) с градиентом рН. Точное местоположение на колонке

каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической

точки, т.е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд

белковой частицы при данном значении рН равен нулю. При использовании

31

Концентраци

я

А

Б

В

Г

мл

метода изоэлектрического фокусирования применяют смеси синтетических

полиаминополикарбоновых кислот (амфолины) для создания градиента рН

в диапазоне от 3,0 до 10,0.

В последние годы широкое распространение для фракционирования

белков получили различные сочетания изоэлектрофокусирования и диск-

электрофореза в полиакриламидном геле – методы двухмерного электрофо-

реза, которые позоляют параллельно анализировать сотни и даже тысячи

белковых фракций.

Очистка белков от низкомолекулярных примесей

Применение в определенной последовательности ряда перечисленных мето-

дов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный,

однако, некоторых примесей солей. Для полного освобождения белков от

низкомолекулярных примесей в настоящее время используют методы

диализа, гельхроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации. При диа-

лизе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная

пленка), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. Белки, как

правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомо-

лекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.

Метод кристаллизации белков основан на достижении критической

точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при мед-

ленном повышении температуры. Уже получены сотни кристаллических

белков *. Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным,

поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония

могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки.

Наилучшие результаты при освобождении белков от низкомолекуляр-

ных примесей получают с помощью гельхроматографии и ультрафильтра-

ции. Последняя основана на продавливании растворов белка через спе-

циальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не

только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но

и концентрировать их.

Определение гомогенности белков

На заключительном этапе выделения и очистки белков исследователя

всегда интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя

оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-

либо физико-химическому показателю. Для этого пользуются разными

критериями. Из огромного числа хроматографических, электрофоретиче-

ских, химических, радио- и иммунохимических, биологических и гравита-

ционных методов наиболее достоверные результаты при определении

гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности

сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле,

изоэлектрическое фокусирование, иммунохимические методы и определение

растворимости белка. Действительно, если при гель-электрофорезе белок

движется в виде одной узкой полосы и в этой зоне сосредоточена его

биологическая активность (ферментативная, гормональная, токсическая

* Первый кристаллический фермент уреаза был получен Д. Самнером в 1926 г.

32