РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА. Курс лекций - часть 5

уровне активности белка. Эта регуляция

осуществляется тремя белками, SpoIIE,

SpoIIAB и SpoIIAA. Как и σF, эти белки

синтезируются в исходной клетке еще до ее

полярного деления. SpoIIAB является анти-

сигма фактором, который связывается с σF и

ингибирует транскрипцию с его участием.

SpoIIAA - анти-анти сигма фактор, который

противодействует

эффекту

SpoIIAB,

связываясь с комплексом SpoIIAB.σF и

вызывая освобождение активного σF. SpoIIAB

является также киназой, фосфорилирующей

SpoIIAA, предотвращая его связывание с

собой. Таким образом, до образования септы

σF находится в комплексе с SpoIIAB, то есть

Рис.11.3. Активация σE и σK в материнской клетке

является инактивированным, а SpoIIAA

фосфорилирован и поэтому не может

освободить σF. После образования перегородки в действие вступает еще один фермент, SpoIIE,

являющийся фосфатазой, специфически дефосфорилирующей SpoIIAA~P. SpoIIE является

интегральным мембранным белком, локализованным в перегородке между двумя компартментами.

Белок приблизительно одинаково экспонируется в обе стороны от перегородки, в связи с чем можно

ожидать, что дефосфорилирование SpoIIAA~P будет идти с одинаковой скоростью в обоих

компартментах. Но поскольку объем преспоры в

5-7 раз меньше объема материнской клетки,

концентрация дефосфорилированого SpoIIAA в преспоре будет в несколько раз выше, следовательно, в

этом компартменте σF будет активирован раньше (Рис. 11.2).

Вскоре после активации σF в преспоровом компартменте происходит активация другого сигма-

фактора, σЕ , но теперь уже в материнской клетке (Рис. 11.3а). Так же, как и σF, σЕ присутствует в

обоих компартментах спорангия. Этот сигма-фактор необычен тем, что синтезируется в форме

неактивного предшественника, пре-σЕ. Синтез пре-σЕ начинается до полярного деления путем индукции

транскрипции оперона spoIIG уже знакомым вам активатором

транскрипции Spo0A~P. Собственно пре-σЕ кодируется вторым

геном оперона, spoIIGB, а первый ген, spoIIGA , необходим для

процессинга пре-σЕ в зрелый белок. Продукт еще одного гена,

spoIIR, необходим для процессинга пре-σЕ, и транскрипция

этого гена зависит от σF. Таким образом, появление σЕ в

материнской клетке привязано к отделению преспоры

перегородкой, поскольку транскрипция зависимых от σF генов

происходит только в преспоровом компартменте.

(SpoIIR

должен активировать σЕ и в преспоре, но здесь σЕ по

неизвестной причине очень быстро деградирует.)

Что же контролируют два новых сигма-фактора? В σЕ

регулон входят гены, разрушающие пептидогликан септы,

отделяющей преспору от материнской клетки, а гены,

контролируемые σF, отвечают за обволакивание преспоры

материнской клеткой. К моменту окончания поглощения

преспоры материнской клеткой в преспоре начинается

транскрипция нового гена, spoIIIG, кодирующего еще один

сигма-фактор, σG. Этот сигма-фактор активирует транскрипцию

поздних генов преспоры, необходимых для завершения процесса

Рис.11.4. Последовательная

споруляции. Промотор, с которого считывается σG, опознается

активация сигма-факторов при

ранним преспоровым сигма-фактором σF, но для его активации

споруляции

необходим неизвестный пока фактор, транскрибируемый с σЕ

промотора материнской клетки.

- 65 -

(SpoVT и самые поздние преспоровые гены)

Экспрессия поздних генов в материнской клетке находится под контролем сигма-фактора σK (Рис.

11.3b). Как и ранний сигма-фактор материнской клетки, σЕ, σK синтезируется в виде неактивного

предшественника пре-σK, который превращается в активную форму после протеолитического

отщепления амино-концевой последовательности из 20 АК остатков. Протеолитическое расщепление

пре-σK осуществляется одним из членов σЕ регулона, SpoIVFA, для активации которого необходим

продукт гена spoIVB, транскрибируемого с σG промотора в преспоровом компартменте.

Экспрессия двух сигма-факторов в материнской клетке запускает последовательную цепь

регуляторных событий, ведущую к поочередной активации и инактивации комплекса генов,

результатом работы которого является синтез споровых покровов, кортекса и внешней оболочки споры

(Рис 11.4).

1. R. Losick

2. M. Perego. Kinase-phosphatase competition regulates Bacillus subtilis development. Trends in

Microbiology. 1998. 6:366-370

Хороший обзор начальных стадий регуляции споруляции с упором на роль фосфотрансляционной

системы.

12. Межклеточные коммуникации. Quorum sensing

Дабы преуспеть, бактерии должны быть приспособлены к выживанию и существованию в

сложных микробных сообществах. Взаимодействия между микроорганизмами в таких сообществах,

равно как и между патогенными микроорганизмами и их хозяевами зависят от экспрессии

специфических генов, участвующих в этих взаимодействиях. Не удивительно, что бактерии выработали

механизмы детекции конкурентов и растительных либо животных хозяев и системы "быстрого

реагирования" на подобные контакты. Во многих случаях экспрессия определенного набора генов будет

зависеть от достижения бактериальной популяцией определенной плотности. Например, путем

задержки экспрессии факторов вирулентности до тех пор, пока не будет достигнута высокая плотность

популяции, патогены растений могут избегать защитной реакции своих хозяев.

У животных и растений проникающие через мембрану сигнальные молекулы, такие как

стероидные и брассиностероидные гормоны, метилжасминат и др., являются хорошо изученными

регуляторами развития, дифференциации клеток и метаболизма в целом. В последние годы у бактерий

тоже были обнаружены сигнальные молекулы такого рода

- ацилированные производные

гомосеринлактона (АГСЛ), участвующие в межклеточной коммуникации. Бактерии используют эти

молекулы прежде всего для того, чтобы следить за плотностью своей популяции. Этот феномен

получил название "Quorum sensing" (чувство кворума). Каждая клетка в популяции продуцирует низкий

базальный уровень свободно диффундирующего АГСЛ за счет активности специфического фермента,

АГСЛ синтетазы, как правило, члена LuxI-семейства белков. С возрастанием плотности бактериальной

популяции концентрация АГСЛ также возрастает. При достаточно высокой плотности, т.е. по

достижении кворума, накопленный АГСЛ взаимодействует с рецепторным белком, обычно с членом

LuxR-семейства белков-регуляторов транскрипции, которые изменяют уровень экспрессии АГСЛ-

зависимых генов. У различных бактерий принцип действия АГСЛ-зависимой регуляции сохраняется,

хотя набор регулируемых генов может быть совершенно разным. Первой (в 1970 г.) была описана

АГСЛ-сенсорная система морской бактерии Vibrio fisheri, где "чувство кворума" регулирует экспрессию

генов биолюминесценции (lux). У других бактерий тот же механизм регулирует экспрессию генов

вирулентности

(Pseudomonas aeruginosa, Erwinia carotovora), конъюгационного переноса Т-ДНК

(Agrobacterium tumefaciens), подвижность

(Serratia liquefaciens), продукцию антибиотиков

(Erwinia

carotovora) и др (Рис. 12.1).

Когда бактерии Vibrio fisheri колонизируют специальные органы некоторых видов рыб и

кальмаров, они начинают светиться в результате активации lux-оперона, кодирующего фермент -

- 66 -

Рис.12.1 Автоиндукторы грамотрицательных бактерий

люциферазу, непосредственно производящий свечение, и ряд ферментов, определяющих синтез

субстрата для люциферазы - алифатического альдегида, энергия окисления которого и расходуется на

свечение. Продукт гена luxI кодирует синтез АГСЛ, в данном случае N-(3-оксогексаноил)-L-

гомосеринлактона. Это вещество способно свободно диффундировать во внешнюю среду через

бактериальные мембраны. Во время периода несимбиотической жизни Vibrio fisheri в морской воде

АГСЛ в результате такой диффузии не накапливается в клетке и бактерия не тратит энергию на

свечение. С другой стороны, при быстром росте в богатой среде световых органов хозяина, где

плотность клеток бактерий достигает 1010 на миллилитр, АГСЛ накапливается в бактериальных клетках,

приводя к индукции люциферазного оперона.

Самой по себе аккумуляции АГСЛ в клетке недостаточно для активации экспрессии

люциферазных генов. Еще один ген, luxR, кодирует транскрипционный активатор, который

взаимодействует с АГСЛ. Этот белок имеет два четко выраженных домена. Карбокси-концевой

содержит HTH мотив, отвечающий за связывание белка с ДНК в специфических симметричных

участках, называемых lux-боксами. Эти короткие (20 н.п.) последовательности были идентифицированы

в промоторных областях многих генов, регулируемых АГСЛ. Амино-концевой домен LuxR

взаимодействует с АГСЛ. Предполагается, что в отсутствие АГСЛ C-концевой ДНК-связывающий

домен экранируется N-концевым доменом, что предотвращает связывание с ДНК. Связывание АГСЛ N-

концевым доменом вызывает конформационное изменение, позволяющее амино-концевому домену

LuxR связаться с lux-боксами и активировать транскрипцию.

Интересно, что не все LuxR-подобные белки являются активаторами транскрипции. Белки EsaR и

ExpR, продуцируемые растительными патогенами Pantoea stewartii и Erwinia carotovora, являются

репрессорами. Для этих белков связывание АГСЛ снижает их аффинность к lux-боксам. Тогда как

большинство LuxR-подобных активаторов связывается с lux-боксами, перекрывающимися с

-35

областью промотора, EsaR связывается в области -10, что, естественно, предотвратит инициацию

транскрипции.

Синтез АГСЛ.

АГСЛ имеют общую структуру алифатической цепочки различной длины, присоединенной через

амидную связь к лактонизированному остатку гомосерина.

- 67 -

Рис.12.2. Ситез АГСЛ и механизм его действия

LuxI катализирует связывание S-аденозилметионина

(SAM) с жирнокислотной цепочкой,

синтезированной при участии ацил-ацил переносящего белка (ACP). Последующая за образованием

амидной связи лактонизация S-аденозилметионина приводит к образованию кольца, освобождению

АГСЛ и образованию побочного продукта - 5-метилтиоаденозина (MTA).

Регуляция синтеза экзоферментов у

Erwinia

Фитопатогенные

бактерии

Erwinia

carotovora продуцируют довольно широкий

спектр

гидролитических

ферментов,

деградирующих клеточные стенки растений. К

таким ферментам относятся пектатлиазы,

целлюлазы, полигалактуроназы и протеазы.

Развитие этого патогена в растениях ведет к

индукции этих ферментов, результатом чего

является мацерация растительных тканей и

развитие симптомов мягкой гнили. Продукция

внеклеточных ферментов зависит от накопления

N-3-оксогексаноил-L-гомосерин лактона, синтез

которого детерминируется гомологами LuxI,

которые у разных штаммов называются ExpI,

CarI и HslI. Рядом с геном expI находится expR -

гомолог luxR. Мутанты по гену expI имеют

Рис.12.3. Регуляция синтеза факторов

сниженную, а по гену expR

- повышенную

вирулентности Erwinia посредством АГСЛ

продукцию экзоферментов.

- 68 -

Кроме того, некоторые штаммы Erwinia carotovora продуцируют β-лактамные антибиотики

широкого спектра действия

- карбапенемы. Синтез карбапенемов координирован с экспрессией

экзоферментов и может служить для ингибирования других бактерий при конкуренции за питательные

вещества, высвобождающиеся при мацерации растительных тканей. Синтез карбапенемов

контролируется парой белков CarR и CarI, гомологичных, но не идентичных по своим функциям ExpR и

ExpI. CarR и ExpR не взаимозаменяемы, но АГСЛ, продуцируемый CarI, идентичен таковому ExpI.

Продукция экзоферментов у Erwinia контролируется дополнительно еще несколькими регуляторными

системами.

Роль АГСЛ-сигналов в экологии бактериальных популяций. Кросс-сигналы

(и ингибирование

антибиотиками).

Рассмотренный нами только что способ коммуникаций между бактериальными клетками за счет

секретируемых небольших молекул-феромонов достаточно широко распространен в природе, но далеко

не всегда молекулярные механизмы, лежащие в его основе, аналогичны только что описанным.

Например, грамположительные бактерии вместо АГСЛ используют короткие пептиды в качестве

феромонов. Будучи пептидами, эти молекулы не могут свободно проникать через мембраны и поэтому

активно секретируются из бактериальной клетки, используя мембранные транспортеры ABC-класса.

Пептидные сигналы, естественно, не могут также проникнуть и внутрь клетки-мишени, а посему

распознаются снаружи типичной сенсор-киназой, передающей сигнал

(в виде фосфогруппы)

внутриклеточным регуляторам. Таким образом регулируются компетентность и споруляция у Bacillus

subtilis, вирулентность у Staphylococcus aureus, конъюгация у Enterococcus faecalis и продукция

микроцина у Lactobacillus sake.

Литература:

1. C. Fuqua, M.R. Parsek and E.P. Greenberg. Regulation of gene expression by cell-to-cell

communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing. Annu. Rev. Genet. 2001. 35:439-68

13. Секреция белков

Около 20% всех белков, продуцируемых бактериями, локализованы вне цитоплазмы.

Секреция белков за пределы цитоплазмы является важнейшей способностью вирулентных

бактерий, поскольку большинство стадий процесса инфекции представляет собой ту или иную форму

взаимодействия с внешней средой, и многие белковые продукты должны либо располагаться на

внешней поверхности бактерии либо секретироваться во внешнюю среду. Кроме того, секреция белков

имеет важнейшее значение для биотехнологии, поскольку очистка белков из культуральной среды

простого состава значительно проще, чем из клеточных лизатов, являющихся сложной смесью

большого числа различных веществ. В связи с таким значением секреции этот процесс интенсивно

изучается. Одним из непредвиденных результатов такого изучения стало обнаружение нескольких

путей экспорта белков. Анализ родственных связей между белками, входящими в состав различных

систем секреции у разных организмов позволил разбить эти системы на несколько групп, внутри

которых механизм секреции идентичен или очень схож. Сейчас выделяют пять основных типа

секреции, которые мы по очереди и разберем. Интересно, что компоненты секреции трех из пяти типов

секреторных систем имеют значительное сходство с белками, участвующими в сборке жгутиков и

ворсинок (пилей).

К сожалению, иногда в литературе по секреции не очень четко используются термины, в связи с

чем не всегда понятно, о каком типе транспорта через мембраны идет речь. Поэтому здесь мы будем

пользоваться следующими терминами для дифференциации основных секреторных путей по месту

назначения транспортируемого белка:

• секреция - транспорт белка в окружающую среду. В случае грамотрицательных бактерий для этого

белку необходимо преодолеть две мембраны - цитоплазматическую и внешнюю.

- 69 -

• экспорт - выведение белка за пределы цитоплазмы. Термин используется исключительно для

грамотрицательных бактерий. Результатом экспорта является транспорт белка в периплазматическое

пространство.

• транслокация - доставка белка патогенными бактериями в эукариотическую клетку хозяина. В

случае грамотрицательных бактерий этот тип транспорта требует преодоления уже трех

мембранных барьеров - двух бактериальных и одного эукариотического.

Важной проблемой секреции является направление секретируемого белка к месту его назначения.

Секретируемые белки могут оказываться в различных местах:

• быть полностью встроенными в цитоплазматическую мембрану (интегральные мембранные белки,

каковыми является большинство мембранных транспортеров);

• быть "заякоренными" в цитоплазматической мембране при помощи трансмембранного

гидрофобного сегмента

(практически всегда N-концевого), к этому классу принадлежит

большинство периплазматических белков;

• полностью находиться в периплазме;

• быть полностью встроенными во внешнюю мембрану (порины);

• заякориваться во внешней мембране так, что основная масса белка располагается либо снаружи

(чаще всего) либо в периплазматическом пространстве;

• во внешней среде

(собственно секретируемые белки, к которым принадлежит большинство

гидролитических ферментов патогенов);

• ассоциированными с мембраной эукариотической клетки

(некоторые компоненты аппарата

секреции III типа)

• внутри другой клетки, как правило эукариотической (большинство субстратов секреции III и IV

типов)

И во всех этих случаях место конечной дислокации белка определяется его аминокислотной

последовательностью

- секреторные системы распознают определенные консервативные

последовательности (мотивы) и направляют секретируемый белок в соответствии с записанной в этих

мотивах информацией. Типичным примером того, как сложно бывает клетке определить назначение

белка, является транспорт через внутреннюю мембрану интегральных мембранных белков и субстратов

Sec-системы (части аппарата секреции II типа).

Для обоих классов белков сигналом их локализации являются довольно протяженные участки

гидрофобных аминокислот

(порядка

20 АК остатков). Такие участки, принимая α-спиральную

конформацию, способны легко встраиваться в липидный бислой (поскольку на наружной поверхности

такой спирали располагаются исключительно гидрофобные боковые группировки, а длина спирали как

раз соответствует толщине липидного бислоя). Судьба белка будет зависеть от того, с каким из

секреторных шаперонов

- белком SecB

(о котором мы поговорим чуть позже) или

рибонуклеопротеидным комплексом SRP - провзаимодействует секретируемый белок.

Бактериальная "частица, распознащая сигналы"

(signal recognition particle, SRP) является

упрощенным аналогом эукариотической частицы с таким же названием. В клетках млекопитающих все

секретируемые белки направляются в эндоплазматический ретикулум при помощи одного механизма,

основой которого и является SRP. Эукариотическая SRP - крупный рибонуклеопротеидный комплекс,

состоящий из

6 полипептидов и молекулы РНК длиной

300 рибонулеотидов. Сначала

54 kDa

субъединица SPR (SRP54) узнает специфические гидрофобные сигналы сразу после того, как они

выходят с транслирующей рибосомы. Такими сигналами являются либо N-концевые отрезаемые

сигнальные последовательности либо первый трансмембранный сегмент. Как только SPR свяжется с

сигналом локализации, комплекс рибосома-мРНК-полипептид мигрирует к эндоплазматическому

ретикулуму, где взаимодействие между SPR и гетеродимером рецептора SPR (SR) катализирует

высвобожбение синтезирующегося полипептида из комплекса и его инсерцию в транслокационный

канал.

У прокариот интегральные мембранные и прочие секретируемые белки движутся к внутренней

мембране по различным путям. Интегральные мембранные белки направляются к внутренней мембране

при помощи бактериального варианта SPR. У бактерий SRP состоит всего из двух компонентов: белка

Ffh - гомолога SPR54 и более короткой (около 100 нуклеотидов) РНК (4.5S РНК), а SR (рецептор SRP)

- 70 -

состоит только из гомолога α-субъединицы эукариотического SR

- белка FtsY. Несмотря на

существенные структурные отличия, биохимические свойства бактериальной SRP сходны с

эукариотическим аналогом. Как и у эукариот, SRP из E. coli котрансляционно распознает

трансмембранные сегменты как секреторные маркеры. С другой стороны, многие секретируемые белки

направляются к аппарату секреции молекулярными шаперонами, такими как DnaK или (чаще) SecB.

Первая стадия реакции требует присутствия специфичных для секреции шаперонов - SecB и

рибонуклеотидного комплекса называемого signal recognition particle (SRP), который состоит из белка

Ffh и 4.5S РНК.

SecB и SRP узнают каждый свою часть секретируемых белков. Функция SRP наиболее

существенна при экспорте интегральных мембранных белков. Самые последние экспериментальные

данные свидетельствуют в пользу того, что для транспорта интегральных мембранных белков (не

имеющих протяженных цитоплазматических или периплазматических петель) достаточно только SRP

(вместе с ее рецептором SR), а ни один из Sec белков не нужен.

Выбор SRP или SecA/SecB пути происходит "на выходе" синтезирующейся белковой цепи из

рибосомы. Бактериальная SRP селективно распознает белки внутренней мембраны по их протяженным

трансмембранным сегментам. А сходное взаимодействие SRP с менее гидрофобными и более

короткими сигнальными последовательностями секретируемых белков, возможно, предотвращается

ассоциированным с рибосомами шапероном триггерным фактором, который сильно связывается с

цитоплазматическими и секретируемыми белками, но не взаимодействует с белками внутренней

мембраны. Секреторные шапероны успешно распознают более короткие и менее гидрофобные

трансмембранные сегменты сигнальных пептидов и направляют содержащий их белок к секреторному

аппарату.

Основная проблема, решаемая всеми секреторными системами - обеспечить прохождение через

гидрофобную мембрану длинной полипептидной цепи, содержашей значительные гидрофильные

участки, и к тому же в нативном состоянии свертутой в громоздкую структуру. Именно поэтому,

несмотря на то, что транспорт идет по градиенту концентрации, все секреторные системы расходуют

энергию АТФ - на решение конформационных проблем. В решении конформационных проблем также

участвует особый класс белков - секреторные шапероны. От уже изветных вам шаперонов GroE/DnaK

секреторные отличаются участием исключительно в процессе секреции, и их функцией является

задержка фолдинга секретируемых белков. Большинство секретируемых белков являются

глобулярными и в полностью свернутом виде они просто не в состоянии преодолеть мембрану.

Секреторные шапероны, как правило, связываются с предназначенным для секреции белком сразу же

после его схода с рибосомы и не дают ему принять окончательную конформацию. Секреторный

шаперон фактически доставляет белок с рибосомы к секреторному аппарату. Кроме того, для

"разворачивания" (денатурации) белка, которая понадобилась бы, не будь секреторных шаперонов,

необходима энергия, и секреторные шапероны ее экономят. Наконец, в некоторых случаях секреторные

шапероны определяют специфичность секреторного аппарата. Так, в случае системы секреции III типа

многие ее субстраты опознаются не сами по себе, а по шаперону, с которым они связаны. Очевидно, что

в таком случае шапероны должны обладать высокой специфичностью. И действительно, для

секреторных шаперонов аппарата секреции III типа субстратом является один, реже два белка. И в

случае других секреторных шаперонов им в целом характерна большая избирательность по отношению

к субстрату по сравнению с шаперонами HSP60/HSP70.

Интересно заметить, что эукариоты не имеют секреторных шаперонов по той простой причине,

что секреция белка у них сопряжена с трансляцией - синтезируемая белковая цепь сразу, не успев

принять свою нативную конформацию, попадает в секреторный канал. Прокариоты не могут

воспользоваться таким механизмом, поскольку у них рибосомы присутствуют в огромном избытке по

отношению к мембранным транслоказам (у эукариот такого избытка нет из-за гораздо большей

поверхности эндоплазматического ретикулума) и сопряжение секреции с трансляцией привело бы к

существенному снижению скорости синтеза белка.

Секреторный аппарат первого типа.

Белки, секретируемые по первому пути, не имеют сигнальных пептидов и не используют т.н.

общий секреторный путь (GSP), зависимый от sec генов. Эти белки в процессе секреции полностью

- 71 -

минуют периплазму и секретируются непосредственно

во внешнюю среду. Секреторный аппарат первого типа

устроен относительно просто. Во всех случаях он

состоит из трех белков. Первый принадлежит к классу

АТФаз, называемых ABC транспортерами и

обеспечивает энергозависимые стадии процесса

транспорта. Этот белок является цитоплазматическим и

ассоциированным с димерным белком, обеспечивающим

слияние цитоплазматической и наружной мембраны и

фактически образующим канал, через который и

транспортируется секретируемый белок. И третий белок-

швейцар (gatekeeper) локализован во внешней мембране.

Его функция

- запирать мембранный канал, когда

субстрат отсутствует.

Как правило, гены, кодирующие все три

компонента секреторного аппарата, организованы в

оперон, обычно вместе с геном (генами), кодирующим

секретируемый белок. Секреторный

Специфичность

Несколько систем в одной бактерии.

Субстраты

Сигнал для секреции через аппарат

1-го типа

располагается в их C-конце, обычно в пределах

последних

60 АК. Секреторный аппарат опознает

характерную последовательность вторичной структуры -

Рис.13.1. Секреторный аппарат I типа

две альфа-спирали, соединенные между собой гибким

линкером.

Секреторный аппарат второго типа (GSP).

Из всех систем секреции только эта, а точнее, ее часть, ответственная за экспорт белков

в

периплазму - Sec система,

- является необходимой для жизнеспособности клетки; гомологичные

экспортные системы были найдены у архей и эукариот. Через секреторный аппарат II типа

транспортируются разнообразные белки, такие как пектатлиазы, полигалактуроназы,

пектинметилэстеразы и целлюлазы у эрвиний

(по нескольку изоферментов каждого класса);

полигалактуроназа, целлюлаза, протеаза и амилаза у Xanthomonas campestris; липаза, фосфолипаза,

эластаза, энтеротоксин А и щелочная фосфатаза у Pseudomonas aeruginosa; пуллуланаза у Klebsiella

oxytoca. Именно в связи с большим числом и разнообразием субстратов, секретируемых через аппарат

II типа его зачастую называют "общим секреторным путем" (General Secretory Pathway, GSP).

Характерной чертой аппарата второго типа является секреция белков в две стадии. Сначала они

экспортируются через цитоплазматическую мембрану, где в случае Грам-положительных бактерий их

секреция и заканчивается. В случае Грам-отрицательных бактерий белки оказываются в периплазме, и

либо остаются там (и тогда говорят не о секреции, а об экспорте), либо встраиваются во внешнюю

мембрану, либо секретируются во внешнюю среду посредством одной из терминальных ветвей GSP.

Sec система.

В отличие от секреции у эукариот, секреция через бактериальную плазматическую мембрану

протекает в основном посттрансляционно. Работу Sec системы можно разделить на три стадии:

- направление белка на транспорт

- собственно транслокация белка через мембрану

- освобождение транспортированного белка на периплазматической стороне мембраны

На первой стадии пребелки направляются к точкам секреции в цитоплазматической мембране

(местам, где собран транслокационный комплекс). На второй стадии полипептидная цепочка пересекает

липидный бислой, скорее всего через транслоказу. На третьей стадии транслоцированный полипептид

- 72 -

освобождается

и

либо

принимает свою нативную

конформацию,

либо

направляется для дальнейшей

секреции

в

одну

из

терминальных ветвей GSP.

Как минимум 10 белков

необходимы для работы Sec

системы (Рис.

13.2). Первая

стадия

реакции требует

присутствия специфичного

для секреции шаперона SecB.

Этото шаперон является

тетрамером, опознает белки,

содержащие

сигнальный

пептид, и связывается с ними,

выполняя

фактически

Рис.13.2. Sec-система

функцию

молекулярного

шаперона, связываясь

с

областями пресекреторных белков, не принявшими свою окончательную конформацию и поддерживая

их в компетентном для транслокации состоянии. Второй функцией SecB является "доставка"

предшественников белков к SecA субъединице мембранной транслоказы. В некоторых случаях могут

привлекаться гомеостатические шапероны GroEL и DnaK.

Вторая стадия реакции катализируется сложным белковым комплексом, расположенным в

цитоплазматической мембране - транслоказой. Транслоказа содержит пронизывающий мембрану канал,

состоящий из субъединиц трех белков, SecY, SecE и SecG. Эти три белка являются интегральными

мембранными белками, составляющими структурную основу транслоказы - каркас или раму. SecY -

интегральный мембранный белок (10 НТМ - стр-ра подобная мембр транспортерам, напр, LacY). SecE

имеет три трансмембранных сегмента, SecD и SecF - шесть. А «мотором» транслокационный машины

служит АТФаза SecA. Этот белок уникален для бактерий

- эукариоты используют другую

транслокационную АТФазу. SecA - большая вытянутая димерная молекула, содержащая два домена -

амино-концевой АТФазный и карбокси-конец, необходимый для димеризации. Карбокси-концевой

домен позволяет SecA связаться с SecYEG, что создает функциональную основу транслоказы.

Дополнительные субъединицы транслоказы SecD и SecF оптимизируют секреторную реакцию.

Источником энергии для секреции служит АТФ и протондвижущая сила (ускоряет транслокацию).

Сигналом для секреции служит т.н. лидерная или сигнальная последовательность, отщепляемая

после транслокации специфической сигнальной пептидазой. Есть несколько сигнальных пептидаз,

каждая из которых отщепляет сигнальные пептиды специфического класса секретируемых белков:

Сигнальная последовательность:

++hhhhhhhhhhhhhhhh(PG)NNANAP Oor- (LepB - основная)

++hhhhhhhhhhhhhLNACD Oor-

(LspA - для липопептидов)

++QRGFhhhhhhhhhhhhNNNNNN

(GspO)

^

Сигнальная последовательность липопротеинов обязательно содержит цистеин, который

модифицируется до глицерилцистеина перед отрезанием сигн. пептида, и именно здесь затем

присоединяются жирные кислоты.

Сигнальные пептиды отрезаются лидерной пептидазой в момент транспорта белка через

цитоплазматическую мембрану.

SecB направляет связанный белковый предшественник к мембранной транслоказе, связываясь с

SecA, ассоциированным с SecYEG. Кроме того, после такого связывания сигнальный пептид

связывается с карбокси-концевым доменом SecA, что еще более усиливает взаимодействие SecA-SecB.

Это взаимодействие вызывает высвобождение зрелой части белкового предшественника из комплекса с

SecB. Пре-белок таким образом переносится от SecB к SecA.

- 73 -

SecA

(мутанты нежизнеспособны). Димер. АТФаза. Гидрофильный белок, но часто

обнаруживается в ассоциации с мембраной и рибосомами. В определенных условиях in vitro

присутствия только белка SecA может быть достаточно для транслокации белков через мембрану.

Присутствует в клетке в большом избытке по сравнению с другими Sec-белками. Связывается сильно с

SecY.

Периплазма

После экспорта в периплазму Sec-системой некоторые белки могут здесь и задержаться (причем

большинство периплазматических белков олажется заякоренным в цитоплазматической мембране).

Часть белков, однако, следует дальше и секретируется во внешнюю среду, причем такая секреция

может осуществляться как минимум тремя различными способами.

Выход белка в периплазму в чем-то похож на его выход с рибосомы. Белок проходит через Sec-

аппарат практически в полностью развернутом состоянии, поэтому перед ним вновь возникает

проблема фолдинга. И, хоть большинство секретируемых белков способны сами справиться с этой

проблемой, в периплазме, так же как и в цитоплазме, присутствуют шапероны. Кроме классических

шаперонов фолдингу способствуют еще и белки DsbA и DsbC, являющимися дисульфидизомеразами.

Функцией этих белков является образование дисульфидных мостиков между цистеиновыми остатками.

Дисульфидные связи присутствуют у многих секретируемых белков. Такие связи обычно

стабилизируют третичную структуру белка и совершенно необходимы для его функционирования.

Дисульфидные мостики не могут образоваться в восстановительной среде цитоплазмы (к тому же

появление таких связей препятствовало бы секреции), поэтому они образуются в периплазме, чему и

способствуют ферменты DsbA и DsbC. Если зрелый белок должен содержать дисульфидные связи, без

их образования под действием DsbAC секреция за пределы периплазмы, как правило, невозможна.

Основная терминальная ветвь GSP

JMB659 -GspEL interaction, good intro

Секреция во внешнюю среду белков, имеющих периплазматические интермедиаты, может

происходить несколькими путями, называемыми "терминальнуми ветвями общего секреторного пути".

Мы разберем работу только одного пути, который считают основным (Рис.13.3).

Основная терминальная ветвь GSP лучше всего изучена у клебсиелл и эрвиний. У обоих бактерий

(впрочем, как и у всех остальных, изученных в этом отношении) все гены, кодирующие компоненты

терминальной ветви, собраны в один кластер размером 13-15 т.п.н., в котором локализовано 12-15

генов. По историческим причинам эти гены называются по-разному - pul у клебсиелл, out у эрвиний, но

мы будем пользоваться аббревиатурой gsp, принятой у некоторых бактерий и наилучшим образом

отражающей функцию этих генов.

Мутанты

по

gsp

генам

накапливают в норме секретируемые

продукты

в

периплазме,

что

свидетельствует в пользу того, что

первая стадия

(экспорт) проходит у

таких мутантов нормально, и аппарат

gsp нужен только для транспорта через

внешнюю мембрану. Поэтому логично

было бы предположить, что белки Gsp

будут локализованы во внешней

мембране или в периплазме. К

удивлению исследователей, большая

часть этих белков опронизывает

цитоплазматическую мембрану, а один

(GspE) вообще локализуется в

цитоплазме. В большинстве случаев

(GspGHIJKMN) белки имеют битопную

Рис.13.3. Основная терминальная ветвь общего

конформацию с цитоплазматически

секреторного пути

локализованным

N-концом

и

периплазматическим C-концом, причем

- 74 -

большая часть белка локализуется все-таки в периплазме. GspL имеет такую же топологию, но с

большей частью, расположенной в цитоплазме. GspO и GspF являются политопными мембранными

белками с несколькими пронизывающими мембрану доменами.

Функции четко известны не для всех Gsp белков. GspO - специфическая пептидаза для N-

концевых секреторных сигналов белков GspGHIJ(К?). Мишень, на которую действует пептидаза у

каждого из этих четырех белков, такая же, как и у предшественников мономеров пилина, из которых

складываются пили IV типа у некоторых бактерий

(например, P. aeruginosa). Препилины

процессируются пептидазой PilD, оставляющей метилированный остаток Phe на N-конце

процессируемого белка. Поскольку белки GspGHIJ имеют типичный сайт разрезания N-MePe-

пептидазой и процессируются при помощи GspO, их называют "псевдопилинами", хотя они и не

участвуют в образовании пилей. К тому же, в отличие от пилинов, после процессинга псевдопилины не

освобождаются, а остаются заякоренными в цитоплазматической мембране своими N-концевыми

гидрофобными участками. Поэтому функция процессинга остается не совсем ясной, хотя и очевидно,

что процессинг псевдопилинов необходим для нормальной сборки секреторного аппарата, поскольку

мутанты по GspO к секреции не способны.

Белок GspE является цитоплазматическим и, тем не менее, совершенно необходим для секреции.

Этот белок является типичным представителем ABC-транспортеров, и скорее всего является

транспортной АТФазой, обеспечивающей энергией какие-то стадии секреторного процесса (скорее

всего, сборку псевдопилюса), что осуществляется через белок GspL (показано его взаимодействие с

GspE).

Только два компонента секреторного аппарата, GspD и GspS локализованы во внешней мембране.

GspD принадлежит к крупному классу секретинов, представители которого обязательно присутствуют

во всех аппаратах секреции не только II, но и III типа. Гомомультимеры этого белка образуют

цилиндрическую пору во внешней мембране, через которую и выходит из клетки секретируемый

продукт. Белок имеет два четко выраженных домена. C-концевой необходим для мультимеризации

белка во внешней мембране. N-концевой домен является периплазматическим и, скорее всего, именно

он отвечает за видоспецифичность аппарата секреции.

Липопротеин GspS является специфическим шапероном для GspD, защищая его от протеолиза и

способствуя инсерции GspD во внешнюю мембрану.

На сегодняшний день нет устоявшегося мнения о том, как работает аппарат GSP. Скорее всего,

многочисленные компоненты GSP взаимодействуют друг с другом, образуя трансмембранную

структуру, простирающуюся от цитоплазматической стороны внутренней мембраны, через периплазму

вплоть до внешней мембраны. Показано, что экспрессия GspE должна предварять синтез остальных

белков аппарата термнальной ветви GSP. Возможно, что гидролиз АТФ вызывает у N-концевого домена

GspL, ассоциированного с GspE, конформационное изменение, которое передается через мембрану

периплазматическому домену GspL, что и вызывает сборку периплазматических компонентов

терминальной ветви GSP.

Система секреции II типа высоко специфична. Несмотря на то, что белки-компоненты

секреторного аппарата очень сходны друг с другом, их субстраты не будут секретироваться даже очень

близкородственными бактериями. Так, например, пектатлиазы E. carotovora не будут секретироваться

из близкородственного вида E. chrysanthemi, несмотря на то, что сходство белков секреторного аппарата

превышает

90%. Это свидетельствует о том, что аппарат секреции содержит какой-то

видоспецифический компонент. Наблюдается своеобразный парадокс: с одной стороны, каждая

бактерия способна секретировать совершенно структурно несходные белки - пектатлиазы, целлюлазы,

полигалактуроназы и т.д., а с другой - неспособна секретировать практически идентичную пектатлиазы

из близкородственного вида.

Регуляция GSP

Как всегда в случае громоздкой белковой системы, клетка заинтересована в том, чтобы

энергоемкий синтез большого количества белков происходил только тогда, когда он необходим.

Поэтому большинство оперонов, входящих в GSP-кластеры у различных бактерий, четко регулируется,

хотя и по-разному у различных видов. Так, pul гены Klebsiella контролируются активатором MalT, а out

гены эрвиний - репрессором KdgR. В обоих случаях экспрессия белкового аппарата, необходимого для

секреции факторов вирулентности, произойдет при контакте с хозяином и появлении соответствующего

индуктора - мальтозы или продуктов метаболизма клеточных стенок растений. Кроме того, экспрессия

- 75 -

Gsp-белков у многих патогенов (эрвиний, псевдомонад и т.д.) зависит от фазы роста и индуцируется

при возрастании плотности популяции.

Сходные опероны ряда организмов

Фенотип мутантов

Реконструкция Out пути в E. coli

Секреторный аппарат III типа

1.1.Специфика аппарата секреции III типа и его компоненты.

Системы секреции III типа жизненно необходимы для многих патогенов животных и растений,

таких как Bordetella bronchiseptica, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia pitsitacii, Erwinia amylovora,

Erwinia crysanthemi, энтеропатогенные Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae,

Ralstonia solanacearum, Rhizobia spp., Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Xanthomonas campestri, и

три вида Yersinia.

Отличительными чертами этих систем секреции являются доставка факторов вирулентности

непосредственно в клетку эукариотического хозяина (хотя часть белков, секретируемых по этому пути,

остается связанной с поверхностными структурами бактерии или попадает в среду), а также

использование большого количества специфических секреторных шаперонов.

Больше всего информации о системе секреции III типа имеется для патогенов животных, где более

или менее четко показаны функции

нескольких белков. Наиболее хорошо

система секреции III типа изучена у

иерсиний

(Рис.

13.4). Yersinia spp.

секретируют

как

минимум

14

различных Yop белков (Yersinia outer

proteins) по этому пути. Гены,

кодирующие Yops, так же как и гены,

кодирующие секреторный аппарат,

(ysc, Yop secretion genes) расположены

на

плазмиде

вирулентности.

Повышение температуры до

37°C,

происходящее,

например,

при

попадании бактерии в организм

человека, индуцирует экспрессию

секреторного аппарата III типа.

Высокая концентрация кальция во

внеклеточной

среде

тканей

человеческого

тела

ингибирует

секреторный аппарат, однако контакт с

клеткой хозяина вызывает секрецию

Yop-белков, причем в данном случае

происходит не только секреция, но и

транслокация белков непосредственно

в клетки лимфоидных тканей, где

иерсинии и размножаются.

Секреторный аппарат III типа

Yersinia spp. состоит из как минимум

24 Ysc белков,

11 из которых

консервативны у всех секреторных

Рис.13.4. Секреторный аппарат III типа

систем этого типа

(включая таковые

патогенов

растений).

Некоторым

- 76 -

сходством с аппаратом секреции III типа обладает система сборки бактериального жгутика - из 11

консервативных секреторных генов здесь присутствует 10. Не хватает только yscC, кодирующего белок

внешней мембраны (секретин), через который Yop белки и попадают во внешнюю среду. Этот секретин

является единственным белком системы секреции III типа, имеющим сходство с другими секреторными

белками, а именно с секретином GspD из аппарата секреции II типа. Предполагается, что

11

консервативных компонентов (Hrc-белков) формируют белок-проводящий канал, который пронизывает

обе клеточные мембраны грамотрицательных бактерий. Такая структура была изолирована и

охарактеризована для системы сборки бактериального жгутика (называемой также базальным телом).

Секреторный аппарат базального тела транспортирует субъединицы крюка и флагеллин, которые после

секреции полимеризутся и образуют длинный филамент, обеспечивающий подвижность бактерий.

Секреторный аппарат III типа S. typhimurium, называемый игольчатым комплексом, напоминает по

своей структуре базальное тело жгутика (имеет характерные кольца в различных слоях бактериальной

клеточной стенки), но в его состав еще дополнительно входит секретин внешней мембраны. В

дополнение к интегральным мембранным белкам в состав аппарата секреции III типа входит и

несколько цитоплазматических компонентов, которые могут участвовать в доставке субстратов к сайту

секреции. Некоторые компоненты секреторного аппарата, очевидно, являются мобильными, поскольку

могут быть обнаружены как в цитоплазме бактериальной клетки, так и за ее пределами.

При повышении температуры до 37°C в отсутствии кальция иерсинии секретируют полтора

десятка белков во внешнюю среду. Система секреции III типа не зависит от sec-белков. Соответственно,

секретируемые белки не имеют сигнального пептида, характерного для системы секреции II типа. Тем

не менее, сигнал для секреции закодирован в N-концевой части субстратов, с которыми происходит

взаимодействие специфических секреторных шаперонов (а в некоторых случаях, возможно, сигналом

является непосредственно мРНК). Распознавание субстрата является чрезвычайно специфичным и

точным, поскольку в момент секреции бактерия способна специфически доставить конкретный

субстрат в одно из трех возможных “мест назначения” - бактериальную оболочку, внешнюю среду или

в цитозоль клетки эукариотического хозяина.

О структуре аппарата секреции у фитопатогенов известно очень мало, однако для нескольких

бактерий показано наличие особенной поверхностной структуры, связанной с аппаратом секреции III

типа. Эта структура, длинный тонкий филамент - hrp-пилюс, состоит, скорее всего, из одного белка

HrpA и необходима для секреции. Секретируемые белки могут проходить через внутренний канал hrp-

пилюса, хотя он и имеет небольшой диаметр 8-10 нм. Необходимыми компонентами аппарата секреции

у фитопатогенов являются секретин HrcC (гомолог YscC иерсиний), ассоциированный с наружной

мембраной липопротеин HrcJ, пять белков внутренней мембраны HrcR, HrcS, HrcT, HrcU, HrcV (HrpO),

и два цитоплазматических белка HrcQ и HrcN, последний из которых является АТФазой.

1.2. Субстраты аппарата секреции III типа.

Наиболее хорошо изучены белки, секретируемые посредством аппарата III типа, опять же, у

патогенов человека, прежде всего, у иерсиний. Наиболее интересные из этих белков и их функции

перечислены ниже.

YopN - сенсор контакта, "затыкающий" секреторный канал. Похожей функцией обладает LcrG, но

этот белок располагается в цитоплазме. Гомологом YopN у фитопатогенов является HrpJ, однако

степень гомологии невысока, а роль этого белка при секреции у фитопатогенов не показана.

YopE - цитотоксин. Транслоцируется непосредственно в цитозоль макрофагов, где вызывает

коллапс цитоскелета путем разрушения актиновых филаментов.

YopH - тирозин фосфатаза

(попадая в цитозоль макрофага, дефосфорилирует компоненты

сигнальной цепочки, необходимые в фосфорилированной форме для фагоцитоза)

YopB и YopD - мембранные транслоказы. Предполагается, что, будучи секретированными за

пределы бактериальной клетки, эти белки ассоциируют с мембраной макрофага, образуя канал, через

который и происходит транслокация остальных белков внутрь эукариотической клетки.

К числу белков, секретируемых посредством аппарата III типа фитопатогенов, относятся прежде

всего непосредственные индукторы HR - Avr белки и харпины. По крайней мере несколько генов,

кодирующих эти белки, входит в состав hrp кластеров. При всем отличии этих белков от секретируемых

субстратов аппарата III типа у животных можно заметить удивительное сходство функций. Так, по

крайней мере часть Avr-белков вызывает нарушение сигнальных каскадов в клетке хозяина,

- 77 -

контролирующих его защитный ответ

(как и фосфатазы, доставляемые в цитозоль макрофагов

иерсиниями) либо нарушение регуляции защитного ответа на уровне транскрипции, а харпины, скорее

всего, ассоциируют с растительной клеточной стенкой и либо сами формируют транслокационный

канал, либо способствуют его формированию (что напоминает работу белков YopB и YopD иерсиний).

Харпины - внеклеточные элиситоры реакции гиперчувствительности (быстрой гибели клеток

растения в непосредственной близости от сайта внедрения "несовместимого" патогена). Это

относительно небольшие (40-45 kDa) термостабильные белки с высоким (порядка 20%) содержанием

глицина, низким тирозина и совсем лишенные цистеина. Харпины из различных фитопатогенов по

гомологии аминокислотных последовательностей можно разделить на три группы - HrpN, HrpZ и

HrpW. При всем сходстве общего аминокислотного состава первичные аминокислотные

последовательности представителей разных групп не имеют заметного сходства, а внутри каждой

группы это сходство невелико. Поскольку по гомологии аминокислотных последовательностей отнести

белок к классу харпинов бывает сложно, единственным критерием является способность вызывать

реакцию гиперчувствительности при инокуляции препарата относительно очищенного белка в ткани

(как правило, листа) подходящего растения. Однако, несмотря на то, что харпины могут вызвать

реакцию гиперчувствительности у растений, их роль в процессе патогенеза неоднозначна, поскольку у

большинства проверенных штаммов инактивация харпинов не вызывает заметных фенотипических

эффектов. О молекулярной роли харпинов пока известно мало, однако харпин HrpW имеет домен,

сходный с пектатлиазами (но не обладающий, тем не менее, пектолитической активностью), что

наводит на мысль о возможном взаимодействии этого белка с клеточной стенкой растений. И

действительно, такое взаимодействие недавно было продемонстрировано, правда, для другого харпина -

HrpZ. Было показано, что HrpZ, скорее всего, образует пору в мембране растительной клетки, что

приводит к быстрой потере электролитов и гибели.

В отличие от харпинов, секретируемых аппаратом III типа в среду и уже после секреции

взаимодействующих с поверхностными структурами растительных клеток, Avr-белки в норме во

внешнюю среду не попадают, а доставляются непосредственно в растительные клетки. Хотя до сих пор

транспорт Avr-белков в растительные клетки не продемонстрирован непосредственно, тому имеются

многочисленные косвенные подтверждения. Прежде всего, часть Avr-белков имеет в своем составе

аминокислотные последовательности, имеющие смысл только в эукариотической клетке, такие как

сигнал ядерной локализации. Взаимодействие Avr-белков с их партнерскими R-генами растений было

продемонстрировано в дрожжевой двухгибридной системе для нескольких Avr-R пар.

1.3. Организация и регуляция генов, кодирующих белки аппарата секреции III типа

Несмотря на значительные таксономические различия между бактериями, обладающими

системами секреции III типа, различия в образе жизни этих патогенов и принадлежность их хозяев к

разным царствам (растений и животных), между всеми системами секреции III типа имеется много

общего. Наиболее интересным является то, что все известные системы III типа, как у фитопатогенов,

так и у патогенов животных, организованы в крупные кластеры генов, состоящие из нескольких

оперонов, полностью кодирующих все компоненты соответствующих секреторных аппаратов. Как

правило, в состав этих кластеров входят также и гены, кодирующие секретируемые субстраты. Следует

заметить, что во многих случаях эти кластеры ограничены по краям мобильными генетическими

элементами и имеют нуклеотидный состав (%GC), существенно отличающийся от остальной части

генома бактерии. Такая организация кластеров секреторных генов может свидетельствовать о

сравнительно недавнем приобретении их соответствующей бактерией и о том, что такие "острова

патогенности" могут относительно свободно перемещаться горизонтально между таксономически

весьма удаленными бактериями.

У всех изученных фитопатогенных бактерий большинство hrp генов располагается в одном

большом кластере размером 20-25 т.н.п. и организовано в 7-8 транскрипционных единиц. Четыре

наиболее полно охарактеризованных на сегодняшний день кластера могут быть разделены на две

группы на основании сходства между составляющими их генами, структурой оперонов и

регуляторными системами. К первой группе можно отнести hrp кластеры P. syringae и E. amylovora, а

ко второй - R. solanacearum и X. campestris.

- 78 -

Интересным является то, что и

регулируются гены этих двух групп

кластеров

по-разному.

Основным

регулятором у P. syringae и E. amylovora

является альтернативный сигма-фактор, а

у R. solanacearum и X. campestris

семейства (как, кстати, и у иерсиний)-

активатор AraC (Рис. 13.5)

Наиболее

хорошо

система

регуляции изучена у P. syringae pv.

syringae. Для этой бактерии было

показано, что HrpR, HrpS, и HrpL

являются частью многокомпонентной

регуляторной

системы,

контролирующей экспрессию hrp и avr

генов. HrpR и HrpS принадлежат к классу

NtrC-подобных

σ54-зависимых

энхансеров транскрипции. HrpR и HrpS

отличаются от большинства членов

семейства NtrC тем, что они утратили

аминоконцевой регуляторный домен,

который

изменяет

регуляторную

активность

(в связи с чем можно

предположить, что в сигнальной цепи,

ведущей к активации hrp-генов,

обязательно должны присутствовать

другие белки), однако они по-прежнему

содержат

консервативный

карбоксиконцевой ДНК-связывающий

домен.

Действие

NtrC-подобных

энхансеров

транскрипции

осуществляется через взаимодействие с

Рис.13.5. Транскрипционная регуляция систем

альтернативным σ-фактором RpoN (σ54),

секреции III типа

и было показано, что rpoN ген необходим

для экспрессии hrp генов у нескольких

патоваров P. syringae. RpoN осуществляет свое действие через контроль экспрессии другого сигма-

фактора, HrpL, принадлежащего к ECF семейству (extra cytoplasmic functions) сигма-факторов. А уже

HrpL активирует транскрипцию с зависящих от него промоторов, каковыми являются практически все

изученные на сегодняшний день промоторы оперонов, кодирующих hrp и avr гены. Показано

связывание HrpL с консервативной промоторной последовательностью GGAACCNA-N14-CCACNNA,

называемой hrp-боксом. Аналогичная схема регуляции имеет место и у E. amylovora.

Секреторные шапероны.

Для секреции многих субстратов через аппарат 3-го типа необходимо действие специфических

цитоплазматических шаперонов. Первыми обнаруженными и наиболее изученными являются Syc

шапероны Yersinia, необходимые для секреции Yop белков. Характерной чертой этих шаперонов

является специфичность - все Syc белки взаимодействуют только с одним секретируемым белком

(только в одном случае с двумя). Утрата одного шаперона блокирует секрецию соответствующего

белка, тогда как секреция остальных субстратов данного секреторного аппарата не нарушается. Белок,

лишенный шаперона, накапливается в цитоплазме и зачастую быстро деградирует.

В то время как взаимодействие между собой и вообще судьба факторов вирулентности после

секреции изучена слабо, много информации имеется о взаимодействии между собой жгутиковых белков

(использующих фактически такую же систему секреции) после их экспорта из клетки. Эти белки, как

правило, полимеризуются с образованием характерных жгутиковых структур. Базальное тело жгутика,

- 79 -

пронизывающее периплазматическое пространство, состоит из 5 белков (FlgB, C, F и G, FliE). К нему

прикреплен достаточно гибкий крюк (FlgE), выходящий за пределы поверхности клетки. K крюку

присоединена длинная нить жгутика, состоящая из одного белка (FliC), для прикрепления которого к

крюку необходимы два белка, FlgK и FlgL, а конец нити жгутика защищен еще одним белком, FliD.

Базальное тело жгутика представляет собой не что иное, как секреторный аппарат секреции пяти белков

- субъединиц крюка, нити и FlgK, FlgL и FliD. А поскольку диаметр секреторного канала, через

который должны проходить эти белки, невелика - всего 25-30Å, все эти белки (включая и некоторые

субъединицы базального тела) должны транспортироваться в частично развернутом состоянии. Что

проблематично, ибо эти белки преимущественно имеют α-спиральную структуру и имеют выраженную

склонность к олигомеризации. Для предотвращения окончательного фолдинга и самосборки

жгутиковых субъединиц в цитоплазме бактерия использует специфические шапероны, которых на

сегодняшний день описано три - FlgN, FliT и FliC.

Таким образом, использование субстрат-специфических шаперонов в процессе секреции является

характерным для обоих “подтипов” аппаратов III типа. Оба типа шаперонов обычно связываются с

небольшим районом субстрата. Но имеются и существенные отличия. Для факторов вирулентности этот

район располагается в пределе первых

125 аминокислот с N-конца и соответствует области,

необходимой для транслокации субстрата в эукариотические клетки, тогда как шаперон-связывающий

домен жгутиковых белков расположен в пределах последних 40 АК белка (самый карбокси-конец) и

необходим для взаимодействия жгутиковых субъединиц между собой.

Что же представляет собой секреторный сигнал? Как у жгутиковых субъединиц, так и у продуктов

генов вирулентности он расположен в N-конце белка. Но по крайней мере в случае Yop белков белковая

природа сигнала находится под вопросом. Эксперименты со введением сдвига рамки в начальную часть

yop генов показали, что секреция не нарушается, если этот сдвиг компенсируется еще одной мутацией

через

15-17 кодонов. С другой стороны, по крайней мере для некоторых Yop белков показана

абсолютная зависимость секреции от действия соответствующего шаперона.

Секреторный аппарат IV типа

Система секреции IV типа имеет выраженное сходство с аппаратом конъюгации ряда плазмид и

скорее всего произошла от него. Эта экспортная система характеризуется чрезвычайно широкой

специфичностью как по отношению к субстратам

(крупные нуклеопротеидные комплексы,

мультикомпонентные белковые токсины и мономерные белки), так и по отношению к мишеням

секреции, каковыми могут служить бактерии, грибы, растения и животные (иными словами, клетки

представителей всех царств за исключением архей).

Изначально система секреции IV типа была выделена при обнаружении сходства трех

секреторных аппаратов - транспорта T-ДНК A. tumefaciens, Tra системы IncN плазмиды pKM101 и

системы секреции токсина B. pertussis. Затем сходство с этими секреторными аппаратами было

обнаружено у еще нескольких Tra систем и системы секреции балка CagA - фактора вирулентности

Helicobacter pylori.

Таким образом, многие системы IV типа переносят ДНК, но необходимо отметить, что

переносится не ДНК сама по себе, но однонитевая ДНК, связанная с одним или несколькими белками.

Эти белки участвуют в процессинге ДНК в точке начала переноса (oriT), ведущем к образованию

конъюгационного интермедиата. Трансэстераза инициирует процессинг, связываясь с ДНК в точке oriT

(либо функционально эквивалентвых границах Т-ДНК у агробактерий) и внося одноцепочечный

разрыв. После внесения разрыва трансэстераза остается ковалентно связанной с 5' концом одной нити

через тирозиновый остаток. Однонитевая ДНК при конъюгации переносится как раз в направлении 5' ->

3', и скорее всего именно трансэстераза обеспечивает опознавание конъюгационного интермедиата

секреторным аппаратом. В случае A. tumefaciens трансэстераза VirD2 экспортируется вместе с Т-ДНК в

растительную клетку , где сигналы ядерной локализации, присутствующие в VirD2, направляют Т-ДНК

в ядро клетки. Таким образом, конъюгационные системы можно рассматривать как аппарат секреции

белка, приспособленный для экспорта ковалентно связанной с белком ДНК.

Кроме того, недавно было показано, что конъюгационные системы могут транспортировать и не

связанные с ДНК белки. Так, Tra аппарат плазмиды RP4 способен секретировать белок RecA, а система

- 80 -

переноса Т-ДНК способна секретировать VirE2 (SSB белок) и еще один фактор вирулентности, VirF.

Интересно, что для секреции VirE2 необходимо участие шаперона VirE1. VirE1 стабилизирует VirE2 in

vivo и препятствует его агрегации in vitro, что делает его похожим на Syc шапероны Yersinia.

Белковые субстраты систем секреции IV типа патогенов животных радикально отличаются от

субстратов Tra систем, тем не менее, имеется значительное сходство аппаратов секреции. Например,

система Ptl B. pertussis секретирует сложный токсин PT, принадлежащий к группе A/B токсинов и

состоящий из 5 субъединиц, S1-S5. Домен А токсина состоит из субъединицы S1, а В домен - из S2-S5

субъединиц в соотношении 1:1:2:1. В отличие от Tra систем экспорт PT - двухстадийный процесс.

Субъединицы ПТ сначала экспортируются через цитоплазматическую мембрану при помощи Sec

системы, затем холотоксин собирается в периплазме и в собранном виде транспортируется через

внешнюю мембрану системой Ptl. После экспорта В домен токсина взаимодействует с

гликопротеиновыми рецепторами хозяйской клетки и обеспечивает транслокацию домена А внутрь.

Внутри хозяйской клетки домен А нарушает сигнальные пути путем рибозилирования регуляторных

белков.

Аппарат секреции IV типа (который мы рассмотрим на примере более изученных Tra систем)

состоит состоит из двух поверхностных структур, конъюгационного канала, через который происходит

транслокация ДНК и белков, и конъюгационного пилюса, необходимого для контакта с реципиентной

клеткой. Структура системы секреции изучена недостаточно, и пока выделяют несколько групп белков,

функции которых до конца не выяснены:

поверхностные белки, участвующие в формировании пилюса и др. поверхвостных структур;

компоненты конъюгационного канала;

АТФазы цитоплазматической мембраны.

Изучение систем секреции II-IV типов выявило некоторое сходство между ними. Так, системы III

и IV типа начинают секрецию только при контакте с клеткой-мишенью. Обе системы используют

специфические шапероны. Обе системы (как правило) транспортируют субстраты в одну стадию через

трансмембранный канал, пронизывающий обе мембраны. Наконец, обе системы каким-то образом

используют пили в секреторном процессе.

Имеется также сходство и с

системой секреции II типа (особенно

если рассматривать секрецию PT B.

pertussis). Интересно, что холерный

токсин, очень схожий с PT B.

pertussis,

транспортируется через

систему II типа. Кроме того,

бактериофаг CTXφ V. cholerae

выходит из клетки через аппарат II

типа

- таким образом, и система

секреции II типа может обеспечивать

транспорт ДНК в ассоциации с

белками.

В дополнение к секреторным

механизмам, требующим участия

специального аппарата секреции

недавно

был описан случай

"самотранспорта" белка, а именно

Рис.13.6. Сходство систем секреции I-III типов

протеазы IgA Neisseria gonorrhoeae

через внешнюю мембрану

Литература:

1. A. Economou. Following the leader: bacterial protein export through the Sec pathway. Trends in

Microbiology 1999 VOL. 7 NO. 8 p. 315-320

2. D. M. Anderson and O. Schneewind. Type III machines of Gram-negative pathogens: injecting virulence

factors into host cells and more. Current Opinion in Microbiology 1999, 2:18-24

- 81 -