Биологическая химия - часть 5

Рис. 1.1. Лабораторное оборудование.
а – пестиковый ручной гомогенизатор: 1 – пестик, 2 – корпус, 3 – мотор, 4 – штатив; механиче-

ский гомогенизатор (б) и шаровая мельница (в): 1 – корпус с электродвигателем и пусковым

устройством, 2 – камера для измельчения материала.

Следует, однако, иметь в виду, что детергенты, вызывая разрыв белок-

белковых связей, разрушают олигомерную (четвертичную) структуру бел-

ков.

Фракционирование и очистка белков

После достижения полной экстракции белков, т.е. перевода белков в раст-

воренное состояние, приступают к разделению – фракционированию смеси

белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные

методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими

растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфаз-

ных системах, кристаллизацию и др.

Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что

приводит к образованию вокруг белковой глобулы водных (гидратных)

оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в прост-

ранстве молекул воды. По химическим и физическим свойствам вода,

входящая в состав гидратной оболочки, отличается от чистого растворите-

ля. В частности, температура замерзания ее составляет –40°С. В этой воде

хуже растворяются сахара, соли и другие вещества. Растворы белков отли-

чаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факто-

ров, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому

при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт,

ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных метал-

лов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение

и др.) наблюдаются дегидратация молекул белка и их выпадение в осадок.

Высаливание. При добавлении растворов солей щелочных и щелочнозе-

мельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно

белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления

солей методами диализа или гельхроматографии. Высаливанием белков

обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки

крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимо-

логии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или

выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из

растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата

аммония. Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для

разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбу-

минов (выпадают при 100% насыщении).

На величину высаливания белков оказывают влияние не только природа

и концентрация соли, но и рН среды и температура. Считают, что главную

роль при этом играет валентность ионов. Действие разных ионов принято

сравнивать не по молярной концентрации соли, а по так называемой

и о н н о й силе (μ), которая равна половине суммы произведений концент-

рации каждого иона (с) на квадрат его валентности (V):

Более тонкое разделение белков плазмы крови человека на фракции

достигается при использовании различных концентраций этанола при

низкой температуре (от –3 до –5°С) по методу Кона (рис. 1.2). В этих

условиях белки сохраняют свои нативные свойства. Указанным методом

часто пользуются для получения отдельных фракций крови, используемых

в качестве кровезаменителей.

Рис. 1.2. Диаграмма фракциониро-
вания белков плазмы крови чело-
века этанолом (по методу Кона).

В последнее время наибольшее распространение получили хроматогра-

фические и электрофоретические методы разделения белков.

Хроматография. Принцип хроматографии, разработанный в 1903 г. рус-

ским ученым М. С. Цветом, основан на способности пигментов (или любых

других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбировать-

ся на адсорбенте, заключенном в колонке *.

В результате происходит разделение анализируемых веществ и их

концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через

колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силы ад-

сорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние

последовательно собирают в коллекторе фракций (принцип сорбции-де-

сорбции).

Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белков из

смеси оказалась колоночная хроматография с гидроксилапатитом, различ-

ными ионообменными смолами и производными целллюлозы в качестве

носителей. При выделении и очистке белков используют четыре основных

типа хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную

и аффинную (хроматография по сродству) – в соответствии с разными

физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из

них. Хроматография широко применяется не только для выделения белков,

но и для разделения множества других органических и неорганических

веществ, входящих в состав живых организмов.

Адсорбционная хроматография. Разделение компонентов смеси (образ-

ца) основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте.

В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель

фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния. Адсорбент в виде

суспензии с растворителем (чаще всего буферным раствором) вносят

в стеклянную вертикальную трубку (колонку) и равномерно в ней упаковы-

вают. Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку –

* Это выдающееся открытие русского ученого было достойно оценено мировой научной

общественностью. Вот, например, что писал в 1948 г. швейцарский ученый П. Каррер:

«Никакое другое открытие не оказало такого огромного влияния и так не расширило

возможности исследования химика-органика, как хроматографический анализ Цвета. Исследо-

вания в области витаминов и гормонов, каротиноидов и многочисленных других природных

соединений никогда не могли бы развиться так быстро и дать такие большие результаты, если

бы они не были основаны на новом методе, который позволил установить факт наличия

в природе разнообразия родственных соединений».

Белки

плазмы

А л ь б у м и н ы

Рис. 1.3. Абсорбционная хромато-

графия (схема). Разделение двух

разных веществ (А и В), переме-

щающихся по колонке с разной

скоростью.

1 - нанесение образца на колонку; 2 -

середина опыта; 3 - окончание опыта.

компоненты разделяемой смеси адсорбируются на адсорбенте. Затем при-

ступают к стадии освобождения – десорбции компонентов из колонки,

применяя подходящие элюенты (рис. 1.3). Сбор фракций осуществляют при

помощи автоматического коллектора фракций.

Распределительная хроматография. В отличие от адсорбционной твер-

дая фаза служит только опорой (основой) для стационарной жидкой фазы.

Один из типов распределительной хроматографии, как и адсорбционная,

осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы

применяют влажный крахмал или силикагель. Образец растворяют в под-

ходящем растворителе, затем наносят на колонку; разделяемые вещества,

подвергающиеся многократному распределению между неподвижной ста-

ционарной фазой (водный слой) и движущейся фазой органического раст-

ворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки. Собранные

при помощи коллектора фракции пробы, содержащие одно вещество,

соединяют для выделения этого вещества в чистом виде.

Разновидностью распределительной хроматографии является хромато-

графия на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях,

в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот и других

веществ (рис. 1.4). В качестве стационарной фазы при этом служит вода,

адсорбированная целлюлозными цепями фильтровальной бумаги. Образец

помещают на одном конце бумажной полосы, этим же концом бумагу

погружают в подходящую смесь органических растворителей (например,

бутанол–уксусная кислота–вода в определенных соотношениях). При дви-

жении растворителя по бумаге благодаря силе капиллярности происходит

разделение компонентов смеси. Проявленную хроматограмму высушива-

ют, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют хими-

ческими или физико-химическими методами.

Рис. 1.4. Хроматография на бума-

ге (схема).

А – восходящая хроматография; Б – ни-

сходящая хроматография (вид сбоку);

В – хроматограмма с разделенными и

окрашенными веществами: 1 – фронт

растворителя, 2 – разделенные вещест-

ва, 3 – место нанесения образца.

Элюент

Смесь

А и В

Аl

А-

содержание .. 3 4 5 6 ..