РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА. Курс лекций

белка в активированном состоянии. Фосфорилирование РО приводит к его конформационному

изменению, затрагивающему значительную часть поверхности РО. Изменение поверхности позволяет

происходить новым внутри- и межмолекулярным взаимодействиям, которые и вызывают адаптивный

ответ. Такой принцип работы РО делает возможным многообразные регуляторные механизмы,

оптимизированные для различных эффекторных функций в различных системах.

Большинство РО состоит из двух доменов: консервативного аминоконцевого регуляторного и

варьирующего карбоксиконцевого эффекторного. Большинство РО являются транскрипционными

факторами с ДНК-связывающими эффекторными доменами (25 из 32 РО у E. coli). ДНК-связывающие

домены могут быть разделены на три группы, представленные OmpR, NarL и NtrC (соответственно 14, 7

и 4 члена). Не все РО имеют ДНК-связывающие домены. Карбоксиконцевые домены некоторых РО

являются ферментами, как, например, метилтрансфераза CheB, участвующая в хемотаксисе. Некоторые

РО вообще лишены эффекторного домена. Примером такого белка является опять же белок хемотаксиса

CheY, который функционирует путем взаимодействия с эффекторным белком FliM, компонентом

жгутикового мотора.

Регуляторный домен.

Наиболее консервативная часть белка. содержит кластер остатков аспартата, которые связывают

Mg2+ и формируют активный сайт для переноса фосфата

Эффекторный домен

Эффекторным доменам сложно дать общую характеристику по причине их большого

разнообразия. Большинство эффекторных доменов имеет ДНК-связывающую активность и действиет

путем активации или репрессии транскрипции специфических генов. Тем не менее, узнаваемые

последовательности ДНК, расположение сайтов связывания и механизм транскрипционной регуляции

существенно различаются, даже у РО из одного подсемейства.

OmpR, детально охарактеризованный представитель самого большого подсемейства РО, действует

и как активатор, и как репрессор, дифференциально регулируя экспрессию генов ompC и ompF,

кодирующих порины внешней мембраны. Димеры OmpR последовательно связываются с F и C

боксами, предшествующими пориновым генам. Белки-представители этого семейства связываются с

ДНК посредством характерного мотива "крылатая спираль", состоящего из распознающей спирали,

взаимодействующей с большой бороздкой в ДНК, и двух петель, или крыльев, по обе стороны спирали,

которые взаимодействуют с малой бороздкой.

Второе подсемейсво РО представляет NarL, - транскрипционный фактор, который и активирует, и

репрессирует гены, участвующие в метаболизме нитрита и нитрата. NarL связывается со

множественными "NarL гептамерами" - сайтами связывания - путем типичного HTH мотива.

Наиболее сложное как структурно, так и функционально подсемейство РО представлено

регулятором азотного метаболизма NtrC - энхансером транскрипции, активирующим содержащий σ54

холофермент РНК-полимеразы. Эффекторная область белков этого подсемейства состоит из двух

доменов - АТФазного и ДНК-связывающего HTH домена. Способные связываться с ДНК димеры NtrC

после фосфорилирования олигомеризуются в октамеры. Олигомеризация стимулирует гидролиз АТФ

что дает энергию для образования открытого комплекса и активации транскрипции.

Активация фосфорилированием.

Большое разнообразие эффекторных доменов ставит вопрос о том, как консервативный

регуляторный домен может изменять активность таких разнообразных эффекторных доменов.

Регуляторные домены РО существуют в виде находящейся в состоянии равновесия смеси активной и

неактивной форм. Фосфорилирование регуляторного домена сдвигает равновесие в сторону активной

формы, которая имеет существенно отличную поверхность. Различные молекулярные поверхности двух

форм могут способствовать специфическим белок-белковым

(или белок-ДНК) взаимодействиям.

Поэтому любой тип регуляции, кототрый может быть осуществлен за счет меж- или

внутримолекулярных взаимодействий, может использоваться семейством РО.

Соответственно существуют различные механизмы активации РО. Каждый механизм основан на

специфических

регуляторных

взаимодействях

присущих фосфорилированному и(или)

нефосфорилированному регуляторному домену. В некоторых случаях активация происходит за счет

снятия ингибирования. При этом РО обычно можно активировать путем делеции регуляторного домена.

В других случаях фосфорилированный регуляторный домен играет активную роль. Фосфорилирование

- 31 -

может способствовать взаимодействию с другими белками либо ди- или олигомеризации. Так,

связывание OmpR с соседними операторными участками усиливается при взаимодействии его

субъединиц между собой, которое усиливается при фосфорилировании; фосфорилирование NtrC

способствует его олигомеризации в энхансерной области, что активирует транскрипцию. Некоторые

белки используют комбинацию этих механизмов. Фосфорилирование обычно соответствует активации,

но есть и исключения.

Для двух РО с известной структурой известен точный механизм ингибирования эффекторного

домена нефосфорилированным регуляторным доменом. В нефосфорилированном состоянии

регуляторный домен экранирует активный сайт эффекторного домена, не давая последнему

взаимодействовать с субстратом, каковым может являться ДНК (в случае транскрипционного фактора

NarL) либо белок (рецептор хемотаксиса в случае метилэстеразы CheB, о которой мы поговорим чуть

позже). Для обоих белков активация происходит за счет взаимного перемещения N- и C-концевых

доменов в результате индуцированных фосфорилированием конформационных изменений.

Недавно определенные структуры фосфорилированных регуляторных доменов нескольких белков

подтверждают, что фосфорилирование вызывает протяженные структурные изменения, затрагивающие

молекулярмую поверхность регуляторного домена. Фосфорилирование не изменяет общую третичную

структуру и не вызывает существенных изменений во вторичной структуре. Единственным результатом

фосфорилирования являются незначительные (на пару ангстрем) перемещения элементов вторичной

структуры, которые, тем не менее, оказывают существенное влияние на молекулярную поверхность,

изменяя ее топологические и электростатические характеристики.

Индуцированные фосфорилированием конформационные изменения затрагивают большую

поверхность регуляторного домена, которая может быть использована во взаимодействиях со многими

мишенями. И действительно, многие РО взаимодействуют с несколькими молекулами

- ГК,

вспомогательные фосфатазы, эффекторные домены, другие регуляторные домены в составе димеров и,

возможно, компоненты транскрипционного аппарата.

Архитектура регуляторных систем

Элегантность двухкомпонентвых систем заключается в их модулярности. Простейшая сигнальная

система может состоять из одной пары ГК-РО. В более сложных случаях домены, входящие в состав ГК

и РО, а также HPt-домены могут комбинироваться, образуя уже сигнальную цепочку или даже сеть,

известную под назнанием фосфотрансляционная система (система передачи фосфата). Классические

двухкомпонентные системы доминируют у прокариот, тогда как фосфотрансляционные системы чаще

встречаются у эукариот (хотя прокариотические примеры тоже имеются). Дополнительная сложность

фосфотрансляционных систем позволяет ввести дополнительные стадии контроля а также возможность

взаимодействия между различными сигнальными путями.

Большинство регуляторных систем устроены просто. Трансмембранная сенсорная ГК посредством

одной реакции передачи фосфата активирует цитоплазматический РО, который вызывает

ссответствующий адаптивный ответ. Типичным примером такой системы, использующей единичный

перенос фосфата от His к Asp, является осморегуляторрная пара EnvZ-OmpR, контролирующая

экспрессию поринов внешней мембраны OmpF и OmpC. Есть и вариации на эту тему, когда несколько

ГК могут фосфорилировать один РО или одна ГК контролирует несколько РО, но в любом случае для

таких простых систем имеет место только один акт передачи фосфата в направлении His -> Asp.

Например, в системе контроля хемотаксиса одна ГК CheA фосфорилирует два РО, CheB и CheY. Еще

более сложная ситуация встречается в системе контроля нитрат/нитрит-реагирующих генов, в которй

две ГК, NarX и NarQ, контролируют два РО, NarL и NarP.

Фосфотрансляционные системы

Еще более усложненные версии двухкомпонентных систем используют более одного акта

передачи фосфата. Такие сигнальные пути называют фосфотрансляционными системами (системами

передачи фосфата). В простейшем случае фосфотрансляционная система удлиняет цепочку передачи

фосфата на два шага, Asp -> His и His -> Asp. Таким образом, базовая фосфотрансляционная система

имеет уже четыре фосфорилированных белковых продукта и пять реакций переноса фосфата:

1. Автофосфорилирование ГК:

ГК-His1 + АТФ ÅÆ ГК-His1~Ф + АДФ

- 32 -

2. 1-й перенос фосфата:

ГК-His1~Ф + РО1-Asp ÅÆ ГК-His1 + РО-Asp1~Ф

3. 2-й перенос фосфата:

РО-Asp1~Ф + HPt-His2 ÅÆ РО-Asp1 + HPt-His2~Ф

4. 3-й перенос фосфата:

HPt-His2~Ф + РО-Asp2 ÅÆ HPt-His2 + РО-Asp2~Ф

5. Дефосфорилирование:

РО-Asp2~Ф + H2O ÅÆ РО-Asp2 + PI

В этой схеме в качестве фосфорилируемых субстратов используются домены, содержащие

консервативные остатки гистидина и аспартата. Эти домены могут существовать как изолированные

белки или же быть соединенными ковалентно, как это имеет место в случае уже описанных гибридных

гистидинкиназ.

Система контроля споруляции B. subtilis (которую мы еще рассмотрим более подробно позднее)

является примером His-Asp-His-Asp цепочки. В этой системе несколько ГК могут быть донорами

фосфата для белка Spo0F. С Asp белка Spo0F фосфат затем переносится на HPt белок Spo0B и, наконец,

на Asp транскрипционного фактора Spo0А.

Множественные фосфорилируемые домены фосфотрансляционных систем создают возможность

альтернативных путей передачи фосфата. В гибридной ГК ArcB любой из имеющихся His-содержащих

доменов (димеризационный или же HPt) может получить фосфат от АТФ и передать его РО ArcA. Два

различных варианта используются в аэробных и анаэробных условиях.

Еще более сложная организация может достигаться за счет интеграции различных сигнальных

цепочек в сигнальные сети. У B. subtilis практически каждая двухкомпонентная система

взаимодействует с как минимум еще одной цепочкой передачи фосфата. В качестве примера такой

интеграции можно привести взаимодействие путей, контролирующих утилизацию фосфата

(PhoR/PhoP), аэробного и анаэробного дыхания (ResE/ResD) и споруляцию (KinA-B/Spo0A). Дыхание и

утилизация фосфата регулируются совместно - фосфо-PhoP активирует экспрессию ResD и наоборот.

Однако, когда клетка вступает на путь споруляции, и дыхание, и утилизация фосфата репрессируются,

поскольку фосфо-Spo0A негативно регулирует фосфорилированные ResD и PhoP.

Регуляторные механизмы

Единственной видимой причиной, по которой регуляторные системы являются двух- (и более) -

компонентными является сама необходимость контроля - двухступенчатый (или еще более сложный)

сигнальный путь просто напросто создает те места, в которых клетка может контролировать поток

информации. Различные регуляторные механизмы накладываются поверх базовых путей передачи

фосфата, позволяя оптимизировать передачу фосфата для нужд каждой конкретной системы.

Результатом работы некоторых систем является "количественный" ответ - так EnvZ-OmpR система

обеспечивает различные уровни экспрессии генов поринов ompF и ompC. Другие регуляторные

системы, как, например, система контроля споруляции у бацилл, дают качественный ответ типа "все

или ничего". Вне зависимости от типа даваемого ответа любая система может иметь несколько уровней

регуляции, зачастую с участием дополнительных белковых компонентов. Основными мишенями для

такой регуляции являются активности ГК и дефосфорилирование РО.

Регуляция активности ГК.

ГК могут иметь две активности, способные контролировать уровень фосфорилирования РО:

автокиназную и РО-фосфатазную. Не все ГК имеют фосфатазную активность

- для некоторых

возможна только регуляция автокиназной активности. С другой стороны, во многих системах именно

фосфатазная активность подвержена основной регуляции.

У типичных трансмембранных ГК сенсорные домены непосредственно связываются с лигандами

либо детектируют физические стимулы. В более сложных системах детекция сигналов может

происходить через взаимодействие с другими белковыми компонентами. Например, автокиназная

активность ГК хемотаксиса CheA, которая образует комплекс с хеморецепторами и адаптерным белком

CheW, ингибируется либо активируется сигналами, передаваемыми от хеморецепторов

(путем

конформационных изменений). РО-фосфатазная активность цитоплазматической ГК NtrB регулируется

- 33 -

дополнительным белком PII, чья способность взаимодействовать с NtrB зависит от его

уридилированности, которая, в свою очередь, связана с концентрацией внутриклеточного азота.

Активность ГК может также регулироваться дополнительными доменами. Например, сенсор тургора

KdpD содержит дополнительных АТФ-связывающий домен, и связывание (но не гидролиз) АТФ

необходимо для проявления фосфатазной активности.

Регуляция дефосфорилирования РО

Как мы уже обсуждали, многие РО имеют автофосфатазную активность, необходимую для

поодержания надлежащих временных параметров системы

(времени существования РО в

фосфорилированном состоянии). На дефосфорилирование РО также может влиять фосфатазная

активность ГК, регулируемая различными механизмами.

В дефосфорилировании некоторых РО участвуют вспомогательные белки. Система споруляции

бацилл имеет набор строго регулируемых фосфатаз (RapA, RapB, RapE), которые дефосфорилируют

Spo0F, и еще одну фосфатазу, которая дефосфорилирует Spo0A. В системе хемотаксиса

вспомогательный белок CheZ олигомеризуется с фосфо-CheY и стимулирует его дефосфорилирование.

Фосфатазы фосфоаспартата имеют настолько высокую специфичность по отношению к белкам-

субстратам, что возникает вопрос - действительно ли они непосредственно катализируют гидролиз или

же просто стимулируют присущую РО автофосфатазную активность.

Другие способы регуляции

Некоторуе системы могут иметь дополнительные и зачастую специфические механизмы контроля.

Например, может регулироваться сам перенос фосфата. Так, у гибридной киназы VirA из A. tumefaciens

карбоксиконцевой Asp-содержащий домен влияет на автокиназную активность киназного ядра путем

физического взаимодействия с сайтом автофосфорилирования.

Дополнительная возможность регуляции создается в тех случаях, когда ГК фосфорилирует более

одного РО. В этих случаях конкуренция за фосфат может влиять на активацию различных ветвей

сигнального пути.

Наконец, еще один способ регуляции РО

- контроль экспрессии его гена. Многие из

двухкомпонентных систем, регулирующих транскрипцию, подвержены авторегуляции. В таких

системах фосфо-РО действует как активатор или репрессор оперона, кодирующего ГК и РО.

Литература:

1. A.M. Stock, V.L. Robinson and P.N. Goudreau. Two-component signal transduction. Annu. Rev. Biochem.

2000. 69:183-215

7. Хемотаксис

7.1 Устройство и принцип действия двигательного аппарата бактерий

Движение бактерий мы рассмотрим на примере E. coli как наиболее изученной бактерии. Эта

бактерия передвигается за счет вращения своих жгутиков, которые действуют, как винты корабля.

Каждая бактерия может иметь шесть или более "винтов", разбросанных по поверхности клетки

случайным образом. Хотя каждый "винт" вращается независимо, но при вращении против часовой

стрелки нити жгутиков сближаются за счет гидродинамических сил и образуют пучок, вращающийся в

одну сторону позади клетки. Вращение

против часовой стрелки приводит к более-менее

прямолинейному поступательному движению бактерии, тогда как вращение по часовой стрелке

заставляет бактерию кувыркаться на месте (Рис. 7.1). В результате при последующем переключении

направления вращения жгутика бактерия начнет двигаться в случайном направлении. В однородной

среде бактерия кувыркается примерно раз в секунду.

Нить жгутика является тонкой ровной трубкой, созданной из уложенных спирально молекул

одного единственного белка - флагеллина. Длина жгутикового филамента варьирует и может достигать

10 длин тела бактерии. Нить жгутика прикрепляется к базальному телу при помощи полого гибкого

крюка. Крюк прикреплен к оси - полой прямой трубке, составляющей основу ротора жгутика. Ось

окружена тремя кольцами - двойным MS кольцом, находящимся в цитоплазматической мембране и

слегка выступающим из нее, P кольцом в слое пептидогликана и L кольцом в наружной мембране.

Специфическая для компонентов жгутика система секреции III типа, располагающаяся в базальном

- 34 -

теле, транспортирует через мембрану белки оси,

крюка и нити в правильной последовательности и в

нужных количествах. Секретируемые компоненты

поступают к месту сборки формирующегося

жгутика через полость в его центре.

Предполагается,

что

белки-компоненты

секреторного аппарата располагаются в основном

на цитоплазматической стороне MS кольца (Рис.

7.2.).

Вращение

жгутика

обеспечивается

молекулярным мотором, спрособным переключать

направление вращения

(Рис.

7.3.). Источником

энергии

для

работы

мотора

служит

трансмембранный протонный градиент. Моторно-

переключательный

комплекс

крепится

на

цитоплазматической стороне MS кольца и образует

колоколообразную структуру, известную как C-

кольцо. Этот комплекс содержит три белка (FliG,

FliM и FliN), участвующие в генерации

Рис. 7.1. Движение E. coli

вращательного

монента

переключении

направления вращения. Считается, что этот

колпачок

комплекс вращается вместе с MS кольцом, осью,

крюком и нитью. Статор мотора сделан из двух

белков,

окружающих

кольцо.

Карбоксиконцевой домен одного из этих белков,

MotB, закреплен в клеточной стенке, а четыре

гидрофобных спирали MotA взаимодействуют с

аминоконцевой мембранной α-спиралью, образую

проводящий

протоны

канал

через

цитоплазматическую мембрану. Предполагается,

нить жгутика

что до восьми независимых комплексов Mot белков

взаимодействуют с моторно-переключательным

комплексом, генеруруя вращение в ответ на

перемещение

протонов

внутрь

клетки.

соединение

Взаимодействие между ротором и статором

обеспечивается рядом разноименно заряженных АК

крюк

остатков в белках FliG (ротор) и MotA (статор)

центральный канал

Регуляция синтеза жгутикового аппарата

Более

генов, кодирующих белки,

необходимые

для

биосинтеза

жгутиков,

ВМ

подшипник

организованы в несколько оперонов. Естественно,

ПГ

что экспрессиия такого количества генов находится

MotB

периплазма

базаль-

стержень

под строгим контролем. Контроль в данном случае

ное тело

S (FliF)

организован иеархически. На вершине иерархии

ЦМ

M (FliF)

находится flhDC оперон, кодирующий два белка, из

MotA

цитоплазма

FliG

мотор

пере-

которых собирается гетеротетрамерный активации

клю-

FliN

транскрипции генов второго "уровня". Многие

чатель

FliM

глобальные регуляторы, такие, например, как БАК,

DnaA, связанный с нуклеоидом белок H-NS,

Рис. 7.2. Строение бактериального жгутика

влияют на уровень экспрессии оперона flhDC и,

ВМ -внешняя мембрана ПГ - пептидогликан

следовательно,

на

образование

жгутиков.

ЦМ - цитоплазматическая мембрана L, P, S, M,

Транскрипция генов первых двух уровней

C - кольца базального тела жгутика (видимые в

обеспечивается РНК-полимеразой с основным

электронном микроскопе)

сигма-фактором (RpoD). Продуктами генов второго

- 35 -

уровня являются белки,

крюк

входящие

состав

филамент

L и P кольца

базального тела жгутика и

крюка, а также регуляторные

стержень

белки FlgM и FliA. FliA

кодирует

альтернативный

MS кольцо

сигма-фактор σ28 или σF,

внешняя мембрана

необходимый для экспрессии

генов третьего, и последнего,

пептидогликан

уровня

, а FlgM является

анти-сигма

фактором,

цитоплазм. мембрана

ингибирующим активность

FliA. Когда секреторный

MotA/B статор

аппарат

(базальное тело

H+ или Na +

жгутика) и крюк собираются,

C кольцо

(a)

секреторный аппарат

FlgM экспортируется из

клетки и освобождает FliA,

который наконец может

45 nm

активировать поздние гены

жгутика.

7.2 Что такое

H+

или Na +

хемотаксис и как он

реализован у бактерий?

Хемотаксис

способность

бактерий

двигаться по направлению к

аттрактантам

(зачастую

(b)

питательным веществам) и от

Два возможных механизма

работы мотора

репеллентов

(например,

токсинов).

В качестве

аттрактантов

выступают

Рис. 7.3. Работа мотора жгутика

практически все сахара и

аминокислоты, в качестве репеллентов - жирные кислоты, спирты и другие потенциально вредоносные

вещества. Чувствительность бактерий впечатляет - они легко детектируют изменение концентрации на

0.1% при микромолярных концентрациях веществ, а диапазон детектируемых концентраций

перекрывает пять порядков. Аттрактанты и репелленты детектируются за счет непосредственного

взаимодействия со специфическими хеморецепторами, а не за счет каких-либо внутриклеточных

эффектов детектируемого вещества. Мембранные рецепторы группируются в кластеры, как правило

расположенные на полюсах клетки, однако это не может помочь бактерии уловить разницу

концентраций между полюсами, поскольку она будет слишком маленькой из-за малого размера самой

клетки. Вместо этого бактерии ориентируются в химических градиентах путем измерения временных

изменений концентраций при движении. Обычно скорость движения эшерихии составляет 10-20 своих

длин в секунду. Сравнивая текущую загруженность хеморецепторов специфическими лигандами с

таковой несколько секунд назад, клетка фактически может "измерить" разницу концентраций

определенного вещества на расстоянии, во много раз превышающем длину самой клетки. Такое

измерение концентрации лиганда во времени возможно за счет адаптивного метилирования

хеморецепторов, которое зависит от загруженности их лигандами. Задержка во времени между

связыванием лиганда и метилированием рецептора представляет собой своеобразную молекулярную

"память", которая и позволяет измерять изменение концентраций лиганда. Если выбранное направление

движения соответствует увеличению концентрации аттрактанта (снижению концентрации репеллента),

время до следующего кувыркания увеличивается. К сожалению, из-за своего малого размера клетка

постоянно сбивается с "верного" пути броуновским движением и поэтому просто не может

продолжительно двигаться прямо. Такой механизм поэтому только в общем обеспечивает движение

- 36 -

движе

ние

аттрактант

переориентация

(a)

без стимула

(b)

со стимулом

Рис. 7.4. Движение E.coli по градиенту аттрактанта за счет контроля продолжительности

вращения жгутиков в одном направлении

бактерии по градиенту концентрации в нужном направлении, но для бактерий является достаточно

эффективным (Рис. 7.4).

Механизм, основанный на переключении направления вращения жгутиков, приводящий к

прямолинейному движению, которое через варьирующие промежутки времени сменяется кувырканием

на месте, не является единственным. У Rhodobacter sphaeroides вращение единственного жгутика

сменяется его полной остановкой, а у Rhizobium meliloti вращение жгутика никогда не прекращается -

изменяется только его скорость. Но во всех этих случаях результат работы сенсорной системы

хемотаксиса один и тот же - если бактерия движется в "нужном" направлении, продолжительность

такого движения увеличивается.

Сенсорный механизм хемотаксиса более сложен, чем рассмотренные нами ранее. Это объясняется

прежде всего двумя причинами. Во-первых, поскольку броуновское движение может очень быстро

изменить ориентацию бактериальной клетки, клетки должны обрабатывать хемотаксические сигналы

очень быстро, и, действительно, от стимула до переключения "моторов" у клетки проходит не более 0.2

секунды. Во-вторых, для правильного сравнения пространственных градиентов клеткам необходимо

такое устройство сенсорного механизма, которое "гасило" бы сенсорную стимуляцию в статических

условиях, т.е. в отсутствии градиента концентрации, как бы много какого-то аттрактанта или

репеллента ни присутствовало бы в среде.

7.3 Белковый аппарат хемотаксиса

Три класса белков участвуют в хемотаксисе: трансмембранные рецепторы, цитоплазматические

сигнальные белки и ферменты адаптивного метилирования.

Рецепторы хемотаксиса

Многие бактерии детектируют хемотаксические стимулы при помощи рецепторов, известных как

метилируемые белки хемотаксиса (methyl-accepting chemotaxis proteins, MCPs). Эти белки являются

мембранными сенсорами, в принципе аналогичными по своей структуре EnvZ, с тем только отличием,

что цитоплазматический сигнальный домен не является автокиназой. Функцию автокиназы выполняет

другой белок - CheA, а сигнальные домены MCP обеспечивают взаимодействие с CheA. Еще одно

отличие от типичного сенсора

- по обе стороны сигнального домена располагаются сайты

метилирования, необходимые для адаптации рецепторов. MCP белки состоят из ок. 550 ак, и явл.

димерами. Хорошо изучены 4 MCP из E. coli, реагирующие на серин (Tsr), аспартат и мальтозу (Tar),

рибозу, глюкозу и галактозу (Trg) и дипептиды (Tap). У сальмонелл нет Tap, но есть сенсор цитрата

- 37 -

Tcp. Серин, аспартат и цитрат связываются

непосредственно с рецепторами, тогда как

сахара и дипептиды сначала связываются с

соответствующими

периплазматическими

белками, а уже эти комплексы взаимодействуют

с рецепторами. Кроме того, MCP реагируют на

изменения температуры и pH, а также являются

рецепторами для различных репеллентов.

Классический рецептор состоит из

• аминоконцевой трансмембранной спирали,

• периплазматического собственно сенсорного

домена,

сложенного

из

четырех

α−спиральных участков,

• второй трансмембранной спирали

• большого цитоплазматического сигнального

и адаптационного домена.

(Aer - сенсор аэротаксиса: типичный для

MCP цитоплазматический домен, но совершенно

другая сенсорная часть, содержащая FAD и

похожая на NifL)

Цитоплазматические домены сенсоров

содержат 4 или 5 остатков глутамата, доступных

для метилирования.

Как внеклеточный стимул транслируется

во внутриклеточный сигнал?

Две модели

Принцип ножниц:

Связывание лиганда дистальными концами

связанных с мембраной спиралей может

индуцировать

значительное

перемещение

трансмембранных сегментов (принцип ножниц).

Рис. 7.5. Рецептор хемотаксиса Tar

В несвязанном с лигандом состоянии

субъединицы рецептора предположительно

взаимодействуют между собой только в области

первого

трансмембранного

сегмента.

Связывание с лигандом вызывает сближение

сенсорных периплазматических субъединиц, что

передается сигнальным субъединицам и

обеспечивает их взаимодействие между собой, а

в таком виде они уже не могут

взаимодействовать с CheA и стимулировать его

автокиназную активность.

Метилирование

создает

стерические

препятствия

для

взаимодействия сигнальных доменов между

собой, что снова позволяет им стимулировать

автокиназную активность CheA.

Принцип пистона:

Сейчас все больще и болще данных

накапливается в пользу другого механизма,

основанного на скольжении трансмембранных

Рис. 7.6. Модель трансмембранной передачи

сегментов (ТМ) друг относительно друга. Самый

сигнала от сенсорного к сигнальному домену

аминоконцевой ТМ1 закреплен в мембране

рецептора

жестко, тогда как второй более подвижен, и при

свявывании лиганда скользит "вниз", т.е. в

- 38 -

сторону цитоплазмы, что и вызывает конформационное изменение цитоплазматического сигнального

домена, инактивирующее его. Вариация на эту тему

- участие двух амфипатических спиралей

линкерного домена в изменении конформации (Рис. 7.6).

Цитоплазматические сигнальные белки и регуляторный механизм хемотаксиса

Взаимодействие между рецепторами и переключателем жгутика осуществляется четырьмя

белками (Рис. 7.7):

♦ CheA - ГК

♦ CheY - РО

♦ CheW - "адаптор" между рецептором и CheA

♦ CheZ - белок, способствующий дефосфорилированию CheY~Ф

Пара белков CheA-CheY представляет

Внешний сигнал

собой

двухкомпонентную регуляторную

систему, которая несколько отличается от

рассмотренных

ранее

"классических"

MCP

2 /e- транспорт?

примеров. Наиболее существенным отличием

является то, что CheY не является

транскрипционным

фактором

и,

Адаптация

Aer

соответственно, у него отсутствует ДНК-

связывающий домен. ГК CheA функционирует

в виде димера, с которым связываются два

W W

мономера CheW, и уже этот комплекс вступает

в ассоциацию с димерным рецептором. В

A A

составе такого комплекса автокиназная

активность резко возрастает, что усиливает

перенос фосфата от CheА~Ф к CheY. CheY~Ф

P Y

связывается

FliM

моторно-

переключательного комплекса базального тела,

что приводит к вращению жгутика по часовой

стрелке. CheZ предотвращает накопление

CheY~Ф,

стимулируя

автофосфатазную

активность CheY.

При

отсутствии

аттрактанта

C-кольцо

внутренняя мембрана

концентрация CheY~Ф поддерживается на

уровне, способствующем вращению жгутика

мотор

пептидогликан

преимущественно по часовой стрелке и,

следовательно, отсутствию упорядоченного

внешняя мембрана

крюк

движения бактерии. Связывание аттрактанта с

рецептором индуцирует конформационное

нить

изменение, которое передается четез мембрану

и подавляет автокиназную активность CheA.

Концентрация CheY~Ф падает, и жгутики

бактерии более продолжительное время

вращаются против часовой стрелки. Поэтому

клетки будут дольше двигаться прямолинейно,

Рис. 7.7. Молекулярный механизм хемотаксиса

если они попадают в среду с более высокой

концентрацией аттрактанта. Однако этот

механизм не объясняет, как клетка может реагировать на постоянно возрастающую концентрацию

аттрактанта. Этой цели служит сенсорная адаптация.

Метилазы хемотаксиса и сенсорная адаптация.

Адаптация сенсорного аппарата достигается путем обратимого метилирования рецепторов, в

котором участвуют два белка

- метилтрансфераза CheR и метилэстераза CheB. Метилирование

рецепторов оказывает действие, противоположное связыванию аттрактанта. Интересно, что

- 39 -

метилирование стимулируется связыванием аттрактанта с рецептором и в конечном итоге нейтрализует

эффект связывания аттрактанта. Однако между связыванием аттрактанта и метилированием рецептора

проходит некоторое время, в течение которого бактерии движутся прямолинейно, что и составляет

основу молекулярной памяти машины хемотаксиса.

CheR - метилтрансфераза, метилирующая остатки глутамата в цитоплазматических доменах MCP

с постоянной скоростью, перенося метил-группу с S-аденозилметионина.

CheB является мишенью для переноса фосфата с CheA~Ф, и CheB~Ф является метилэстеразой,

деметилирующей MCP.

В отсутствие стимула метилирование MCP, осуществляемое CheR, компенсируется удалением

метильных групп фосфорилированным CheB, что поддерживает метилирование MCP на уровне 0.5-1

метильная группа на субъединицу рецептора.

Когда аттрактант связывается с рецептором и ингибирует активность CheA, концентрация

CheB~Ф падает, хотя и более медленно, чем концентрация CheY~Ф, поскольку CheB~Ф не является

субстратом для CheZ. Повышение степени метилирования восстанавливает способность рецептора

стимулировать CheA. Однако, даже после того как базальные уровни CheY~Ф и CheB~Ф

восстанавливаются, связанный с аттрактантом рецептор остается метилированным, поскольку

метилированный рецептор - более плохой субстрат для метилэстеразы CheB~Ф.

Таким образом, с учетом метилирования принцип работы молекулярной машины хемотаксиса

выглядит следующим образом.

• В отсутствие аттрактанта хеморецептор находится в активированном состоянии и его сигнальный

домен активирует киназную активность CheA, что ведет к фосфорилированию CheY, а фосфо-

CheY, взаимодействуя с переключателем мотора, вызывает вращение жгутика по часовой клетке,

что вызывает кувыркание бактерии на месте.

• Связывание аттрактанта инактивирует рецептор, и его сигнальный домен уже не может

стимулировать киназную активность CheA, концентрация фосфо-CheY быстро падает

(что

стимулируется белком CheZ), направление вращения жгутика меняется и бактерия движется

прямолинейно.

• Прямолинейное движение, однако, может прекратиться по двум причинам. Если бактерия начала

двигаться в неблагоприятном направлении, рецептор освобождается, начинается фосфорилирование

CheY, и бактерия снова кувыркается на месте. Кроме того, когда киназа CheA "выключена",

одновременно с дефосфорилированием CheY~Ф происходит дефосфорилирование CheB~Ф, хотя и

с меньшей скоростью (поскольку CheB~Ф не является субстратом для CheZ), что приводит к

повышению степени метилирования рецептора и восстановлению его сигнальной активности.

Поскольку и CheY, и CheB являются свободными цитоплазматическими белками, степень их

фосфорилирования будет зависеть от степени метилирования рецепторов и их загруженности

лигандами. Это делает возможным вместо ответа "все или ничего" плавно регулировать подвижность

бактерий в широком диапазоне концентраций аттрактантов и репеллентов.

Метилирование рецепторов обеспечивает простейшую молекулярную память, позволяющую

бактерии контролировать "правильность" направления движения. Уровень метилирования будет

высоким, если концентрация аттрактанта была высокой некоторое время назад. Когда клетка движется,

она "сравнивает" сиюмоментную концентрацию аттрактанта

(определяемую по степени занятости

рецепторов) с концентрацией в недавнем прошлом

(как зафиксировано степенью метилирования

рецепторов). Если окружающие условия значительно улучшились или ухудшились, активность

гистидинкиназы CheA будет соответственно снижена или повышена, изменяя продолжительность

прямолинейного движения соответствующим образом.

Литература:

1. M.D. Manson, J.P. Armitage, J.A. Hoch, R.M. Macnab. Bacterial locomotion and signal transduction. J.

Bacteriol 1998. 180:1009-1022

- 40 -

8. Утилизация азота

Бактерии могут использовать множество азотсодержащих соединений в качестве источника

клеточного азота - от простейших неорганических (азот, нитрат) до сложных соединений включая

аминокислоты и нуклеозиды.

Аммиак является наиболее предпочтительным источником азота практически для всех бактерий.

Однако бактериям чаще приходится утилизировать альтернативные источники азота, для чего они

синтезируют множество белков, необходимых для транспорта внутрь клетки и последующего

метаболизма азотсодержащих соединений. Синтез, а в некоторых случаях и активность, этих белков

строго контролируются в соответствии с доступностью субстратов.

Практически у всех бактерий глутамат и глутамин служат как основные доноры азота в

биосинтетических реакциях. За образование этих аминокислот практически у всех бактерий отвечают

два фермента. Первый, глутамин синтетаза, продуцирует глутамин из глутамата и аммиака:

NH3 + глутамат + ATP -> глутамин + ADP + Pi,

тогда как второй, глутамат синтетаза, переносит аминогруппу с глутамина на 2-кетоглутарат с

образованием двух молекул глутамата:

глутамин + 2-кетоглутарат + NADPH

-> 2 глутамат + NADP+.

Суммарным результатом этих двух реакций является продукция глутамата из аммиака и 2-

кетоглутарата. Эти реакции катализируются двумя ферментами:

Глутаминсинтетаза (GlnA). Додекамерный фермент, состоящий из 12 идентичных субъединиц

размером 55 кДа. Субъединицы организованы в два шестичленных кольца, лежащих друг на друге и

сдерживаемых гидрофобными взаимодействиями и водородными связями. Активность фермента

регулируется путем аденилирования (которое инактивирует фермент). Аденилирование происходит в

ответ на увеличение внутриклеточной концентрации аммония - чем выше его концентрация, тем больше

субъединиц GlnA инактивировано. Этот процесс катализируется аденилилтрансферазой

(GlnE),

основной функцией которой является преодоление последствий "аммонийного шока", происходящего

при попадании бактерий из бедной азотом среды в богатую. В этих условиях высокая активность

глутаминсинтетазы приводит к переводу практически всего глутамата в глутамин, лишая клетку

необходимой аминокислоты. Аденилилтрансфераза, быстро инактивируя глутаминсинтетазу при

повышении внутриклеточной концентрации аммония, предотвращает это явление.

Глутаматсинтетаза

гетеродимер,

субъединицы

A T P ADP

которого кодируются генами gltBD.

NtrB

H-P

мало азота

Синтез

глутаматсинтетазы

находится под контролем Lrp

PII-UMP UT/UR

PII

(leucine-responsive

regulatory

protein), что приводит к репрессии

много азота

синтеза фермента в богатой среде.

NtrC

D-P

NtrC

Биохимические

генетические механизмы контроля

утилизации азота наиболее изучены

представителей

семейства

Enterobacteriaceae. У этих бактерий

Активация регулона NTR

система регуляции метаболизма

азота

(Рис.

8.1)

кодируется

четырьмя генами:

Рис. 8.1. Регуляция азотного метаболизма белками

glnD,

кодирующим

NtrB и NtrC

уридилтрансферазу/деуридилазу

(UTase/UR),

- 41 -

glnB, кодирующим малый регуляторный белок PII,

ntrB, кодирующим гистидинкиназу, и

ntrC, кодирующим регулятор ответа - транскрипционный энхансер.

Белок NtrB

(продукт гена glnL) является типичной сенсор-киназой, однако, будучи

цитоплазматическим, не имеет мембранного якоря. Цитоплазматическим сигналом, детектируемым

NtrB, является белок PII, который в уридилированной форме сигнализирует о недостатке, а в

немодифицированной форме - об избытке азота.

При нехватке азота NtrB катализирует фосфорилирование и, следственно, активацию регулятора

ответа NtrC. N-концевой домен NtrB является сенсором, взаимодействующим с белком PII, а C-концевой

домен обладает автокиназной активностью, фосфорилируя аминокислотный остаток His-139. Кроме

того, NtrB обладает еще и фосфатазной активностью и может дефосфорилировать NtrC, что зависит от

присутствия немодифицированного PII. Именно фосфатазная, а не киназная активность подвержена

регуляции в данном случае - повышение внутриклеточной концентрации глутамина ведет к усилению

фосфатазной активности NtrB.

NtrC (продукт гена glnG) - димерный (как и NtrB) белок с массой субъединицы 55 кДа. Этот

белок является типичным примером σ54-зависимых активаторов и имеет три четко выраженных домена.

N-концевой домен является "приемником", и именно здесь распложен остаток аспартата,

фосфорилируемый при взаимодействии с NtrB (Asp-54). Только фосфорилированная по Asp-54 форма

белка способна активировать транскрипцию. Фосфорилирование NtrC стимулирует взаимодействие с

ДНК, но не непосредственно связывание, а олигомеризацию димеров NtrC на активаторных

последовательностях. Центральный домен NtrC типичен для σN-зависяших активаторных белков, и

именно этот домен взаимодействует с σN-содержащей РНК-полимеразой (EσN). Домен содержит АТФ-

связывающий сайт и обладает АТФазной активностью, необходимой для формирования открытого

комплекса с EσN. Эта АТФазная активность стимулируется связыванием с ДНК и фосфорилированием

по Asp-54. Связывание NtrC с ДНК обеспечивается C-концевым доменом, который содержит типичный

мотив "спираль-поворот-спираль" (такую структуру мы уже рассматривали на примере репрессора фага

λ). Этот мотив позволяет NtrC связываться с активаторными последовательностями - энхансерами,

обычно расположенными на расстоянии около 100 н.п. перед промоторными последовательностями, с

которыми связывается EσN. Функцией энхансера является способствование олигомеризации димеров

NtrC, необходимой для активации транскрипции. NtrC может также выступать и в роли репрессора,

если сайты его связывания перекрываются с промотором.

У кишечных бактерий подвержены регуляции через NtrC многие гены - glnA ntrBC; гены,

кодирующие транспорт глутамина

(glnHPQ), аргинина

(argT) и гистидина

(hisJQMP); гены,

необходимые для ассимиляции нитрита и нитрата (nasFEDCBA); регуляторные гены фиксации азота

nifLA у K. pneumoniae и nac у K. aerogenes.

Уридилтрансфераза (GlnD). Этот белок отвечает как за присоединение уридинмонофосфата к PII

(GlnB), так и за его отсоединение. Количество внутриклеточного азота отражается на соотношении

концентраций глутамина и 2-кетоглутарата (высокое при избытке и низкое при недостатке азота), что

влияет на активность уридилтрансферазы. Активность этого фермента стимулируется 2-кетоглутаратом

и АТФ и ингибируется глутамином. Следовательно, степень уридилирования PII (GlnB) зависит от

соотношения концентраций глутамина и 2-кетоглутарата.

PII (GlnB). Тримерный белок, способный связывать АТФ, 2-кетоглутарат и глутамат. Связывание

PII с NtrB стимулирует фосфатазную активность NtrB по отношению к NtrC. Для такой стимуляции

NtrB необходимо связать АТФ и

2-кетоглутарат либо глутамат. В условиях азотного голодания 2-

кетоглутарат индуцирует конформационное изменение PII, способствующее его уридилированию. В

условиях же избытка азота уридилтрансфераза связывает глутамин, что блокирует уридилирование и,

наоборот, способствует деуридилированию PII. Уридилированная форма PII неспособна связываться с

NtrB. Неуридилированная форма взаимодействует не только с NtrB, но и с аденилилтрансферазой,

стимулируя ее активность, что ингибирует глутаминсинтетазу.

NtrC в первую очередь активирует RpoN-зависимый промотор оперона glnALG (гены которого

кодируют два регуляторных белка и глутаминсинтетазу). увеличение синтеза регуляторных белков

- 42 -

приводит к увеличению внутриклеточной концентрации NtrC-P, что активирует многие RpoN-

зависимые гены. Одним из таких генов является nac, необходимый для активации транскрипции ряда

генов азотного метоболизма, имеющих σ70-зависимые промоторы.

Литература:

1. M. Buck, M. A. Gallegos, D. J. Studholme, Y. Guo, And J. D. Gralla. The Bacterial Enhancer-Dependent

σ54 (σN ) Transcription Factor. J. Bacteriol. 2000, p. 4129-4136 Vol. 182, No. 15

2. D.J. Studholme, M. Buck. The biology of enhancer-dependent transcriptional regulation inbacteria: insights

from genome sequences. FEMS Microbiol. Lett. 186 (2000) 1-9

9. Кислородный стресс и редокс контроль.

Метаболизм клеток существенно различается в аэробных и анаэробных условиях. В аэробных

условиях клетка может получить гораздо больше энергии, но это не дается ей бесплатно - кислород

окисляет не только источники энергии, но и многие жизненно важные клеточные компоненты. Поэтому

в аэробных условиях в клетке при помощи регуляторов OxyR и SoxR индуцируются белки,

защищающие ее от кислорода, такие как супероксиддисмутаза и каталаза. С другой стороны, клетка

вынуждена существенно перестраивать свой метаболизм если она попадает в бедные энергией

анаэробные условия

- теперь она уже не может себе позволить многие "роскоши". Такая

метаболическая перестройка контролируется регуляторными белками

- гистидиновой сенсорной

киназой ArcB и регулятором транскрипции FNR. Эти два белка контролируют такие разнообразные

процессы, как дыхание и фотосинтез, утилизация углерода и азота. Эти два регулятора реагируют на

разные концентрации кислорода, позволяя точно подстраивать контроль различных генов к условиям

полного или частичного анаэтобиоза.

Активные радикалы: их повреждающее действие и механизм инактивации

Кислородный стресс вызван действием активных кислородных интермедиатов, таких как анион

супероксида (O2•-), перекись водорода H2O2 и гидроксил-радикал HO•, которые способны повреждать

белки, нуклеиновые кислоты и клеточные мембраны (Рис.9.1). Кроме того, повреждающее действие на

клеточные структуры имеют производные этих

активных соединений гипохлорная кислота

(HOCl) и активные азотные интермедиаты -

азотистый оксид

(NO•). пероксинитрит

Ndh II

(HOONO) и нитрозотиолы

(RSNO). Для

предотвращения

повреждений

клетка

SiRase

вынуждена

постоянно

синтезировать

Acn[4Fe-4S]

ферменты,

инактивирующие

активные

H2O2 +.O

радикалы и устраняющие вызванные ими

Fe2+

повреждения.

Acn[3Fe-4S]

H2 O

HO .

Причина окислительного стресса.

Окислительный

стресс

является

неизбежным побочным продуктом аэробного

стиля жизни, поскольку O2•- и H2O2

формируются

каждый

раз,

когда

молекулярный кислород химически окисляет

Рис.9.1. Повреждение макромолекул клетки

переносчики электронов. Особенно активны в

активными формами кислорода

этом

отношении

восстановленные

флавопротеины. У экспоненциально растущих бактерий E. coli O2•- и H2O2 образуются при

автоокислении компонентов дыхательной цепи. Флавин NADH дегидрогеназы II является основным

местом переноса электронов к кислороду. Фумаратредуктаза - терминальная оксидаза, индуцируемая

при анаэробном росте, - очень активно взаимодействует с кислородом и, возможно, является основной

причиной стресса, возникающего при переходе от анаэробных к аэробным условиям. Растущие в

- 43 -

аэробных условиях E. coli производят достаточно супероксиддисмутазы, чтобы поддерживать

концентрацию O2•- на уровне порядка 10-10 M. Это около половины той концентрации, которая могла

бы уменьшить активность жизненно важных ферментов и ингибировать рост. Концентрация H2O2 на

порядок меньше ингибирующей. Таким образом, защитные системы бактериальной клетки

поддерживают концентрацию активных производных кислорода на уровне, лишь слегка более низком,

чем токсичный. Это активно используется растениями, животными, а иногда и другими бактериями для

защиты от своих бактериальных конкурентов

(или патогенов). Например, фагоциты животных

используют NADPH оксидазу, NO• синтазу и миелопероксидазу для того, чтобы бомбардировать

захваченные бактерии O2•-, NO•, HOCl и их производными H2O2, HOONO и RSNO

Механизмы окислительных повреждений клетки.

Наиболее чувствительными к окислительным повреждениям являются различные дегидратазы,

использующие железо-серные кластеры

[4Fe-4S] для связывания и дегидрирования субстратов.

Окисление таких дегидратаз супероксид-ионом вызывает разрушение Fe-S кластеров и потерю

активности. Кроме того, побочным продуктом такого окисления являются многочисленные ионы

железа, высвобождаемые в цитоплазму, где они совместно с H2O2 катализируют окисление ДНК.

H2O2 эффективно окисляет тиолы, поэтому повреждает множество дегидрогеназ, использующих

остатки цистеина в каталитическом центре. Кроме того, взаимодействие H2O2 с ионами Fe2+ дает

сильнейший окислитель HO•

(гидроксил), способный взаимодействовать практически со всеми

биомолекулами, в первую очередь с ДНК, с чем и связана в первую очередь летальность действия H2O2.

(действие активных форм азота)

Защита от окислительного стресса.

Для защиты от окислительного стресса клетка использует целый ряд антиоксидантных ферментов

и систем репарации, большинство которые экспрессируется на низком базальном уровне в нормальных

условиях. При воздействии супероксида и перекиси водорода экспрессия многих антиоксидантных

белков индуцируется, что зависит в основном от действия двух регуляторов - SoxRS и OxyR.

SoxRS регулон

SoxRS в ответ на супероксид регулирует экспрессию не менее

10 белков, включая

супероксиддисмутазу (SodA), участвующую в репарации ДНК эндонуклеазу IV (Nfo) и резистентные к

супероксиду изоформы фумаразы (FumC) и аконитазы (AcnA). Аконитаза конвертирует цитрат в

изоцитрат в цикле Кребса. Это мономер с одним железо-серным центром, который может находиться в

каталитически активной [4Fe-4S] и неактивной (например, из-за окислительного повреждения) [3Fe-4S]

форме. Кроме того, SoxRS обеспечивает увеличение концентрации глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы

(Zwf), что усиливает восстановительную силу клетки, и увеличение количества репрессора метаболизма

железа Fur, что снижает поглощение железа и, следовательно, снижает выработку гидроксила.

Индукция регулона происходит в два этапа. Сначала редокс-сенсорный белок SoxR под влиянием

супероксид-иона индуцирует транскрипцию soxS, а затем уже SoxS непосредственно активирует гены-

мишени, связываясь с их промоторными областями. Конститутивно экспрессируемый белок SoxR (Рис.

9.2)

- димер, каждая из субъединиц которого содержит по одному стабильному [2Fe-2S] центру.

Окисление восстановленной формы [2Fe-2S]+ в форму [2Fe-2S]2+ приводит к активации SoxR. Какая

молекула вызывает окисление

SoxR, пока неясно. Возможно,

это делает сам супероксид-ион.

Только окисленная форма

SoxR

может

активировать

транскрипцию soxS, однако

восстановленная SoxR форма

обладает той же аффинностью к

ДНК. Следовательно, окисление

Рис.9.2. Активация транскрипции белком SoxR

регулятора должно каким-то

образом

изменять

его

взаимодействие

ДНК.

- 44 -

Интересным является то, где SoxR связывается с регуляторной областью - между сайтами -10 и -35

промотора, что очень необычно для активатора транскрипции. Кроме того, расстояние между этими

сайтами слишком большое для активного промотора - 19 н.п. Скорее всего, промоторная область soxS

одновременно оказывается занятой РНК-полимеразой и SoxR, расположенными по разные стороны

ДНК, а окисление SoxR каким-то образом помогает РНК-полимеразе образовать открытый комплекс на

нестандартном промоторе.

Гены soxS и soxR расположены рядом друг с другом, транскрибируются в противоположные

стороны, причем их промоторные области перекрываются.

OxyR регулон

Другой транскрипционный фактор, OxyR, в ответ на H2O2 активирует синтез примерно 30 белков

(четко показан контроль через OxyR только для 9 из них), в том числе каталазы (гидропероксидазы I,

KatG), двух субъединиц алкилгидропероксид редуктазы (AhpCF), глутаредоксина (GrxA), глутатион

редуктазы (GorA), Mn-супероксиддисмутазы и Fur-репрессора. Регулируемые OxyR неспецифический

ДНК-связывающий белок Dps (DNA-binding protein from starved cells) и регуляторная РНК OxyS

защищают от мутагенеза. Активируется также синтез ряда генов теплового шока и регулятора синтеза

капсульных полисахаридов.

Ген oxyR кодирует небольшой 34 kDa белок, примадлежащий к семействы LysR-подобных

регуляторов. Как и большинство регуляторов этого семейства, OxyR негативно контролирует свой

собственный синтез, причем как в присутствии H2O2, так и в ее отсутствии. Такая регуляция

поддерживает количество белка на постоянном уровне. OxyR также активирует транскрипцию

соседнего, транскрибируемого в противоположном направлении, гена oxyS, продуктом которого

является небольшая нетранслируемая РНК, влияющая на экспрессию целого ряда генов.

Тетрамер OxyR существует в двух формах - окисленной и восстановленной, но только окисленная

форма активирует транскрипцию, связываясь с карбоксиконцевым доменом α-субъединицы РНК-

полимеразы (Рис. 9.3). H2O2 непосредственно окисляет OxyR, приводя к образованию дисульфидной

связи между двумя цистеиновыми остатками одной субъединицы OxyR. Образование этой

дисульфидной связи вызывает конформационное изменение, которое влияет на связывание с ДНК.

Восстановление

(и, следовательно, инактивация) OxyR осуществляется глутаредоксином

(тиол:дисульфид оксидоредуктазой, использующей восстановленный глутатион и NADH в качестве

восстановителей), а поскольку

глутаредоксин, также как и

глутатионредуктаза, находятся под

контролем OxyR, получается, что

OxyR сам активирует экспрессию

Рис.9.3. Активация транскрипции белком OxyR

ферментов, необходимых для его

восстановления, т.е. инактивации. .

Адаптация к анаэробиозу.

Основные регуляторы - FNR (fumarate and nitrate reduction) и ArcA (aerobic respiratory control)

Оба белка являются транскрипционными факторами, активирующимися в анаэробных условиях и

инактивирующихся при взаимодействии с кислородом. FNR детектирует кислород непосредственно

через редокс-чувствительный Fe-S кластер, входящий в его структуру, тогда как активность ArcA

зависит от его фосфорилирования, контролируемого мембранной гистидинкиназой ArcB. В отличие от

FNR ArcB не детектирует содержание кислорода непосредственно, а реагирует на общее состояние

клетки. В связи с этим два регулятора реагируют на различные концентрации кислорода и

контролируют разные, но частично перекрывающиеся наборы генов. Это позволяет бактерии быстро и

эффективно приспосабливаться к широкому диапазону концентраций кислорода.

FNR как сенсор кислорода

FNR - глобальный регулятор, контролирующий экспрессию более 120 генов у E. coli. Белок был

идентифицирован путем изоляции мутантов, неспособных восстанавливать нитрат и фумарат. Позже

было показано, что белок отвечает за индукцию в анаэробных условиях таких ферментов цикла Кребса

как сукцинат дегидрогеназа, фумараза, изоцитрат дегидрогеназа, участвующих в производстве энергии

- 45 -

путем окислительного фосфорилирования. FNR также активирует экспрессию ферментов анаэробного

дыхания, которые используют альтернативные конечные акцепторы электронов, такие как DMSO,

фумарат или нитрат. Помимо активации экспрессии необходимых в анаэробных условях белков FNR

также репрессирует такие аэробные респираторные ферменты как цитохромоксидаза и NADH

дегидрогеназа.

Интересно то, что по аминокислотной последовательности FNR похож на БАК. Mеханизм

активации транскрипции обеими белками тоже одинаков - оба активируют транскрипцию, контактируя

с α-субъединицей РНК-полимеразы. Единственным существенным отличием FNR является

дополнительный участок на амино-конце этого белка, несущий ферредоксинообразный кластер из

четырех цистеиновых остатков (Cys-X3-Cys-X2-Cys-X5-Cys), что привело к предположению о детекции

кислорода при помощи железо-серных кластеров.

При взаимодействии с кислородом два [4Fe-4S]2+ кластера димера FNR быстро (за пару минут)

превращаются в два [2Fe-2S]2+ кластера, причем железо остается связанным с окисленным FNR, скорее

всего в виде сульфида (Рис. 9.4). Если клетку быстро вернуть в анаэробные условия, [2Fe-2S]2+ центры

быстро возвращаются в исходное [4Fe-4S]2+ состояние. Однако более продолжительная инкубация в

присутствии кислорода ведет уже к необратимому разрушению центров [2Fe-2S]2+, давая апобелок,

полностью лишенный железа. FNR активен как транскрипционный фактор только в форме гомодимера,

для

образования

которого

необходимо

присутствие

интактных

[4Fe-4S]2+ кластеров.

Преобразование

кубической

структуры

[4Fe-4S]2+ в плоскую

[2Fe-2S]2+ при окислении белка в

аэробных условиях оказывается

достаточным

для

внесения

существенных конформационных

изменений,

вызываэщих

Рис.9.4. Репрессия транскрипции белком FNR

диссоциацию димера FNR на

мономеры, что предотвращает

связывание белка с ДНК.

Широкий диапазон концентраций кислорода детектируется клетками E. coli.

Анаэробное дыхание у этой бактерии происходит в диапазоне концентраций кислорода 1-5 µМ

(при наличии соответствующих акцепторов электронов), при более низкой концентрации бактерия

переключается на брожение. Именно в этом диапазоне концентраций и происходит переход FNR из

неактивной в активную форму.

ArcB

реагирует на изменения концентрации кислорода на границе микроанаэробной и анаэробной зоны

(5-10

µМ). Этот белок скорее всего реагирует на изменения электронтранспортной цепи

(трансмембранного протонного потенциала или же степени окисления какого-то переносчика

электронов). Вторым сигналом, на который может реагировать ArcB, является концентрация

анаэробных метаболитов.

ArcB работает в паре с РО ArcA (Рис.

ArcB

9.5). На сегодняшний день регулон ArcA

насчитывает более

30 генов, кодирующих

His

Asp

His

Asp

ArcA

ферменты цикла Кребса

(флавопротеиновые

дегидрогеназы, цитохромоксидазы и т.д.),

ATP ADP

глиоксилатного шунта и деградации жирных

Asp

OmpR

кислот. Регуляция в основном заключается в

репрессии при анаэробиозе синтеза ферментов

ArcA

Asp

SixA

аэробного дыхания, хотя ArcA также

Asp

CheY

активирует

несколько

генов

микроанаэробных условиях.

Рис.9.5. Двухкомпонентная регаляторная

ArcB имеет существенное сходство с

система ArcA/ArcB

компонентами сенсорных систем. В его состав

- 46 -

входят: классический гистидинкиназный домен, центральный домен, сходный с регуляторным доменом

РО, и небольшой HPt домен на карбокси-конце. Фосфат может передаваться на ArcA с любого из

фосфорилириванных гистидиновых остатков в составе ArcB - и из автокиназного, и из HPt домена.

Причем имеются данные, что для реакции на анаэробные метаболиты достаточно только автокиназного

домена, тогда как для "определения" состояния электронтранспортной цепи важен HPt домен.

Аэротаксис

Флавопротеин AerA является мембранным рецептором, отвечающим за аэротаксис. Амино-

концевой домен этого белка похож на редокс-сенсоры фиксации азота у Azotobacter, а карбокси-

концевой - на сигнальный домен белка Tsr - серинового рецептора хемотаксиса. Для обеспечения

аэротаксиса необходимо взаимодействие AerA только с CheY, CheA и CheW, таким образом, AerA -

типичный сенсор хемотаксиса, детектирующий концентрацию кислорода.

В защите от активного кислорода участвуют также еще несколько белков, не контролируемых

SoxRS и OxyR.

Взаимосвязь между окислительным стрессом и другими регуляторными системами.

Еще несколько транскрипционных регуляторов участвуют в контроле экспрессии

антиоксидантных генов. Например, RpoS индуцируется, когда клетки подвергаются различным

стрессам, включая голодание, осмотический шок, кислотный шок и стационарную фазу. Клетки,

активно экспрессирующие RpoS, устойчивы к целому ряду стрессовых воздействий, включая высокие

концентрации перекиси водорода. RpoS контролирует экспрессию целого ряда антиоксидантных генов,

включая katE, xthA и sodC. Члены OxyR- регулона katG, gorA и dps также подвержены регуляции через

RpoS.

Анаэробные регуляторы FNR и ArcAB также модулируют экспрессию генов sodA, sodC, acnA и

fumC. Кроме того, два гомолога белка SoxS, MarA и Rob, регулируют экспрессию практически всех

генов регулона SoxRS. Наконец, экспрессия одного транскрипционного фактора, Fur, контролируется

как SoxRS, так и OxyR.

Литература:

1. G. Storz, J.A. Imlay. Oxidative stress. Current Opinion in Microbiology 1999, 2:188-194

2. C.E. Bauer, S. Elsen, T.H. Bird. Mechanisms for redox control of gene expression. Annu. Rev. Microbiol.

1999. 53:495-523

Подробная информация об основных регуляторах - SoxRS, FNR, OxyR, ArcB и других

3. G. Sawers. The aerobic/anaerobic interface. Current Opinion in Microbiology 1999, 2:181-187

Акцент на адаптацию к анаэробным и микроаэробным условиям. Роль FNR и ArcB.

10. Деление бактериальной клетки и его регуляция

10.1. Аппарат деления клетки Escherichia coli

Образование клеточной перегородки (септы) катализируется рядом жизненно важных белков,

которые путем самосборки образуют кольцевую структуру (септосома или дивисома) в месте

будущего деления. Сборка этой структуры происходит последовательно и инициируется белком FtsZ -

структурным и функциональным аналогом эукариотических тубулинов.

Важным моментом деления является выбор правильной позиции для сборки септосомы

Ингибитор клеточного деления MinCD блокирует сборку септосомы, а другой белок, MinE, образует

кольцо в середине клетки, которое защищает будущий сайт деления от действия ингибитора.

Деление тесно координировано с другими клеточными процессами, прежде всего с репликацией

хромосомы, однако механизмы, управляющие такой координацией, исследованы недостаточно. В

последнее время много внимания уделяется двум специальным случаям клеточного деления, связанным с

дифференциацией клеток, - полярному делению при спорообразовании (у B. subtilis) и делению у

Caulobacter crescentus (которое всегда приводит к образованию двух морфологически различающихся

клеток). У C. crescentus показано существование белка (CtrA), контролирующего как репликацию

- 47 -

РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА. Курс лекций - часть 3