РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА. Курс лекций

1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ

ИНФОРМАЦИИ. РЕГУЛЯЦИЯ НА УРОВНЕ ТРАНСКРИПЦИИ

1.1 ОПЕРОННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ

lac оперон

1.2 КАК РАБОТАЮТ РЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ?

Связывание регуляторных белков с ДНК

1.3 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ С РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ

1.4 АРАБИНОЗНЫЙ ОПЕРОН

1.5 ТРИПТОФАНОВЫЙ ОПЕРОН

Аттенуация

1.6 РЕГУЛЯЦИЯ НА СТАДИИ ТЕРМИНАЦИИ. АНТИТЕРМИНАЦИЯ

2. ФОСФОТРАНСФЕРАЗНАЯ СИСТЕМА

Катаболитная репрессия

bgl оперон - ФТС и антитерминация

3. АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ СИГМА-ФАКТОРЫ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

σ-факторы бактериофагов. Каскадная регуляция экспрессии генов

rpoS

rpoE

4. ТЕПЛОВОЙ ШОК, ФОЛДИНГ И ДЕГРАДАЦИЯ БЕЛКОВ

Молекулярные шапероны

АТФ-зависимые протеазы

5. ХОЛОДОВОЙ ШОК

6. СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ

ДВУХКОМПОНЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ

СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ГИСТИДИНОВЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ

Каталитическое киназное ядро

HPt-домены

Сенсорный домен

Линкерный домен

СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ РЕГУЛЯТОРОВ ОТВЕТА

Активности и структура

Регуляторный домен

Эффекторный домен

АКТИВАЦИЯ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕМ

АРХИТЕКТУРА РЕГУЛЯТОРНЫХ СИСТЕМ

Фосфотрансляционные системы

РЕГУЛЯТОРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ

Регуляция активности ГК

Регуляция дефосфорилирования РО

Другие способы регуляции

7. ХЕМОТАКСИС

7.1 УСТРОЙСТВО И ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ ДВИГАТЕЛЬНОГО АППАРАТА БАКТЕРИЙ

Регуляция синтеза жгутикового аппарата

7.2 ЧТО ТАКОЕ ХЕМОТАКСИС И КАК ОН РЕАЛИЗОВАН У БАКТЕРИЙ?

7.3 БЕЛКОВЫЙ АППАРАТ ХЕМОТАКСИСА

- II -

Рецепторы хемотаксиса

Как внеклеточный стимул транслируется во внутриклеточный сигнал?

Цитоплазматические сигнальные белки и регуляторный механизм хемотаксиса

Метилазы хемотаксиса и сенсорная адаптация

8. УТИЛИЗАЦИЯ АЗОТА

9. КИСЛОРОДНЫЙ СТРЕСС И РЕДОКС КОНТРОЛЬ

АКТИВНЫЕ РАДИКАЛЫ: ИХ ПОВРЕЖДАЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ И МЕХАНИЗМ ИНАКТИВАЦИИ

Причина окислительного стресса

Механизмы окислительных повреждений клетки

ЗАЩИТА ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА

SoxRS регулон

OxyR регулон

АДАПТАЦИЯ К АНАЭРОБИОЗУ

FNR как сенсор кислорода

ArcB

10. ДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ

РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА У CAULOBACTER CRESCENTUS

11. СПОРУЛЯЦИЯ У BACILLUS SUBTILIS

Морфология споруляции

Как принимается решение о начале споруляции?

Роль активаторов транскрипции на разных стадиях споруляции

12. МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ КОММУНИКАЦИИ. QUORUM SENSING

Синтез АГСЛ

Регуляция синтеза экзоферментов у Erwinia

Роль АГСЛ-сигналов в экологии бактериальных популяций. Кросс-сигналы (и ингибирование

антибиотиками)

13. СЕКРЕЦИЯ БЕЛКОВ

СЕКРЕТОРНЫЙ АППАРАТ ПЕРВОГО ТИПА

СЕКРЕТОРНЫЙ АППАРАТ ВТОРОГО ТИПА (GSP)

Sec система

Основная терминальная ветвь GSP

Регуляция GSP

СЕКРЕТОРНЫЙ АППАРАТ III ТИПА

1.1.Специфика аппарата секреции III типа и его компоненты

1.2. Субстраты аппарата секреции III типа

1.3. Организация и регуляция генов, кодирующих белки аппарата секреции III типа

Секреторные шапероны

СЕКРЕТОРНЫЙ АППАРАТ IV ТИПА

14. СТРОГИЙ ОТВЕТ

15. SOS ОТВЕТ

SOS-мутагенез

16. РЕГУЛЯЦИЯ СТАБИЛЬНОСТИ МРНК

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ РНКАЗЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ДЕГРАДАЦИИ МРНК

РНКаза Е

РНКаза III

- III -

1. Основные принципы регуляции экспрессии генетической информации.

Регуляция на уровне транскрипции

Несмотря на кажущуюся простоту организации, клеткам прокариот необходимо иметь не менее, а,

скорее, более сложные, чем у многих эукариот, системы контроля основных жизненных функций. И это

не удивительно, если принять во внимание тот факт, что каждая клетка бактерий является полноценным

организмом, полностью самодостаточным, тогда как клетки большинства многоклеточных организмов

входят в состав специализированных тканей и, следовательно, выполняют только какую-то часть

жизненно важных для организма функций.

Клетки микроорганизмов находятся в непосредственном контакте с окружающей средой, зачастую

на наш взгляд весьма далекой от оптимальной для поддержания жизни. Условия среды не являются

постоянными, следовательно, бактерии должны обладать способностью либо быть всегда готовыми ко

всем подстерегающим их неожиданностям, либо “подстраиваться” к изменяющимся условиям. Иными

словами, принципиально возможны две стратегии существования в изменяющихся условиях. Первая -

постоянно быть во всеоружии, держа наготове все функции, которые когда-либо могут пригодиться. В

таком случае значительная часть ресурсов организма большую часть времени будет расходоваться

впустую на поддержание функций, не нужных в настоящий момент. Вторая стратегия - “включать”

определенные функции только тогда, когда они необходимы. Как вы уже, наверное, знаете, именно

такой подход используется живыми организмами в большинстве случаев. Такая стратегия, на первый

взгляд, должна приводить к значительной экономии ресурсов организма. Однако при таком подходе

возникает необходимость в системах детекции сигналов и регуляции метаболизма, обеспечивающих

максимально быстрое “включение” соответствующих метаболических путей в ответ на изменение

условий среды и их “отключение”, как только в соответствующих функциях отпадет необходимость.

Если такие системы были бы слишком сложными, организм должен был бы слишком много ресурсов

расходовать на поддержание соответствующего генетического аппарата, экспрессию необходимых

регуляторных белков и т.д., что свело бы на нет всю экономию.

Как видите, жизнь простых организмов не так уж и проста, и этот курс лекций как раз и пытается

показать, как микроорганизмы решают свою основную проблему

- регуляцию метаболизма в

меняющихся условиях среды.

Поскольку основную функциональную нагрузку при взаимодействии любого организма с внешней

средой несут белки (либо непосредственно, либо посредством своих ферментативных активностей), а

информация о структуре и количестве белков кодируется генетическим аппаратом клетки,

возможности для регуляции имеются на всем пути экспрессии кодируемой организмом информации.

Иными словами, регуляция возможна как на пути от ДНК к РНК (при транскрипции), так и от РНК к

белку (при трансляции). В обоих случаях экономия ресурсов организма достигается за счет выключения

очень энергоемких процессов биосинтеза макромолекул - белка либо РНК (и, следовательно, белка).

Кроме того, возможна также регуляция на уровне белков (как правило, аллостерических ферментов,

меняющих свою активность при взаимодействии с низкомолекулярными веществами, напр., конечными

продуктами какого-то биосинтетического пути). Здесь происходит экономия энергии при

ингибировании энергоемких ферментативных реакций.

схема: уровни регуляции (действительно нужен простой рисунок):

I- дотранскрипционный (метилирование ДНК) - cell cycle; спирализация хроматина у эукариот

II - транскрипционный:

а) инициация (промоторы+регуляторные белки)

б) терминация (аттенуация и антитерминация)

III - посттранскрипционный:

а) стабильность мРНК (rpoS)

б) инициация трансляции (cold shock)

IV - посттрансляционный: регуляция метаболизма посредством белок-белковых взаимодействий и

модификации белков; аллостерическая регуляция (хемотаксис)

- 1 -

A priori можно предположить, что именно регуляция на стадии инициации транскрипции будет

наиболее эффективной - регуляция на начальных этапах длинного пути экспрессии генетической

информации явно приведет к наибольшей экономии ресурсов клетки. Наверное, именно поэтому

транскрипционная регуляция является на настоящий момент наиболее изученной (хотя, скорее всего,

этот уровень регуляции действительно наиболее часто используется клеткой). С нее мы и начнем.

1.1 Оперонная организация бактериальных генов

Исторически сложилось так, что первые работы по регуляции метаболизма были сделаны при

изучении утилизации лактозы бактериями Escherichia coli. Для описания лактозного метаболизма

Жакоб и Моно в 1961 г. ввели термин "оперон". Оперон, как вы помните, представляет собой группу из

двух или более структурных генов (иногда говорят и о моноцистронных, т.е. содержащих один ген,

оперонах), кодирующих тесно связанные между собой функционально белки, совместно

транскрибируемых и находящихся под общим контролем. Такой контроль осуществляется продуктом

регуляторного гена, действие которого осуществляется через оператор находящийся в

непосредственной близости к промотору. Как промотор, так и оператор являются короткими (пару

десятков нуклеотидов) последовательностями ДНК, предшествующими контролируемым структурным

генам.

Рассмотрим структуру абстрактного оперона подробнее. Он состоит из следующих элементов:

1. Промотор - участок ДНК, с которым происходит связывание РНК-полимеразы и который

определяет точку начала транскрипции. Типичный пример - TTGACA - 17 bp - TATAAT. В зависимости

от типа промотора (а точнее, от типа распознающей его сигма - субъединицы РНК полимеразы)

конкретная последовательность промотора варьирует.

2. Operator - участок связывания регуляторного белка. Размер - около 20 bp. Располагается в

непосредственной близости к промотору или же перекрывается с ним. В случае негативных

регуляторов, или репрессоров, оператор, как правило, располагается непосредственно за промотором,

или перекрывается с ним. В случае позитивных регуляторов

(активаторов) оператор обычно

располагается перед промотором. В любом случае связывание регуляторного белка с оператором

меняет частоту инициации транскрипции. У многих (возможно, у большинства) оперонов имеется не

один, а несколько сайтов связывания с регуляторными белками, которые не обязательно располагаются

рядом и могут вообще находиться по разные стороны от промотора. В этих случаях термин "оператор" в

классическом смысле становится неудобным, в связи с чем сейчас чаще просто говорят о сайтах

связывания регуляторов.

3. Структурные гены. Кодируют белки, непосредственно производящие фенотипический эффект.

Именно для контроля их экспрессии, собственно, и существуют оперонные структуры вместе со своими

регуляторами.

4. Терминатор транскрипции. Здесь заканчивается синтез мРНК.

Не входит в оперон, но является необходимой частью регуляторной системы ген-регулятор,

кодирующий регуляторный белок, связывающийся с оператором. Ген-регулятор может находиться

рядом с контролируемым им опероном, но часто располагается совсем в другом участке хромосомы.

Почти всегда у гена-регулятора свой промотор и терминатор.

В регуляции участвуют, как правило, и низкомолекулярные вещества-эффекторы, являющиеся

либо индукторами, либо корепрессорами структурных генов.

В зависимости от влияния на их работу низкомолекулярных молекул-эффекторов различают

индуцибельные и репрессибельные

(-руемые) опероны. В зависимости от эффекта связывания

регуляторного белка с оператором опероны могут иметь негативный или позитивный контроль. Т. о.,

можно выделить четыре типа оперонов:

(ТИПЫ ОПЕРОНОВ)

(принципы работы в каждом случае)

lac оперон

lacZ - гидролиз до глю и гала

lacY - галактозидпермеаза

- 2 -

lacA - галактозидтрансацетилаза

без лактозы - следовые колич трех белков

с лактозой к-во стр белков увеличивается в 1000 раз.

ген-регулятор лактозного оперона - lacI, - кодирует белок-репрессор. В активной форме это

тетрамер. Клетки с инактивацией lacI конститутивны по синтезу всех трех ферментов.

Если в клетке появляется индуктор, он конкурирует с оператором за молекулы репрессора.

Связывание индуктора с репрессором освобождает оператор и позволяет РНК-полимеразе начать

транскрипцию. В качестве индуктора может выступать лактоза (вернее, аллолактоза) и еще несколько

сахаров и их неметаболизируемых аналогов. Даже в отсутствие индуктора базовая активность

галактозидпермеазы достаточна, чтобы обеспечить транспорт индуктора в клетку.

Однако одно только снятие репрессии недостаточно для обеспечения наблюдаемого

тысячекратного увеличения транскрипции генов оперона. Как оказалось, lac-оперон находится также и

под влиянием позитивной регуляции. Непосредственно перед промотором lac-оперона располагается

сайт связывания с активаторным белком CAP (Catabolite Activator Protein, CRP) или БАК (БРЦ).

Связывание этого белка со своим оператором приводит к усилению транскрипции оперона. CAP

является апоиндуктором, и для связывания с ДНК должен образовать комплекс с цАМФ. Комплекс

CAP-cAMP играет роль в явлении, называемом катаболитной репрессией или глюкозным эффектом.

Суть этого явления, которое мы будем более детально рассматривать позднее, заключается в том, что в

присутствии глюкозы утилизация целого ряда источников углерода (в т.ч. и лактозы) ингибируется.

Причиной этого является снижение концентрации цАМФ, и следовательно, комплекса CAP-cAMP,

активирующего транскрипцию.

Диауксия

1.2 Как работают регуляторные белки?

Связывание регуляторных белков с ДНК

Чтобы понять действие регуляторного механизма, необходимо знать, как происходит

взаимодействие белка-регулятора с оператором.

Вспомните структуру ДНК.

- большой и малый желобки

- Атомы, лежащие вдоль краев пар оснований "смотрят" в эти желобки. Каждой паре оснований

соответствует свой набор химических групп, который может узнавать белок.

(это не те группы,

которые участвуют в комплементарном спаривании оснований). Все ДНК-связывающие белки имеют

выступы, встраивающиеся в большой

(как правило) желобок и "читающие" последовательность

оснований ДНК.

1. Оператор. Все о. почти симметричны (палиндромы). Разные сайты, взаимодействующие с

одним и тем же белком, сходны, но не идентичны. Различия в последовательности обеспечивают

различное сродство белков к различным операторным сайтам.

2. Репрессор. Репрессор обязан иметь ДНК-связывающий домен. В одном из наиболее

распространенных случаев его основу составляют две α-спирали, расположенные под углом друг к

другу т.о., что одна из спиралей ложится в большую бороздку ДНК. Кроме того, часть белков имеет на

N-конце гибкую "руку", охватывающую молекулу ДНК со стороны, противоположной узнающей

спирали. Т.о., белок может прочно связаться с ДНК только в том случае, если имеется соответствие

между боковыми цепями АК узнающей альфа-спирали и функциональными группами ДНК,

экспонированными в большой желобок. Очень часто ДНК-связывающие белки имеют второй домен,

отвечающий за димеризацию белка. При наличии таких доменов сила связывания репрессора с ДНК

резко возрастает. Именно поэтому операторы имеют структуру палиндрома - с каждой половиной

оператора взаимодействует одна молекула белка, причем связывание одной молекулы ускоряет

- 3 -

связывание второй, в результате сила связывания регуляторного белка с оператором возрастает. Такое

явление называется кооперативностью. Более того, зачастую операторные сайты располагаются рядом,

и тогда связывание одного димера белка может кооперативно способствовать связыванию второго

димера.

Результатом кооперативного связывания является сигмоидная кривая зависимости эффективности

транскрипции от концентрации репрессора (или активатора). Это обеспечивает легкость переключения

регуляторной системы из одного состояния в другое.

Каков же результат связывания регуляторного белка с оператором? В случае репрессоров такое

связывание либо создает стерическое затруднение для связывания РНК-полимеразы с промотором либо

препятствует дальнейшему продвижению РНК-полимеразы в тех случаях, когда оператор расположен

после промотора. В случае активаторов возможны несколько механизмов:

- непосредственное взаимодействие активатора с полимеразой, обеспечивающее более сильное

связывание с промоторной областью;

облегчение локального расплетания ДНК в области промотора (необходимого для инициации

транскрипции) либо за счет внесения изгиба в ДНК либо за счет увеличения отрицательной

суперскрученности.

Тщательный анализ ряда оперонов E. coli показал, что часть белков, первоначально описанных как

репрессоры, может работать и активаторами (и наоборот). Два классических примера - cI и БАК.

Различный эффект связывания одного и того же белка с промоторной областью объясняется просто.

Репрессия происходит при связывании белка там, где он может предотвратить связывание РНК-П или

активатора. Для оказания же активаторного действия белок должен обладать способностью связываться

с РНК-П (обычно это слабое, но специфическое связывание) и иметь сайт связывания с ДНК в

непосредственной близости к промотору.

Lac репрессор

тетрамер

кооперативное связывание с двумя операторами

10 копий на клетку

4000 мутантов JH Miller'a

Gal репрессор

димер

похож на LacI, но короче с С-конца (участвующего в формировании тетрамера у LacI)

для репрессии необходимо связывание двух димеров Gal репрессора и гистоноподобного белка

HU между ними.

Почему димер?

1.3 Взаимодействие регуляторных белков с РНК-полимеразой

Бактериальные промоторы содержат специфические элементы, распознаваемые холоферментом

РНК-полимеразы. Гексамеры -10 и -35 распознаются специфическими поверхностями областей 2 и 4 σ-

субъединицы РНК-полимеразы. Как правило, одних этих гексамеров оказывается недостаточно.

Расположенные выше элементы входят в контакт с карбокси-концом α-субъединицы РНК-полимеразы.

Некоторые промоторы, к тому же, имеют расширенный

-10 элемент, контактирующий с

дополнительным районом области 2 σ-субъединицы РНК-полимеразы. Разные промоторы имеют

различные комбинации этих элементов, и в ряде случаев узнавания этих дополнительных

последовательностей оказывается достаточно для полноценного связывания РНК-полимеразы, но в

большинстве случаев для нормальной инициации транскрипции необходимо присутствие активатора.

Активатор может быть необходим для начального связывания РНК-полимеразы с промотором, для ее

изомеризации из закрытого в открытый комплекс, либо для освобождения промотора

(начала

собственно транскрипции).

Две модели были предложены для объяснения действия активаторов. В соответствии с первой из

них активатор вступает в непосредственный контакт с РНК-П. Вторая модель предполагает отсутствие

непосредственного контакта с РНК-П; по этой модели активатор изменяет конформации промоторной

ДНК, облегчая инициацию транскрипции. Вторая модель довольно часто привлекалась для объяснения

- 4 -

механизма действия БАК, но в настоящее время большинство фактов свидетельствует в пользу первой

модели даже для этого белка.

В соответствии с местом контакта активатора с РНК-

(a)

RNAP

П активаторы можно подразделить на следующие группы

(Рис. 1.1.)

a NTD

b/b'

σ70

Контактирующие с карбокси-концом α-субъединицы

a CTD

РНК-П (αCTD)

-35

-10

Наиболее изученным представителем этого класса

является БАК. Сайт связывания для этого белка

располагается перед -35 последовательностью. Интересно,

(b)

что сайты связывания активаторов этого класса

располагаются на различных расстояниях от промотора.

a NTD

b/b'

Это объясняется структурой αCTD. Эта субъединица РНК-

s 70

полимеразы состоит из двух доменов, соединенных между

a CTD

собой гибким линкером. N-концевой домен контактирует с

сайт связывания

-35

-10

другими субъединицами РНК-полимеразы и поэтому

активатора

жестко зафиксирован, тогда как αCTD достаточно

подвижен и поэтому может контактировать с

(c)

активаторами, удаленными на различное расстояние.

a CTD

a NTD

Естественно, это возможно, только если активатор

b/b'

контактирует с ДНК с той же стороны, что и РНК-П.

s 70

Region 4

Поэтому БАК может активировать транскрипцию,

связываясь с ДНК в области -61 (как у lac промотора), либо

-35

-10

в позициях -71, -81, -91.

Какова же роль αCTD в этих процессах?

Эксперименты с замещением аминокислотных остатков

(d)

показывают, что для активации необходима ДНК-

a NTD

b/b'

связывающая поверхность, а также некоторые основания,

s 70

необходимые для взаимодействия с конкретным

a CTD

Region 4

активатором. Какова же роль такого взаимодействия? В

экспериментах по замещению αCTD карбокси-концевым

-35

-10

доменом репрессора фага λ (cI) было показано, что такая

гибридная cI-α субъединица способна обеспечивать

активацию

промотора

при

взаимодействии

Рис. 1.1. Контакты активатора

полноразмерным cI на промоторе с сайтом связывания с cI.

транскрипции с РНК-полимеразой

Поскольку структура cI совершенно отлична от таковой

αCTD, это свидетельствует о том, что любой дополнительный контакт с промоторной областью

способен усиливать транскрипцию, не изменяя локальной структуры ДНК.

Активаторы, контактирующие с σ70-субъединицей РНК-полимеразы

А точнее, с ее областью 4. Наиболее изучен пример белка cI бактериофага λ. В качестве

активатора этот белок связывается с сайтом, перекрывающимся с -35 элементом промотора PRM. В

отличие от предыдущего класса активаторов позиция сайта связывания в данном случае определяется

достаточно жестко (поскольку позиция σ70 по отношению к промотору тоже жестко фиксирована).

Активаторы, контактирующие с другими областями РНК-полимеразы

Принцип действия рассмотренных выше примеров активаторов основан на стабилизации уже

существующих контактов с ДНК двух поверхностей РНК-П. Это наиболее простой путь, но имеются

примеры и контактов активаторов с другими участками ( и субъединицами) РНК-П. Тот же БАК

контактирует с N-концевым доменом α-субъединицы в тех случаях, когда сайт связывания

перекрывается с областью -35 промотора. Белок DnaA активирует промотор PR фага λ за счет

контактов с β' субъединицей РНК-П.

Активаторы, имеющие два контакта с РНК-П.

- 5 -

В тех случаях, когда активатор связывается с областью -35 промотора, αCTD не может образовать

контакт с ДНК в обычном месте и смещается выше. В некоторых случаях в такой позиции возможно

образование дополнительного контакта αCTD с активатором. Примером активатора, образующего

такой двойной контакт, является FNR (активатор экспрессии фумарат редуктазы и нитрат редуктазы). В

случае этого белка одна субъединица его димера контактирует с σ-фактором РНК-П, а другая

субъединица контактирует со смещенным αCTD. Таким образом, каждая субъединица FNR

контактирует со своей областью РНК-П. Такая же ситуация характерна для части тех БАК-зависимых

промоторов, у которых сайт связывания БАК перекрывается с областью -35. Как уже говорилось выше,

в таких случаях одна субъединица БАК контактирует с N-концевым доменом α-субъединицы РНК-П.

Другая же субъединица БАК может образовывать дополнительный контакт с αCTD.

Активаторы, действующие путем изменения конформации промотора.

Примером такого активатора является белок MerR транспозона Tn501. Димер этого белка

связывается с сайтом, расположенным между -10 и -35 областями промотора. Связывание ионов ртути

вызывает конформационное изменение, заключающееся в раскручивании ДНК-мишени, что приводит к

правильному расположению -10 и -35 областей промотора и соответственно позволяет связаться РНК-

полимеразе. Еще одним примером такого регулятора является SoxR (регулятор окислительного стесса,

который мы будем рассматривать позднее). К этому же классу относятся активаторы, связывание

которых с ДНК вводит в структуру последней резкий изгиб. Нет полной ясности с механизмом работы

таких активаторов транскрипции. Здесь возможны два варианта - контакт с «обратной» стороной РНК-

П и конформационное изменение структуры ДНК.

Наконец, существуют промоторы, зависящие от двух (и более) активаторов. Такая множественная

зависимость обычно привязывает активность промотора к различным физиологическим сигналам. В

таких ситуациях возможны 4 механизма совместного действия двух регуляторов:

• связывание с ДНК одного активатора может зависеть от другого (и наоборот). Несмотря на

простоту, примеров такого рода для прокариот не описано (описаны для эукариот);

• связывание одного активатора может приводить к перемещению другого активатора из пассивной

позиции в положение, из которого он может взаимодействовать с РНК-П. Пример - БАК и MalT на

malK промоторе: - связывание БАК перемещает MalT

• активаторы могут образовывать независимые контакты с РНК-П. В таких случаях один активатор

связывается в районе -35 области и контактирует с σ, а другой - upstream, и контактирует с αCTD.

• роль второго активатора может заключаться в предотвращении действия репрессора.

Promoter occlusion

1.4 Арабинозный оперон

В качестве примеров систем с более сложным контролем рассмотрим ara оперон E. coli.

Рассмотренный ранее lac оперон можно считать примером “простой” регуляции. Хотя в случае lac

оперона действуют два белка-регулятора, а именно осуществляющий негативный контроль репрессор

LacI и активатор транскрипции БАК, действие этих белков друг от друга не зависит, и мы фактически

имеем две простых регуляторных системы. В ara опероне один и тот же белок (продукт гена araC)

может выполнять как репрессорную, так и активаторную функции.

Всего за утилизацию арабинозы отвечает 6 генов - пять структурных и один регуляторный (araC).

Три гена образуют оперон, araBAD, который и регулируется продуктом гена araC. Ген araC

располагается перед опероном araBAD, но отделен от него 147 парами оснований и считывается в

противоположном направлении. Еще два гена, araE и araF не сцеплены ни друг с другом, ни с

кластером araCBAD, т.е. располагаются в совершенно другом районе хромосомы. Тем не менее, эти два

гена подвержены той же системе регуляции, т.е. в их промоторной области имеются сайты связывания

продукта araC. Такая организация называется регулоном. Иными словами, регулон - группа генов и

(или) оперонов, как правило, необходимых для выполнения одной физиологической функции, не

сцепленных между собой, но находящихся под общим контролем.

Генетическое изучение арабинозного оперона указывало на то, что ген araC должен кодировать

как репрессор, так и активатор транскрипции. Оказалось, что непосредственно продукт является

репрессором, но присоединение индуктора

(арабинозы) не только инактивирует репрессор, но и

- 6 -

превращает его в индуктор. Эти две формы продукта araC называются соответственно Crep и Cind. Две

формы белка C имеют разные сайты связывания в области между генами araC и araB. Кроме того, в

этой же области располагается сайт связывания БАК и, конечно же, промоторы гена araC и оперона

araBAD.

Эта область ДНК организована следующим образом

Сайт связывания БАК располагается между двумя промоторами, причем связывание комплекса

БАК-цАМФ необходимо для инициации транскрипции в обоих направлениях. Сайт связывания Crep

перекрывается с промотором гена araC, поэтому связывание Crep ингибирует транскрипцию своего

собственного гена. Таким образом, в отсутствие индуктора транскрипция гена araC поддерживается на

очень низком базальном уровне, достаточном только для обеспечения собственной репрессии.

Появление индуктора (арабинозы) вызывает отсоединение репрессора и связывание его с активаторным

сайтом, располагающимся между сайтом связывания БАК и промотором оперона araBAD. Таким

образом снимается репрессия с araC и обеспечивается синтез больших количеств его продукта,

который, связываясь с арабинозой, активирует транскрипцию оперона araBAD.

Т.о., в случае транскрипции “влево” мы имеем точную копию модели регуляции lac оперона.

Репрессор Crep ингибирует транскрипцию araC фактически так же, как LacI ингибирует транскрипцию

lac оперона. И точно так же добавление индуктора, в данном случае арабинозы, снимает репрессию.

Также аналогично действует и активирующий комплекс БАК-цАМФ по отношению к транскрипции

“влево”. Однако, в случае транскрипции “вправо” ситуация более сложная, поскольку здесь действуют

уже два активаторных белка, тот же БАК-цАМФ и Cind. Сайт связывания Cind расположен таким

образом, что, связавшись с ДНК, этот белок может непосредственно контактировать с РНК-

полимеразой, что и вызывает активацию транскрипции. Но поскольку сайт связывания Cind расположен

между промотором и БАК-связывающим сайтом, комплекс БАК-цАМФ располагается слишком далеко,

чтобы непосредственно контактировать с РНК-полимеразой, собирающейся читать вправо.

Как же БАК осуществляет регуляцию в данном случае? Дело в том, что пример с ara опероном не

является исключением. БАК имеет два типа расположения относительно промотора. Первый

стандартный для активаторов транскрипции - прямо перед промотором (например, в положении -72...-

50 у lac оперона или -50...-23 у gal оперона), что позволяет белку непосредственно контактировать с

РНК-полимеразой. Но у многих промоторов сайт связывания БАК располагается значительно дальше. В

случае ara оперона БАК связывается в положении -107...-78. Есть и другие опероны с удаленным

расположением БАК-связывающего сайта. Вопрос о том, как действует БАК, остается открытым.

Существуют две модели. Первая объясняет действие БАК через белковые взаимодействия. В принципе,

даже не очень сильное взаимодействие между двумя белками может оказаться достаточным для

существенного усиления связи РНК-полимеразы с промотором. Проблемой здесь является то, что даже

в случае gal и lac промоторов взаимодействие должно происходить по-разному, а в случае ara

промотора должны взаимодействовать три белка. Вторая модель предполагает, что эффект БАК

определяется целиком его связыванием с ДНК. В соответствии с этой моделью РНК-полимераза не

может сама обеспечить первоначальное плавление ДНК в области промотора, в пользу чего говорит тот

факт, что ни один из БАК-зависимых промоторов не имеет “хорошей”, то есть близкой к канонической,

-35 последовательности. Экспериментально установлено, что связывание белка БАК с ДНК вносит в

нее изгиб почти под прямым углом, что возможно только в случае серьезного изменения структуры

ДНК в этом районе. Предполагается, что это изменение структуры облегчает плавление ДНК в

промоторной области и, следовательно, инициацию транскрипции.

1.5 Триптофановый оперон

репрессибельный оперон

Оба оперона

(lac и ara), рассмотренные нами ранее, являются индуцируемыми

(индуцибельными). Как мы уже обсуждали на первой лекции, индуцируемыми обычно являются

катаболитные опероны. И такой тип регуляции естественен, поскольку обеспечивает синтез ферментов,

отвечающих за утилизацию какого-либо питательного субстрата только в случае наличия этого

субстрата. В другой ситуации, когда клетке нужно синтезировать какое-нибудь вещество и

поддерживать его концентрацию на постоянном уровне, используются репрессибельные

(репрессируемые) опероны. Рассмотрим такой тип регуляции на примере триптофанового оперона.

- 7 -

Триптофановый оперон состоит из

5 структурных генов, кодирующих три фермента,

превращающих хоризмовую кислоту в триптофан. (Г1 с.190). Биосинтез триптофана представляет собой

классический случай ретроингибирования, то есть ингибирования активности одного из первых

ферментов какого-либо биосинтетического пути конечным продуктом. Но кроме участия в

ретроингибировании триптофан выполняет также и функцию корепрессора, активируя белок-репрессор.

Репрессор кодируется не связанным с trp опероном геном trpR. В условиях достаточных количеств

триптофана комплекс корепрессор-TrpR связывается с оператором и ингибирует транскрипцию.

(пару

слов о генетической номенклатуре - TrpR vs trpR). Инактивация репрессора приводит к усилению

транскрипции приблизительно в 70 раз. Это относительно небольшая разница (сравните с 1000-кратной

индукцией lac оперона). Но такая кажущаяся неэффективность с лихвой компенсируется

дополнительными уровнями регуляции - во-первых, ретроингибированием, а во-вторых, феноменом,

называемым аттенуацией.

Аттенуация.

Между промоторной областью и первым структурным геном оперона имеется достаточно

протяженный участок ДНК, к тому же кодирующий небольшой пептид. Эта последовательность ДНК

называется лидером, а пептид

- лидерным. И, как оказалось, лидер необходим для еще одного

механизма регуляции экспрессии, называемого аттенюацией. Это явление достаточно широко

распространено в биосинтетических оперонах, и его сущность заключается в следующем. За лидерным

пептидом располагается шпилечная структура, являющаяся терминатором, на котором в условиях

избытка триптофана транскрипция оперона благополучно и заканчивается, не достигнув структурных

генов. Лидерный пептид богат триптофановыми кодонами. В условиях недостатка триптофана

концентрация нагруженных триптофаном аминоацил-тРНК не высока, и рибосома "притормаживает" на

триптофановых кодонах, не давая возможности образоваться терминаторной шпильке. В результате

транскрипция продолжается и с рамок структурных генов считывается РНК. Лидерная область, также

называемая аттенюатором, занимает 162 н.п. между стартом транскрипции и первым кодоном trpE гена.

Аттенюатор является барьером для транскрипции. Активной структурой здесь выступает

ρ−независимый терминатор - короткий GC богатый палиндром, непосредственно за которым следуют 8

остатков U (не забудьте, что сейчас мы говорим о структуре РНК). В присутствии триптофана ~90%

РНК терминируется здесь (что вместе с репрессией дает приблизительно

600-кратное снижение

транскрипции в присутствии триптофана).

Рассмотрим структуру аттенюатора подробнее

Аттенюатор содержит RBS, за которым следует рамка считывания, способная кодировать пептид

длиной 13 аминокислот. Какова функция этого пептида? В положениях 9 и 10 он содержит два

триптофановых остатка. В условиях недостатка триптофана рибосомы останавливаются, достигнув

триптофановых кодонов, что препятствует формированию терминаторной шпильки. Лидерная РНК

может образовывать три шпильки, а поскольку их последовательность перекрывается, возможны две

альтернативные структуры. В первой из них участок 1 спаривается с участком 2, а участок 3 с участком

4. Таким образом, формируется три шпильки. Если же не дать участку 1 спариться с участком 2, то

участок

2 может спариться с участком

3. В таком случае участку

4 спариваться не с чем, и

терминаторная шпилька не образуется.

Следующий рисунок показывает, каким образом положение рибосомы при трансляции лидерного

пептида влияет на образование шпилечных структур таким образом, что терминация происходит только

при наличии триптофана. Как вы знаете, у прокариот процессы транскрипции и трансляции не

разобщены, то есть трансляция мРНК начинается, как только синтезированы первые несколько десятков

пар оснований. Поскольку стоп-кодон лидерного пептида находится как раз между комплиментарными

участками 1 и 2, рибосома, дойдя до конца лидерного пептида, экранирует большую часть участка 2, не

давая формироваться полноразмерной шпильке 2-3, поэтому терминаторная шпилька формируется

беспрепятственно. В случае же голодания по триптофану рибосома с пустым А-сайтом притормаживает

на триптофановых кодонах в ожидании триптофановой аминоацил-тРНК, что позволяет

сформироваться полноразмерной шпильке

2-3. Соответственно, терминаторная шпилька в таких

условиях образоваться не может. Если же клетка голодает по одной из аминокислот, чьи остатки

располагаются в начале лидерного пептида, формирование шпильки 1-2 блокирует формирование

шпильки 2-3 и, следовательно, позволяет сформироваться терминаторной шпильке 3-4.

- 8 -

Аттенуация - широко распространенное явление, встречающееся, как минимум, в шести оперонах

биосинтеза аминокислот. В двух из них наблюдается явление мультивалентной репрессии - thr оперон

дерепрессируется при голодании по thr и ile, a ilv оперон - по ile, leu и val.

Наконец, следует заметить, что формально в случае аттенуации рибосому можно считать

активатором транскрипции, а аминоацил-тРНК - корепрессором.

1.6 Регуляция на стадии терминации. Антитерминация

Итак, на примере аттенуации в триптофановом опероне мы только что рассмотрели регуляцию

экспрессии на стадии терминации транскрипции. На первой лекции на примере лактозного оперона мы

рассматривали регуляцию на стадии инициации транскрипции. При сравнении этих двух примеров

может сложиться впечатление, что регуляция на стадии терминации - очень сложный процесс. Но это

далеко не всегда так. Другой механизм регуляции на стадии терминации, называемый

антитерминацией, устроен проще. В случае антитерминации регуляторную функцию выполняет один

белок, называемый антитерминатором. Этот белок предотвращает терминацию транскрипции и

позволяет считываться генам, расположенным за терминатором, выполняя, таким образом,

активаторную функцию. Следует сразу заметить, что, в отличие от регуляторов транскрипции,

действующих на стадии инициации, антитерминаторы не взаимодействуют с кофакторами, а либо

являются активными постоянно, либо их активность модулируется фосфорилированием.

Классический пример антитерминации - регуляция жизненного цикла бактериофага λ. Геном фага

лямбда имеет три группы генов: немедленно ранние (предранние), задержанно ранние и поздние.

Названия групп отражают последовательность "включения", то есть активации транскрипции, этих

генов. Оба этапа активации зависят от действия белков-антитерминаторов pN и pQ. Давайте подробно

рассмотрим действие первого из них.

На рисунке показана упрощенная схема ранней области фага λ. Два предранних гена, N и cro

транскрибируются "влево" и "вправо" от промоторов PL и PR. В самом начале литического цикла

развития бактериофага транскрипция останавливается непосредственно после генов N и cro на ρ-

зависимых терминаторах tL1 и tR1. Синтезирующийся в результате предранней транскрипции белок pN

позволяет РНК-полимеразе преодолевать терминаторы tL1 и tR1 и считывать располагающиеся за ними

задержанно ранние гены.

Действие фактора ρ. Терминация транскрипции при участии этого белка происходит, когда Rho,

связанный с вновь образованным транскриптом, взаимодействует с РНК-полимеразой, остановившейся

в области ρ−зависимого терминатора. ДНК в области таких терминаторов, как правило, не имеет особой

структуры, богата основаниями C и бедна G, первичная последовательность различных терминаторов

не имеет заметного сходства. Rho обладает РНК-зависимой АТФазной активностью и способствует

отсоединению РНК-полимеразы через взаимодействие с белком NusG.

Действие белка pN высоко специфично в том плане, что он обеспечивает антитерминацию только

на двух фаговых терминаторах, не влияя на терминацию транскрипции бактериальных генов. В то же

время, если в фаговой ДНК точно в том же месте заменить фаговый терминатор любым ρ-зависимым

бактериальным терминатором, антитерминация по-прежнему будет происходить. Следовательно, белок

pN не опознает терминатор как таковой, и перед терминатором должен существовать какой-то сайт,

узнаваемый этим белком. Такие участки называются nutL и nutR (от англ. N utilisation) для левого и

правого терминатора соответственно. Эти участки располагаются на различных расстояниях от

терминатора, в связи с чем возникает вопрос: "А как же они работают?". Когда pN узнает nut сайт, он

должен подействовать на РНК-полимеразу таким образом, что она не сможет больше узнавать

терминаторный сайт. Сравнение сайтов между собой показало, что они состоят из 17 н.п. палиндрома

(который может образовать небольшую шпильку). Мутации в этом сайте, называемом также boxB,

лишают pN способности предотвращать терминацию. Непосредственно перед этим сайтом

располагается октамерная последовательность, называемая boxA, также участвующая в

антитерминации.

Белок pN действует, скорее всего, опознавая шпилечную структуру, формируемую BoxB

областью, непосредственно после ее синтеза РНК-полимеразой, одновременно контактируя с

субъединицами полимеразы. После такого узнавания антитерминатор остается в комплексе с РНК-

полимеразой, фактически становясь ее субъединицей и обеспечивая изменение ее специфичности по

отношению к терминаторам.

- 9 -

Поиск мутантов, предотвращающих действие pN, привел к обнаружению еще нескольких белков,

являющихся компонентами транскрипционного аппарата, NusA и NusB (N utilisation substance). Белок

NusA фактически является субъединицей РНК-полимеразы, снижающей скорость продвижения РНК-

полимеразы, что облегчает терминацию, тогда как NusB как раз и является фактором, опознающим

последовательность boxA. Связывание NusB с транскрипционным комплексом усиливает

антитерминацию. Еще один белок, NusG, необходим для ρ-зависимой терминации, обеспечивая

взаимодействие Rho и РНК-полимеразы.

2. Фосфотрансферазная система

Бактериальная фосфоенолпируват:углевод фосфотрансферазная система

(фосфотрансферазная

система, ФТС) - это сложная разветвленная сеть переносящих фосфат белков, основной функцией

которой является поглощение определенных углеводов из внешней среды. Набор углеводов,

поступающих в клетку посредством ФТС, сильно варьирует у разных видов. Механизм работы ФТС

заключается в транспорте углеводов через клеточную мембрану, сопряженном с фосфорилированием

углевода. Наличие соответствующего углевода в среде и его транспорт внутрь клетки ведут к

значительному расходу высокоэнергетического фосфата и, соответственно, снижает концентрацию

фосфорилированых промежуточных переносчиков. А эти промежуточные переносчики фосфата

взаимодействуют со многими клеточными белками и изменяют их активность. Таким образом наличие

или отсутствие определенных углеводов в среде через ФТС влияет на целый ряд важнейших процессов,

таких, например, как хемотаксис, индукция катаболитных оперонов, метаболизм азота, компетентность

и вирулентность. А поскольку некоторые бактерии, например, Treponema pallidum, имея все

компоненты ФТС, не транспортируют сахара посредством ФТС, регуляторная функция ФТС не менее

важна, чем транспортная.

Вне зависимости от организма и углевода ФТС катализирует следующий процесс:

Фосфоенолпируват

+ углевод

--> пируват

+ углевод-P

(внутриклет.)

(внеклет.)

(внутриклет.)

Фосфорилирование углевода сопряжено с его транслокацией через мембрану, а необходимая для

этого энергия обеспечивается промежуточным продуктом гликолиза - фосфоенолпируватом (ФЕП).

Свободная энергия гидролиза фосфатной группы ФЕП - около -14.7 ккал/моль (больше, чем у АТФ), а

для фосфорилированного сахара - около -3 ккал/моль. На первый взгляд, ФТС слишком расточительно

расходует энергию. Однако, во-первых, в процессе гликолиза из молекулы ФЕП получается только одна

молекула АТФ, а, во-вторых, ФТС обеспечивает одновременно и транспорт, и фосфорилирование своих

субстратов (фосфорилирование необходимо для последующего катаболизма субстрата). Для углеводов,

транспортируемых не-ФТС системами, на получение фосфорилированого субстрата внутри клетки

расходуется более одной молекулы АТФ (как правило, одна на транспорт и одна на фосфорилирование).

Это одна из причин, по которой ФТС системы существуют в основном у облигатно и факультативно

анаэробных бактерий. Такие бактерии получают АТФ путем субстратного фосфорилирования в

анаэробных условиях и, следовательно, должны очень экономно расходовать молекулы АТФ,

достающиеся им с таким трудом.

- 10 -

Белки ФТС традиционно разделяются на три группы - фермент I (EI), HPr (histidine protein) и

фермент II (EII). EII обычно состоит из трех-четырех компонент (обозначаемых EIIA, EIIB, EIIC и

EIID), которые могут быть либо субъединицами одного белка, либо отдельными белками. Фермент I и

HPr - растворимые цитоплазматические белки размером соответственно 64-85 и 9-10 kDa, необходимые

для фосфорилирования всех

ФТС сахаров

данной

бактерии, в связи с чем их

называют общими белками

ФТС. С другой стороны,

фермент II специфичен для

каждого углевода, и либо

является мембранным

(если

все

компоненты

его

соединены в один белок),

либо одна из разделенных

субъединиц

является

мембранной.

Перенос

фосфата к сахару происходит

от фосфоенолпирувата через

EI, HPr, EIIA и EIIB.

Более подробно этот

процесс на примере ФТС

глюкозы у E. coli выглядит

следующим

образом

Рис.2.1. Принцип работы ФТС глюкозы

(Рис.2.1.(а)).

Сначала EI

димеризуется и в таком состоянии автофосфорилируется, перенося фосфат с фосфоенолпирувата на

His-189. Затем EI фосфорилирует HPr по остатку His-15. Затем P-HPr фосфорилирует один из сахар-

специфических белков (или доменов) EIIA, опять же по гистидиновому остатку (His-90), откуда фосфат

переносится на Cys-241 мембранного белка EIIBC, который уже передает фосфат на транспортируемую

глюкозу с образованием глюкозо-6-фосфата. Как же происходит собственно транспорт углевода внутрь

клетки? Предполагается, что процесс протекает следующим образом.

Периплазматический субстрат связывается с высокой аффинностью со своим специфическим

EIIC. Домен или субъединица C фермента II является интегральным мембранным белком-переносчиком

либо, по крайней мере, его субстрат-специфической частью. Этот переносчик (всегда в комплексе с

EIIB) и осуществляет транспорт углевода внутрь клетки.

Если EIIB не фосфорилирован, субстрат может только очень медленно транслоцироваться через

мембрану путем облегченной диффузии. Фосфорилирование IIB по Cys остатку обеспечивает быструю

транслокацию субстрата на цитоплазматическую сторону (происходит облегченная диффузия за счет

конформационного изменения белка).

Затем происходит фосфорилирование связанного с переносчиком субстрата и его освобождение в

цитоплазму.

Ряд экспериментов показывает, что транспорт сахара через мембрану не связан особенно тесно с

фосфорилированием. Субстрат может отделяться от переносчика на внутренней стороне мембраны без

фосфорилирования, более того, для некоторых Грам-положительных бактерий показана возможность

работы переносчика в обратном направлении, то есть для выброса углевода из клетки. Иными словами,

сам транспорт через мембрану является обратимым. Все стадии передачи фосфата с одного белкового

переносчика на другой происходят практически без потери энергии и, следовательно, тоже являются

обратимыми. Энергия высвобождается при передаче фосфата на транспортируемый сахар

непосредственно после его проникновения в цитоплазму, что делает весь процесс необратимым и

"запирает" сахар внутри клетки.

Пару слов о генетике ФТС. Гены, кодирующие общие компоненты ФТС, организованы в pts

оперон, а специфичные для различных сахаров компоненты ФТС, как правило, расположены в оперонах

с генами соответствующих катаболических ферментов, причем основной субстрат ФТС является

индуктором всего оперона.

- 11 -

pts оперон состоит из трех генов, расположенных в следующем порядке: ptsH (кодирует HPr), ptsI

(EI), crr (EIIAGlc). Экспрессия оперона возрастает в три раза при росте на ФТС субстратах и требует

присутствия комплекса БАК-цАМФ. Анаэробный рост также усиливает экспрессию оперона в

соответствии с предположением о том, что ФТС - основной механизм транспорта углеводов в условиях

анаэробиоза. Оперон имеет как минимум три промотора - два (P0 и P1) расположены перед ptsH, а

третий (P2) - перед crr (внутри ptsI). Перед промоторами P0 и P1 располагаются по сайту связывания

БАК с высокой и низкой аффинностью соответственно. P0 является основным промотором в

присутствии комплекса БАК-цАМФ, а P1 - в его отсутствии. С этих промоторов считывается один

длинный транскрипт, захватывающий все три гена оперона, и один короткий, перекрывающий только

ptsH. Еще один короткий транскрипт считывается с P2 и является основным для гена crr. Такая

организация транскрипции оперона обеспечивает большее количество молекул EIIAGlc по сравнению с

HPr и EI. Транскрипция pts оперона стимулируется нефосфорилированым EIICBGlc (c P0 промотора).

Таким образом, стимуляция транскрипции pts оперона комплексом БАК-цАМФ и EIICBGlc (?) действует

в двух противоположных ситуациях - в отсутствии глюкозы в среде и в ее присутствии, результатом

чего является поддержание экспрессии ФТС оперона на сходном уровне в условиях как сильной, так и

слабой катаболитной репрессии.

Мутанты, дефектные по EI или HPr, не способны утилизировать ФТС сахара как источники

углерода. К таким сахарам у Enterobacteriaceae относятся глюкоза, фруктоза, манноза, гекситолы, β-

глюкозиды, N-ацетилглюкозамин, сорбоза, сахароза, трегалоза и целлобиоза. Как ни странно, такие

мутанты (по общим компонентам ФТС) также не растут и на ряде не-ФТС сахаров, к каковым относятся

лактоза, мальтоза, мелибиоза, глицерин, рамноза, ксилоза и интермедиаты цикла Кребса. Почему это

происходит?

Простейшая модель, объясняющая фенотип ФТС мутантов по отношению к утилизации не-ФТС

сахаров, заключается в следующем. Фермент IIAGlc может существовать в двух формах

фосфорилированой и нефосфорилированой. Степень фосфорилирования IIAGlc определяется балансом

между фосфорилированием его P-HPr и дефосфорилированием через IICBGlc в присутствии его

субстрата - глюкозы. IIAGlc и P-IIAGlc взаимодействуют с и регулируют различные белки. IIAGlc

связывается с и ингибирует ряд ферментов, существенных для метаболизма углеводов, например,

переносчики лактозы и мелибиозы, глицерол киназу. Прямым результатом такого взаимодействия

является ингибирование транспорта и последующего метаболизма этих источников углерода. Такое

явление называется исключением индуктора. Кроме того, фосфорилированый IIAGlc участвует в

активации аденилатциклазы. А поскольку цАМФ необходим для экспрессии многих катаболитных

генов, регуляция уровня позволяет контролировать синтез ферментов. Но если регуляторной функцией

обладает всего один компонент ФТС глюкозы, IIAGlc , как другие ФТС сахара оказывают ингибирующее

влияние на утилизацию не-ФТС субстратов?

В клетке, растущей на не-ФТС субстрате общие ФТС белки (EI и HPr) будут находиться

преимущественно в фосфорилированом состоянии, поскольку они не смогут "сбросить" фосфат на

транспортируемый сахар (Рис.2.1.(b)). Добавление ФТС субстрата приведет к "разгрузке" фосфата с

общих компонентов ФТС, а поскольку реакция фосфорилирования IIAGlc белком HPr обратима, это

обеспечит дефосфорилирование IIAGlc. В таких условиях поступление в клетку не-ФТС субстратов

будет ингибироваться из-за исключения индуктора нефосфорилированым IIAGlc, а экспрессия

катаболитных генов будет минимальной из-за низкой концентрации цАМФ, возникающей из-за

отсутствия стимулирования аденилатциклазы P-IIAGlc.

Как белок EIIAGlc осуществляет свою регуляторную функцию? В зависимости от механизма

действия EIIAGlc не-ФТС сахара делятся на две группы. К первой относятся лактоза, мелибиоза,

мальтоза и глицерол, ко второй - ксилоза, рамноза, галактоза и интермедиаты цикла Кребса. Для

сахаров первой группы EIIAGlc ингибирует и транспорт, и катаболизм. Транспорт ингибируется путем

непосредственного связывания нефосфорилированого EIIAGlc с мембранным транспортером

соответствующего углевода, причем только тогда, когда транспортер уже связал свой сахар. Как

происходит активация аденилатциклазы - неизвестно, но сниженный уровень цАМФ в отсутствии P-

EIIAGlc определяет фактически полное отсутствие экспрессии генов катаболизма не-ФТС сахаров

второй группы (Рис.2.2.).

- 12 -

Катаболитная репрессия

Таким

образом,

мы снова

возвращаемся к явлению катаболитной

репрессии, и теперь у вас должно быть

четкое представление о том, чем

объясняется

классический

феномен

диауксии при росте E. coli на лактозе и

глюкозе.

Однако, при общем сходстве ФТС

систем у разных организмов механизмы

катаболитной

репрессии

несколько

различаются.

Рассмотрим

роль

компонентов ФТС в этом явлении у группы

Грам-положительных бактерий с низким

ГЦ содержанием на примере B. subtilis (Рис.

2.3.). Центральной молекулой, отвечающей

за катаболитную репрессию у этой

бактерии является HPr. В отличие от

энтеробактерий, HPr у B. subtilis может

Рис.2.2. Катаболитная репрессия у Escherichia coli

быть фосфорилирован в двух положениях -

His-15 ФТС ферментом I и Ser-46 активируемой метаболитами (прежде всего, фруктозо-бис-фосфатом)

АТФ-зависимой HPr-киназой

(продуктом гена ptsK). Фосфорилирование по Ser-46 служит

исключительно регуляторным целям. Катаболитная репрессия у этих бактерий идет двумя путями: во-

первых, через репрессию катаболитных генов и оперонов белком CcpA (catabolite control protein) и, во-

вторых, за счет отсутствия индукции катаболитных генов и оперонов, что определяется HPr путем

фосфорилирования соответствующих ферментов.

CcpA ингибирует транскрипцию

катаболитных генов, связываясь с

операторным сайтом, который в данном

случае называется cre (catabolite responsive

element). CcpA принадлежит к классу

LacI-подобных регуляторов транскрипции.

Операторные сайты cre располагаются в

регуляторных областях многих оперонов,

таких как xyl, gut (утилизация глюконата),

hut (утилизация гистидина), lev (транспорт

фруктозы и деградация левана) и др. Для

связывания CcpA с оператором cre

необходимо действие корепрессора,

которым в данном случае является

фосфорилированый по Ser-46 HPr.

Активная форма репрессора состоит из

димера CcpA и двух молекул HPr-S46-P.

Рис.2.3. Катаболитная репрессия у Bacillus subtilis

Второй механизм катаболитной

репрессии у Грам-положительных бактерий определяется действием специфических для каждого сахара

регуляторов. Примерами таких регуляторов являются LevR, LicT и LacT, контролирующие синтез

соответственно леваназы, β-глюкозидазы и β-галактозидазы. Такие регуляторы действуют как

активаторы транскрипции или антитерминаторы (подобно BglG у E.coli), а общим между ними является

наличие регулируемого ФТС домена

(PRD). Активность этих регуляторов контролируется

фосфорилированием белком HPr или EII. В отсутствие глюкозы HPr-H15-P фосфорилирует один из

аминокислотных остатков PRD домена, что стимулирует активацию транскрипции. Фосфорилирование

HPr по Ser-46 HPr-киназой предотвращает фосфорилирование регуляторов. Таким образом создается

связь между гликолитической активностью

(которую детектирует HPr-киназа), степенью

фосфорилирования HPr и активностью регуляторов, содержащих PRD домен.

- 13 -

РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА. Курс лекций - часть 1