РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА. Курс лекций

bgl оперон - ФТС и антитерминация.

bgl оперон E. coli

(криптический) состоит из трех генов: bglG, кодирующего позитивный

регулятор (антитерминатор), bglF, кодирующего ФТС транспортер β-глюкозидов и bglB, кодирующий

фермент, гидролизующий β-глюкозиды. Контроль экспрессии оперона осуществляется ри помощи двух

терминаторов - в лидерной области и между bglG и bglF. BglF фосфорилируется ФТС белками и в

присутствии β-глюкозидов сбрасывает фосфатную группу на эти сахара в процессе их транспорта. BglF

также может выступать в роли киназы, перенося свой фосфат на BglG, и в роли фосфатазы,

дефосфорилируя BglG.

Терминаторные области bgl оперона содержат по два перекрывающихся участка, способных

образовывать альтернативные шпилечные структуры. Связывание BglG с первой шпилькой

препятствует образованию второй, являющейся терминатором. BglG активно связывается с РНК (и

выполняет антитерминаторную функцию) только в форме димера. Фосфорилирование BglG переводит

его в мономерную форму и препятствует связыванию с РНК. В присутствии β-глюкозидов BglF

фосфорилирует их и дефосфорилирует BglG; при отсутствии субстрата BglF фосфорилирует BglG, что

блокирует антитерминацию. Этот пример показывает эффективное использование фосфорилирующей

способности транспортного белка для детекции сигнала из внешней среды и трансформации его в

изменение экспрессии генов через белковые взаимодействия.

sac genes of B. subtilis

3. Альтернативные сигма-факторы РНК-полимеразы

Узнавание промотора у бактерий требует

ассоциации кор-фермента РНК-полимеразы (ββ'α2) с

сигма

(σ) субъединицей, что дает активный

холофермент

(Рис.

3.1). Все свободноживущие

бактерии содержат множественные сигма-факторы (у

некоторых бактерий описано до

10-20). К числу

таковых

относятся

основной

сигма-фактор,

контролирующий гомеостатические функции, и

альтернативные

сигма-факторы,

активируемые

специфическими сигналами или стрессовыми

условиями (Табл. 3.1). Как правило, только один σ-

фактор обеспечивает транскрипцию всех жизненно

важных генов, обеспечивающих гомеостатические

клеточные процессы (репликацию ДНК, транскрипцию,

трансляцию и т.д.). Этот сигма-фактор называют

основным, а все остальные

- альтернативными.

Инактивация

основного

σ-фактора

летальна,

альтернативных, как правило, - нет. Названия сигма-

факторов соответствуют их молекулярной массе

(например σ38). Все гены, кодирующие σ-факторы,

имеют аббревиатуру rpo (RNA polymerase), поэтому

для обозначения сигма-факторов также пользуются

четырехбуквенные имена (например RpoS).

Основной σ-фактор E. coli имеет молекулярную

массу около 70 kDa и обозначается σ70 или RpoD.

Альтернативный

σ-фактор,

контролирующий

большинство генов азотного метаболизма, имеет

Рис.3.1. Инициация транскрипции у

размер 54 kDa, и соответственно обозначается σ54 или

прокариот

RpoN. Эти два белка не похожи друг на друга ни по

рервичной последовательности, ни по структуре, и

- 14 -

являются прототипами двух больших семейств σ-факторов. Все основные и большинство

альтернативных σ-факторов принадлежат к семейству σ70. Альтернативные σ-факторы этого семейства,

в свою очередь, могут быть сгруппированы в три подсемейства, контролирующих споруляцию,

подвижность и разнообразные внецитоплазматические функции

(синтез секретируемых белков,

транспорт железа, реакция на различные стрессовые воздействия). Представители семейства σ54 также

присутствуют у многих бактерий и контролируют азотный метаболизм, синтез ряда гидролаз и

жгутиковых белков.

Таблица 3.1. Сигма-факторы Escherichia coli

Сигма-

Размер

Контролируемые процессы

Количество

фактор

белка,

подконтрольных

АК

генов

RpoD

613

большинство жизненно важных генов

~1000

RpoS

330

общий стресс и стационарная фаза

~100

RpoH

284

тепловой шок

~40

RpoF

239

жгутиковый аппарат и хемотаксис

RpoE

202

внецитоплазматические гены и экстремальный тепловой

шок

FecI

173

транспорт цитрата железа и внецитоплазматические гены

RpoN

477

азотный метаболизм

~15

Основной σ-фактор E. coli имеет молекулярную массу около 70 kDa и обозначается σ70 или RpoD.

Альтернативный σ-фактор, контролирующий большинство генов азотного метаболизма, имеет размер

54 kDa, и соответственно обозначается σ54 или RpoN. Эти два белка не похожи друг на друга ни по

рервичной последовательности, ни по структуре, и являются прототипами двух больших семейств σ-

факторов (Рис. 3.2). Все основные и большинство альтернативных σ-факторов принадлежат к семейству

σ70. Альтернативные σ-факторы этого

семейства, в свою очередь, могут быть

сгруппированы в три подсемейства,

контролирующих

споруляцию,

подвижность

разнообразные

внецитоплазматические

функции

(синтез

секретируемых

белков,

транспорт железа, реакция на

различные стрессовые воздействия).

Представители семейства σ54 также

присутствуют у многих бактерий и

контролируют азотный метаболизм,

синтез ряда гидролаз и жгутиковых

белков.

Последовательности

промоторов,

опознаваемых

альтернативными сигма-факторами,

существенно различаются и, как

правило, не могут быть распознаны

более чем одной сигма-субъединицей.

Исключение - RpoD и RpoS

(схема - промоторы)

Будучи

глобальными

регуляторами, сигма факторы, как

Рис.3.2. Структурно-функциональная организация

правило, не детектируют изменение

сигма-факторов.

условий сами, а полагаются в этом на

другие белки. Сигма-факторы обычно

- 15 -

являются конечным либо (реже) промежуточным звеном какого-либо регуляторного каскада. Именно

поэтому сигма-факторы обычно сами подвержены регуляции, причем осуществляться она может на

транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях.

σ-факторы бактериофагов. Каскадная регуляция экспрессии генов.

Однако исторически одними из первых были открыты альтернативные сигма-факторы,

участвующие в каскадной активации генов при литическом цикле развития некоторых бактериофагов.

Классический пример - бактериофаг SPO1 B. subtilis. Литический цикл бактериофага можно разделить

на три стадии. Сразу после инфекции транскрибируются ранние гены бактериофага. Они считываются с

типичных бактериальных промоторов бактериальным холоферментом с основной сигма-субъединицей

(σ55 у B. subtilis). Очередность транскрипции средних и поздних генов определяется тремя фаговыми

генами, 28, 33 и 34. Продукт гена 28, обозначаемый gp28, является сигма-фактором. Замещая основной

сигма-фактор, он позволяет РНК-полимеразе считывать средние гены бактериофага. Продукты средних

генов

33 и 34, gp33 и gp34, замещают gp28, снова изменяя промоторную специфичность РНК-

полимеразы, которая становится способной считывать теперь уже только промоторы поздних фаговых

генов. Таким образом, альтернативные сигма-факторы позволяют бактериофагу полностью

переключить транскрипционный аппарат хозяйской клетки на считывание своих собственных генов.

rpoS

У E. coli важнейшим сигма-фактором является σs, продукт гена rpoS. Этот сигма-фактор наиболее

близок по своей аминокислотной последовательности к основной сигме 70. Промоторы этих сигма-

факторов тоже очень похожи, но, несмотря на это, специфичны каждый для своего сигма-фактора in

vivo. Буква S в названии σs происходит от стационарной фазы роста, на протяжении которой этот

фактор был впервые обнаружен. Затем присутствие этого сигма-фактора было обнаружено в других

стрессовых условиях, и сейчас считается, что присутствие σs является свидетельством т.н. «общего

стрессового ответа». Этот ответ наблюдается, когда клетка сталкивается с рядом стрессовых ситуаций,

видимым признаком чего является снижение скорости роста вплоть до вхождения в стационарную фазу.

Голодание, повышение осмолярности среды или понижение pH, неоптимальная температура - эти и

другие стрессовые воздействия могут индуцировать общий стрессовый ответ. Физиологические

последствия общего стрессового ответа включают устойчивость к многим стрессовым воздействиям,

накопление запасных питательных веществ, изменения структуры клеточной стенки

(увеличение

частоты кросс-сшивок в пептидогликане) и изменение морфологии клетки (уменьшение общего размера

и укорачивание клеток - они становятся почти сферическими).

Во время логарифмической фазы роста в лабораторных условиях клетки E. coli практически не

содержат σs, и потому мутанты по rpoS не имеют видимых дефектов. В этих условиях большинство

молекул РНК-полимеразы экспрессируют гомеостатические гены и имеют в своем составе главный

сигма-фактор σ70 (продукт гена rpoD). Эта ситуация меняется, как только клетки подвергаются какому-

либо стрессу, то есть попадают в условия, не оптимальные для роста. В этих условиях σs индуцируется

до уровня 30% от количества σ70, что приводит к появлению достаточного количества РНК полимеразы

в комплексе с σs и индукции большого числа (не менее 100) σs-зависимых промоторов. Активируемые

гены жизненно необходимы для выживания в стрессовых условиях, например, в стационарной фазе.

При адаптации к стрессовой ситуации σs действует как быстро индуцируемый координатор

стрессового ответа, а также как основной регулятор долговременной адаптации со сложными

физиологическими последствиями. Первая функция σs очевидна при быстрой, но краткосрочной

индукции σs при переходе клетки с утилизации глюкозы на лактозу. Как вы помните, при выращивании

бактерии на смеси двух углеводов наблюдается феномен диауксии - фаза логарифмического роста, во

время которой бактерии используют предпочтительный углевод, затем плато, когда происходит

перестройка метаболизма и второй этап логарифмического роста. Прежде чем клетка начнет

утилизацию лактозы, ФТС глюкозы должна полностью освободиться от субстрата, должен накопиться

цАМФ, что и приведет к индукции lac-оперона. Как раз накопление цАМФ и зависит от σs -

кратковременное появление этого σ-фактора и активация σs-зависимых генов предшествуют

накоплению цАМФ и необходимы для этого.

Количество активной σs субъединицы контролируется на уровне транскрипции, трансляции и

путем протеолиза. Различные стрессовые условия по-разному влияют на эти уровни регуляции. Даже в

- 16 -

условиях быстрого роста, когда белок σs не детектируется, присутствует достаточно много мРНК rpoS.

Формирование вторичной структуры этой мРНК препятствует ее трансляции. Для активации

трансляции этой мРНК необходимо действие небольшого РНК-связывающего белка Hfq (HF-I). Кроме

того, транскрипция rpoS в стрессовых условиях также возрастает.

Такой механизм регуляции уровня σs используется в тех стрессовых условиях, которые требуют

длительной адаптации. В тех же случаях, когда требуется быстрое реагирование на внезапные

изменения условий, такие как внезапное голодание, сдвиг pH, повышение температуры и осмолярности

среды, увеличение к-ва σs происходит за счет предотвращения ее протеолиза. Протеолиз σs происходит

за счет протеазы ClpXP при помощи регуляторного белка RssB. Нестабильность σs определяется

короткой последовательностью аминокислотных остатков, которая отсутствует у σ70. RssB узнает эту

последовательность и выступает в роли субстрат-узнающего фактора для ClpXP протеазы. Сродство

RssB к σs изменяется в зависимости от его фосфорилирования/дефосфорилирования, которое каким-то

образом связано со стрессовыми условиями.

Каковы же гены-мишени, активируемые σs? Их более сотни, и все они в той или иной степени

выполняют функцию адаптации к стрессовым условиям. В качестве примеров можно привести

активацию генов клеточного деления ftsQAZ и активацию системы защиты от активного кислорода. В

последнюю входят каталазы KatE, KatG и протекторный белок Dps, непосредственно защищающий

ДНК от перекиси водорода.

В клетках, находящихся в стрессовых условиях, две формы РНК полимеразы, Eσs и Eσ70,

сосуществуют и обеспечивают экспрессию различных генов. Тем не менее, промоторные

последовательности генов, контролируемых Eσs , очень сходны с таковыми зависящих от Eσ70 - вплоть

до того, что в экспериментах in vitro оба холофермента достаточно хорошо транскрибируют оба типа

промоторов. (Хотя Eσs все же менее требователен к -35 последовательности)

Как же тогда обеспечивается специфичность σs-зависимых промоторов? Экспрессия многих генов

регулона модулируется глобальными регуляторами H-NS, Lrp, cAMP-CRP, IHF и Fis. Часть из этих

факторов является распространенными гистоноподобными белками с не очень ясными функциями.

Зачастую несколько белковых факторов одновременно контролируют транскрипцию с σs-зависимых

промоторов. Также часто встречается ситуация, когда один и тот же ген транскрибируется с двух

промоторов, зависящих от разных факторов. В таких случаях транскрипция с σs-зависимого промотора

зачастую зависит от дополнительного белкового регулятора, тогда как транскрипция с σ70 промотора

конститутивна.

rpoE

Итак, мы разобрали функции и принцип активации σs, сигма-фактора, наиболее близкого к

основному сигма-фактору σ70. Другие сигма-факторы менее сходны с σ70 по своей последовательности

и опознают промоторы, не имеющие ничего общего со "стандартным" промотором σ70.

(Таблица с последовательностями промоторов для разных сигм)

Рассмотрим принцип действия другого сигма-фактора E. coli, σE. Этот белок принадлежит к

большому семейству ECF (extracytoplasmic factors) сигма-факторов. Свое название эти сигма-факторы

получили в связи с их участием в регуляции экспрессии внецитоплазменных белков

(периплазматических, внешней мембраны и секретируемых во внешнюю среду). Основная функция σE -

обеспечивать синтез белков, ответственных за нормальный фолдинг (сворачивание) белков внешней

мембраны, но, кроме того, σE усиливает транскрипцию генов теплового шока (путем активации еще

oдного сигма-фактора, σ32), а у патогенных бактерий родственные сигма-факторы активируют гены

вирулентности.

σE реагирует на белки внешней мембраны и периплазматические белки, утратившие нормальную

конформацию. Но поскольку сигма-фактор, естественно, является цитоплазматическим, а сигнал для

его активации находится в периплазме, должен быть какой-то переносчик сигнала между двумя

клеточными компартментами. Эту функцию выполняет мембранный белок RseA. В отсутствие сигнала

σE инактивирован путем связывания с RseA. Эта инактивация усиливается за счет взаимодействия RseA

с периплазматическим белком RseB. При нарушениях внешней мембраны, предотвращающих

нормальный фолдинг ее белков, RseB связывается с неправильно свернутыми белками, освобождая

RseA. Это ведет к ослабеванию связи RseA с σE, а дополнительное взаимодействие неправильно

- 17 -

свернутых белков с RseA окончательно освобождает σE, который связывается с РНК-полимеразой и

активирует транскрипцию ряда генов (Рис. 3.3). В число этих генов входят:

fkpA, кодирующий периплазматический шаперон

(необходимый для нормального фолдинга

периплазматических белков и белков внешней мембраны);

degP - периплазматическая протеаза, деградирующая ненормальные или неправильно свернутые

белки;

rpoH - сигма-фактор, активирующий транскрипцию генов теплового шока;

собственный оперон rpoE rseABC;

гены вирулентности у ряда бактерий.

Поскольку

σE

активирует

транскрипцию своего собственного

оперона, первоначальная индукция

по

механизму

положительной

обратной связи резко усиливается за

счет дополнительного синтеза σE. А

поскольку одновременно с σE

происходит

сверхпродукция

негативных регуляторов RseA и

RseB,

вся

система

быстро

выключается, как только периплазма

оказывается

очищенной

от

неправильно свернутых белков.

У ряда бактерий система σE

была адаптирована для контроля

генов вирулентности. Так, у P.

aeruginosa гомолог σE

(AlgU)

регулирует экспрессию генов alg,

кодирующих синтез мукоидной

капсулы,

необходимой

для

установления хронических инфекций.

Так же, как и у E. coli, до

поступления сигнала сигма-фактор

Рис.3.3. Контроль регулона RpoE.

инактивирован взаимодействием с

другим белком, MucA. Сигнал для активации AlgU скорее всего продуцируется на начальных этапах

инфекции, например, в виде повышенной температуры, мешающей нормальному фолдингу белков

оболочки.

Белки RseA и MucA принадлежат к классу регуляторов, известных как анти-сигма факторы.

Принцип работы этих белков прост

- связываясь с сигма-факторами, они препятствуют их

взаимодействию с РНК-полимеразой. Кроме σE регулона, анти-сигма факторы участвуют в контроле

регулонов, активируемых σ28 (биосинтез жгутиков) и σF (ранние стадии споруляции B. subtilis).

Наиболее интересный пример действия анти-сигма факторов представляет регуляция процесса

биогенеза жгутиков, хорошо изученная у Salmonella typhimutium. Синтез поздних жгутиковых генов

(кодирующих флагеллин и хемотаксические функции) зависит от альтернативного сигма фактора σ28.

Во время ранних стадий синтеза жгутиков σ28 находится в инактивированном состоянии за счет

взаимодействия с анти-сигма фактором FlgM. Как только базальное тело и крюк оказываются

собранными, FlgM секретируется через жгутик, высвобождая активный σ28. Высвобождение σ28

приводит к началу транскрипции поздних жгутиковых генов, одним из продуктов которых является

флагеллин

- белок, из субъединиц которого собрана нить жгутика. А поскольку субъединицы

флагеллина экспортируются через тот же канал, что и FlgM, создается препятствие для выхода FlgM из

клетки, из-за чего его уровень внутри клетки снова возрастает.

Литература:

1. D. Missiakas and S. Raina. The extracytoplasmic function sigma factors: role and regulation. Mol Microbiol

1998 28(6):1059-1066

- 18 -

4. Тепловой шок, фолдинг и деградация белков

Тепловой шок является гомеостатическим

ответом

клетки

на

индуцированное

стрессовыми

условиями

изменение

конформации

белков.

Этот

феномен

свойственен всем организмам, и его

молекулярный

механизм

практически

идентичен у бактерий, архей и эукариот (но

детали рассматривать мы будем все-таки у E.

coli). При повышении температуры клетка

начинает синтезировать т.н. белки теплового

шока, к которым прежде всего относятся

молекулярные шапероны

(DnaK, GroEL) и

АТФ-зависимые протеазы (Lon, ClpAP). Эти

белки выполняют две основные функции

обеспечивают фолдинг

(сворачивание в

нативную конформацию) и деградацию

поврежденных белков. Несмотря на полную

противоположность этих двух функций

результат их осуществления один - ликвидация

поврежденных (и потенциально опасных для

клетки) белков. Цитоплазматические протеазы

Рис. 4.1. Шаперонин GroELS

по своей структуре напоминают шапероны -

древние машины для фолдинга. И те, и другие

распознают экспонированные гидрофобные

участки

неправильно

свернутых

или

денатурированных белков.

Молекулярные шапероны

Шапероны-шаперонины: разница

Эти белки обеспечивают правильный

фолдинг синтезируемых белков за счет энергии

гидролиза АТФ. Они особенно важны у

прокариот, где фолдинг обычно не является

котрансляционным. Шапероны могут также

вернуть в нормальную конформацию многие

денатурированные белки

(накапливающиеся

при многих стрессах, включая тепловой шок), а

также предотвращают агрегацию олигомеров и

обеспечивают их разделение. Наконец,

шапероны участвуют в секреции, поддерживая

секретируемые белки в развернутом состоянии.

Шапероны из семейств Hsp70 и Hsp60

(аббревиатура из слов heat shock protein + мол.

масса) присутствуют в цитоплазме в

наибольших количествах. Гомологом Hsp60 у

E. coli является GroEL, формирующий

гигантский комплекс с GroES, в центральной

полости которого целиком может поместиться

белок размером до 55 кДа (Рис. 4.1.).

GroES-GroEL

комплекс

имеет

Рис. 4.2. Рабочий цикл шаперонина GroE

существенное сходство с эукариотической 26S

- 19 -

протеосомой, ответственной за деградацию

меченых убихитином белков.

У E. coli гомологом Hsp70 является DnaK,

который образует комплекс с кошапероном

DnaJ и белком GrpE (Рис. 4.3).

E. coli также имеет дополнительные

шапероны , такие как SecB, ClpB и IbpAB,

взаимодействующие с белками, являющимися

плохими субстратами для шаперонов Hsp70 и

Hsp60 семейств.

Почему белкам нужна помощь при

фолдинге?

При фолдинге белки проходят через ряд

промежуточных конформаций, имеющих более

высокую энергию, чем конечная конформация

(Рис.

4.4). Поэтому для многих белков

существуют

локальные

энергетические

минимумы, в которых частично свернутый

белок может задержаться надолго (Рис. 4.5).

Белки, требующие помощи в фолдинге,

опознаются

аппаратом

DnaK-DnaJ-GrpE,

предположительно через находящиеся в

контакте с раствором гидрофобные участки.

Молекулярный шаперон затем, гидролизуя

АТФ, "перетасовывает" конформацию многих

оснований, фактически разворачивая белок и

Рис. 4.3. Рабочий цикл шаперона DnaK

позволяя ему свернуться заново. Если нативная

конформация не достигается таким путем, белок

переходит в ведение шаперонина GroES-GroEL.

Полость шаперонина экранирует белок от контакта с раствором и другими субъединицами,

предотвращая агрегацию и позволяя белку спокойно свернуться.

Специфичность шаперонов.

Ш. взаимодействуют предпочтительно с гидрофобными АК, хотя SecB предпочитает

положительно заряженные. Неправильно свернутые или денатурированные белки опознаются по

гидрофобным участкам, в норме экранированным от контакта с раствором либо внутри молекулы, либо

путем контакта с гидрофобной областью другого белка или с мембраной. Недавно было показано, что

DnaK опознает гидрофобный участок из 4-5 оснований, одним из которых является лейцин; такой

участок должен быть фланкирован основными АК. Такие участки встречаются в среднем через каждые

36 АК, обычно в экранированных участках молекулы.

Шапероны и протеолиз.

Роль шаперонов в протеолизе была продемонстрирована при изучении мутантов GroES-GroEL и

DnaK - оказалось, что некоторые из них стабилизируют аномальные белки. Затем было обнаружено, что

ряд цитоплазматических протеаз - ClpAP, ClpXP, HslVU - имеют одну субъединицу с активным сайтом

для протеолиза, а вторую

- с АТФ-зависимой шаперонной активностью. Кроме того, другие

цитоплазматические протеазы, напр. HflB (FtsH), хоть и состоящие из одной полипептидной цепи,

проявляют шаперонную активность в определенных условиях. Это свидетельствует о том, что АТФ-

зависимость цитоплазматических протеаз может отражать шаперонную активность, денатурирующую

субстрат, что делает его доступным для протеазы. (В принципе никакой энергии для самого протеолиза

не нужно, т.к. расщепление пептидной связи - экзотермическая реакция.) Другая возможная функция

АТФ - индукция конформационных изменений, ведущих к мультимеризации некоторых протеаз.

Например, в отсутствие гидролиза АТФ протеаза ClpAP не может сформировать своей нормальной

цилиндрической структуры, без чего ее взаимодействие с субстратами невозможно.

Широкая субстратная специфичность шаперонов и, предположительно, протеаз отражает их

способность узнавать в норме спрятанные гидрофобные области плохо свернутых или

денатурированных белков. Такая общность узнавания создает дилемму: взаимодействие с шаперонами

- 20 -

ведет к ренатурации или фолдингу, а

взаимодействие с протеазами ведет к

деструкции. Следовательно, клетка каким-то

образом должна решить, по какому пути

направить каждый поврежденный белок.

Сигналы для протеолиза обычно

располагаются на карбокси-конце.

Как

правило, это короткие последовательности из 5

или около того неполярных оснований.

Искусственное добавление таких "ярлыков" к

стабильным в норме белкам делает их

субстратами для протеаз. Недавно был

обнаружен еще один "ярлык" такого рода.

Когда молекула мРНК внезапно обрывается

посреди кодирующей последовательности в

результате деградации либо просто в

результате преждевременной терминации

транскрипции, рибосома оказывается в

состоянии с занятым пептидил-тРНК P-сайтом

и свободным от кодона

(и, соответственно,

аминоацил-тРНК) A-сайтом

(акцепторным

сайтом). В этих условиях небольшая

стабильная РНК, ssrA, действует сначала как

аланил-тРНК, добавляя остаток аланина к

пептиду, а затем как короткая мРНК, добавляя

10 неполярных аминокислот, за кодонами

которых следует стоп. В результате образуется

Рис. 4.4. Модель фолдинга короткого пептида

пептид, несущий на своем карбокси-конце 11

дополнительных АК, направляющих пептид на

протеолиз ( в периплазме при помощи Tsr, а в

цитоплазме - HflB или ClpXP протеаз). В случае же денатурированных или агрегированных белков, не

имеющих специфического "ярлыка", вопрос о том, как клетка определяет их дальнейшую судьбу,

остается открытым.

АТФ-зависимые протеазы

В отличие от эукариот,

где

множественные системы мечения белков

убихитином направляют различные субстраты

к единственной цитоплазматической протеазе

(26S протеазе), за распознавание субстрата у

прокариот отвечают сами протеазы, поэтому их

в клетке, как правило, несколько

(порядка

шести).

Энергозависимые

протеазы

представляют собой, как правило, крупные

олигомерные комплексы. Для всех протеаз

этого класса с известной структурой

протеазные

сайты

располагаются

во

внутренней камере олигомера, вход в которую

слишком мал для большинства нативных

(свернутых) белков. Поступление субстрата

внутрь

такой

полости обеспечивается

Рис. 4.5. Изменение свободной энергии в

регульторными АТФазными доменами

(или

процессе фолдинга

субъединицами). Не удивительно, что именно

АТФазные субъединицы отвечают за

субстратную специфичность. Аминокислотные последовательности АТФазных субъединиц разных

- 21 -

протеаз имеют сходство, которое может свидетельствовать о сходстве механизмов их действия.

Поскольку распознавание субстратов осуществляется регуляторными АТФазами, свойства субстратов,

приводящие к их деградации, не зависят от свойств, необходимых для разрезания пептидных связей.

Как только белок распознается и связывается регуляторным АТФазным доменом, начинается

последовательная деградация полипептидной цепи с разрезами через каждые 5-10 АК.

У E.coli известны

4 АТФ-зависимые

протеазы.

ClpAP ClpXP.

У этих протеаз АТФазная и протеазная

активность

принадлежат

разным

субъединицам, и неудивительно, что эти

субъединицы

способны

действовать

самостоятельно (Рис. 4.6). ClpA и ClpX могут

действовать как шапероны. Гены clpX и clpP

составляют оперон, clpA расположен отдельно

в моноцистронном опероне. Оба оперона

имеют типичные промоторы теплового шока.

ClpYQ/HslUV

HflB(FtsH)

Рис. 4.6. АТФ-зависимые протеазы: шаперон и

Zn и АТФ-зависимая

протеаза,

протеаза в одной молекуле

участвующая

деградации

цитоплазматических и мембранных белков,

включая RpoH, SecY (часть аппарата секреции). Единственная АТФ-зависимая протеаза, существенная

для жизни E. coli. В опероне с RpoH-зависимым промотором.

Lon.

Деградирует белок N фага λ, ингибитор

клеточного деления SulA, позитивный

регулятор биосинтеза капсулы RcsA и др.

Кроме специфических мишеней, Lon

деградирует большинство аномальных белков

E. coli. Белок

- гомотетрамер, имеет сайты

связывания с АТФ и ДНК, причем связывание

с ДНК стимулирует протеазную активность.

Транскрибируется с промотора теплового

шока. В белке можно выделить два домена -

собственно протеазный с карбоксильного

конца с сериновым остатком в активном сайте

следующий за ним АТФазный.

Экспериментально показано, что эти два

домена могут быть экспрессированы как

отдельные полипептиды, смесь которых

функционально соответствует интактной

протеазе Lon.

Регуляция синтеза белков теплового

шока.

Шапероны и клеточные протеазы входят

в состав регулона σ32 вместе с другими

белками теплового шока (Рис. 4.7). Кроме того,

в состав уже рассмотренного нами ранее

регулона σE входят периплазматическая

Рис. 4.7. Регуляция теплового шока у Escherichia

протеаза и шаперон. В последнее время было

coli

выяснено, что эти два регулона взаимосвязаны,

- 22 -

т.к. комплекс кора РНК-полимеразы с σE активирует транскрипцию гена rpoH, кодирующего σ32, при

экстремальных температурах (напр, 50°C). Многие протеобактерии имеют гомологи RpoH, и у них

механизмы регуляции теплового шока являются схожими, тогда как грамположительные бактерии

выработали другие, причем достаточно разнообразные, регуляторные стратегии для конкретных генов

теплового шока.

У клеток E. coli, перемещенных с 30° на 42°, уровень внутриклеточного σ32 резко (хотя и

ненадолго) возрастает, усиливая транскрипцию с промоторов теплового шока.

Возрастание

концентрации σ32 является результатом стабилизации обычно весьма нестабильного σ32 и активации

трансляции уже существующей мРНК rpoH. Поскольку быстрая деградация σ32 зависит от шаперонного

комплекса DnaK-DnaJ-GrpE, стабилизация происходит из-за того, что шаперон загружается огромным

количеством индуцированных стрессом неправильных белков и его уже не хватает для обработки σ32. В

фазе адаптации, следующей за фазой индукции, синтез HSP снижается негативной обратной связью на

нескольких уровнях экспрессии (трансляционная репрессия, дестабилизация и, возможно, инактивация

σ32). Количество шаперона DnaK-DnaJ в клетке невелико, поэтому он является весьма чувствительным

средством мониторинга стрессов. В деградации σ32 наибольшую роль играет, вероятно, связанная с

мембраной АТФ-зависимая протеаза HflB (FtsH). Несколько цитоплазматических протеаз (HslVU,

ClpAP и Lon), в норме отвечающих за деградацию аномальных белков, также способны деградировать

σ32. Таким образом внутриклеточные протеазы вместе с шапероном DnaK-DnaJ способны регулировать

тепловой шок, контролируя внутриклеточную концентрацию аномальных белков. Шапероны, конечно,

не деградируют σ32 непосредственно. Вступая в ассоциацию с РНК-полимеразой, σ32 стабилизируется и

становится нечувствительной к протеолизу. Роль шаперонов заключается в предотвращении связывания

σ32 с РНК-полимеразой, что позволяет протеазам ее деградировать.

Индукция трансляции σ32 происходит независимо не только от шаперонов, но и вообще от каких

бы то ни было регуляторных белков. 5' область мРНК rpoH имеет уникальную вторичную структуру,

закрывающую рибосомсвязывающий сайт. Эта структура стабильна при нормальной температуре, но

денатурирует при ее повышении, что освобождает последовательность Шайн-Далгарно и позволяет

инициировать трансляцию.

Транскрипция rpoH может инициироваться с четырех промоторов, один из которых зависит от σE,

и регулируется белком DnaA и комплексом cAMP-CRP. Когда клетки E. coli подвергаются воздействию

очень высоких температур, синтез почти всех белков в клетке прекращается. Исключения составляют

лишь несколько белков, включая членов регулона σЕ (σ32 - один из таких белков). Другими членами

этого регулона являются периплазматические протеаза DegP (HtrA) шаперон (пептидил-пролил цис-

транс изомераза) FkpA, которые способствуют соответственно деградации и фолдингу поврежденных

белков в периплазме. Мы уже рассматривали этот регулон раньше, поэтому пару слов о его регуляции

при повышенной температуре. Как уже говорилось выше, активность σE контролируется парой белков,

RseA и RseB. Белок цитоплазматической мембраны RseA является анти-сигма фактором и репрессирует

σE регулон, связываясь с σE и предотвращая его взаимодействие с промоторами. Периплазматический

белок RseB взаимодействует с RseA и способствует инактивации σE. Когда же в периплазме

накапливаются аномальные белки, RseB с ними взаимодействует, освобождая RseA, что ведет к

ослаблению связи последнего с σE. Кроме того, важным результатом повышения температуры является

изменение свойств мембраны - она становится более лабильной (становится "жиже"), что также

способствует изменению конформации RseA, ослабляющему взаимодействие с σE.

Регуляция теплового шока у грамположительных бактерий.

Регуляторные стратегии у этих бактерий существенно отличаются от таковых E. coli, хотя

некоторые принципы остаются. У B. subtilis гены теплового шока могут быть разделены по крайней

мере на три класса.

Гены первого класса (регулон CIRCE/HrcA) кодируют синтез основных шаперонов DnaKJ-GrpE и

GroEL-GroES, и их экспрессия негативно контролируется репрессором HrcA, первым геном оперона

dnaK. Действие этого репрессора осуществляется через связывание с оператором - инвертированным

повтором CIRCE. Контроль этого регулона осуществляется при участии шаперонов, но, в отличии от

контролируемой шапероном DnaKJ-GrpE деградации σ32 у E. coli, здесь регуляторную функцию

выполняет GroEL-GroES. Этот шаперон необходим для фолдинга HrcA, а титрование шаперона

образующимися в стрессовых условиях аномальными белками приводит к снижению активности HrcA

- 23 -

и усилению экспрессии оперонов groE и dnaK. Таким образом, у грамположительных бактерий GroE, а

не DnaK играет основную роль в регуляции теплового шока.

Репрессор HrcA и CIRCE-элементы быки обнаружены не только у грамположительных, но и у

альфа-протеобактерий, цианобактерий, хламидий и спирохет, однако их роль в регуляции теплового

шока варьирует.

Кo второму классу относится большая группа (50-100) генов, позитивно контролируемых сигма-

фактором общего стресса σB, которые кроме тепла индуцируются еще и голоданием по глюкозе или

кислороду. Этот сигма-фактор регулируется сложным каскадом белок-белковых взаимодействий

(включая фосфорилирование).

К третьему классу относятся все остальные гены, не имеющие общей системы регуляции.

Литература:

1. Susan Gottesman. Proteases and their targets in Escherichia coli. Annu. Rev. Genet. 1996. 30:465-506

2. Susan Gottesman. Regulation by proteolysis: developmental switches. Current Opinion in Microbiology

1999, 2:142-147

5. Холодовой шок

Многие бактерии достаточно часто

Исходное состояние: 30°C

подвергаются холодовому шоку, т.е.

воздействию

температуры

ниже

оптимальной. Энтеробактерии, например,

сталкиваются с этим стрессом при

Стимул: шок при 10°C

экскреции из организма животного,

поэтому адаптация к холодовому шоку,

обеспечивающая

увеличение

выживаемости этих бактерий в условиях

Сенсор: рибосомы

пониженной температуры, представляет

явное

селективное

преимущество.

События, происходящие в бактериальной

клетке при понижении температуры, в

Сигнал: ингибирование трансляции

корне отличаются от происходящих при

тепловом шоке, но также влияют на клетку

весьма

отрицательно.

Понижение

Регулятор: CspA

температуры не оказывает серьезного

воздействия на клеточные белки (хотя их

свойства и меняются, денатурации, в

отличие от теплового шока, не

Экспрессия генов холодового шока

происходит). Гораздо более сильные

изменения претерпевает мембрана клетки -

ее

твердость

увеличивается

(она

фактически замерзает), что затрагивает все

Синтез CspA, CsdA, Rbf и др. белков холодового шока

связанные с мембраной функции. Клетка

борется с этим путем снижения степени

насыщенности мембранных липидов.

Холодовой

шок также вызывает

Аттенуация холодового шока белками CspA и CspE

стабилизацию вторичных структур РНК и

ДНК, что ведет

снижению

эффективности процессов трансляции,

Возврат в исходное состояние

транскрипции и репликации ДНК. Клетка

преодолевает негативные последствия

холодового шока путем синтеза целого ряда

Рис. 5.1. Модель регуляции холодового шока

белков, получивших название белков

- 24 -

холодового шока (cold shock proteins, Csp).

Csp E. coli можно разделить на два класса. К первому относятся белки, практически

отсутствующие у этих бактерий при 37°C и очень сильно индуцируемые при понижении температуры,

ко второму - белки, присутствующие в клетке и при оптимальной температуре, но индуцируемые, хотя

и не столь сильно (<10) при пониженной температуре.

К первому классу относятся белки CspA (основной белок холодового шока), CspB, CspG, CsdA,

RbfA, NusA и PNP. CspA, CspB, CspG и CspI, действуют как шапероны для РНК и ДНК, CsdA -

связанный с рибосомами белок, обладающий "раскручивающей" активностью по отношению к РНК

(хеликаза), RbfA - рибосомсвязывающий фактор, NusA участвует в терминации и антитерминации

транскрипции, а PNP - рибонуклеаза.

Ко второму классу относятся рекомбиназа RecA, фактор инициации трансляции IF-2, ДНК-

связывающий белок нуклеоида H-NS и субъединица ДНК гиразы GyrA.

Около 10% всего белка, синтезируемого в клетке непосредственно после понижения температуры,

составляет CspA, основной белок холодового шока E. coli. Эта бактерия имеет еще

8 белков,

гомологичных CspA - CspB - CspI, но не все из них индуцируются холодом. Четко показана индукция

для CspA, CspB, CspG и CspI. Несмотря на конститутивные промоторы, экспрессия этих белков четко

контролируется. Гены этих четырех белков имеют необычно длинные высоко консервативные

нетранслируемые области на своем 5' конце (5' UTR). Показано, что эта область существенна для

экспрессии cspA и содержит последовательность из 11 оснований, называемую "cold box". Эта

последовательность - место транскрипционной "паузы", приводящей к аттенуации транскрипции cspA.

Причем регуляторной молекулой здесь является сам CspA. РНК-полимераза каким-то образом

преодолевает терминаторный сайт непосредственно после понижения температуры, что ведет к

усилению транскрипции cspA. Оказалось, что антитерминаторной молекулой является сам CspA, а

также CspE и CspC, причем наиболее сильным антитерминатором из этих трех белков является CspE.

(Антитерминация в данном случае происходит просто в результате дестабилизации вторичных

структур, в том числе и терминаторных шпилек, Csp белками. Никакого взаимодействия с РНК-

полимеразой и (или) Nus белками не наблюдается.) С другой стороны, накапливающийся CspA

связывается со своей собственной РНК, вызывая аттенуацию, что ведет к последующему снижению

концентрации белка в фазе адаптации. Кроме того,

5' UTR область отвечает за чрезвычайную

нестабильность мРНК cspA при 37°, и эта же область необходима для стабилизации мРНК при

понижении температуры. Oчень сильная стабилизация мРНК cspA непосредственно после понижения

температуры (время полужизни ее увеличивается с 12 секунд до 20 минут) является еще одним

механизмом регуляции концентрации белка CspA. Такая стабилизация является временной и

прекращается, как только клетки адаптируются к пониженной температуре. (механизм стабилизации

неясен)

Экспрессия CspA регулируется также на уровне трансляции. Помимо последовательности Шайн-

Далгарно, мРНК cspA имеет дополнительную область, комплементарную самому концу 16S рРНК,

расположенную на расстоянии 14 н.п. после инициирующего кодона, так называемый "downstream box"

(DB). Такая последовательность была идентифицирована также у cspB, cspG, csdA и rbfA. Оказывается,

при 15° рибосомы не могут нормально инициировать трансляцию. DB последовательность усиливает

инициацию трансляции за счет дополнительного связывания с

16S рРНК. Гены, имеющие DB

последовательность, обходятся без дополнительных рибосомных факторов, необходимых для

инициации трансляции при пониженной температуре. Неудивительно, что такими факторами являются

RbfA и CsdA. Таким образом, рибосомы являются физиологическим сенсором холодового шока - при

понижении температуры они становятся неспособными инициировать трансляцию всех клеточных

мРНК, за исключением мРНК белков холодового шока. Однако после фазы адаптации, в течение

которой синтезируются дополнительные факторы инициации RbfA и CsdA, рибосомы снова становятся

в состоянии транслировать все мРНК.

Не все гомологи белка CspA индуцируются при понижении температуры. CspD сильно

индуцируется в стационарной фазе и при голодании по глюкозе, причем эта индукция не зависит от

RpoS. CspC и CspE экспрессируются конститутивно при

37°. Очевидно, что это семейство

гомологичных генов произошло от общего предшественника, однако последующая адаптация привела к

приспособлению части гомологов для выполнения специфических функций.

- 25 -

Из всех белков холодового шока третичная структура известна только для CspA. Этот белок

представляет собой β-бочонок, состоящий из 5 антипараллельных β-слоев. Белок имеет два сайта

связывания с РНК. Гидрофильные взаимодействия между белком и нуклеиновой кислотой

осуществляются через 7 ароматических аминокислотных остатков, расположенных на поверхности

молекулы белка. Белок в целом имеет негативно заряженную поверхность с положительно

заряженными сайтами связывания нуклеиновых кислот. После связывания белка с РНК нуклеиновая

кислота уже не сможет образовать вторичную структуру из-за электростатического отталкивания с

поверхностью белка. Такая структура CspA является идеальной для его шаперонной активности.

Литература:

1. S. Phadtare, J. Alsina and M. Inouye. Cold-shock response and cold-shock proteins. Current Opinion in

Microbiology 1999, 2:175-180

2. W. Bae, B. Xia, M. Inouye and K. Severinov. Escherichia coli CspA-family RNA chaperones are

transcription antiterminators. PNAS 2000 97(14):7784-7789

3. S. Phadtare and M. Inouye. Sequence-selective interactions with RNA by CspB, CspC and CspE, members

of the CspA family of Escherichia coli. Molecular Microbiology (1999) 33(5), 1004-1014

6. Сенсорные системы

Для бактерий (как, впрочем, и для любого другого организма) способность координировать

экспрессию генов с изменениями условий окружающей среды дает существенное селективное

преимущество. Адаптация бактерий к изменяющимся условиям среды контролируется белковыми

системами передачи сигнала. Такие системы состоят из белковых модулей-доменов, собранных в

несколько молекул, количество которых варьирует в зависимости от вида бактерии и конкретного

фактора среды. Основными компонентами сенсорных систем являются:

сенсоры (трансмембранные или цитоплазматические), детектирующие изменения окружающих

условий;

внутриклеточные посредники, получающие информацию от сенсоров и передающие ее на

эффекторы;

эффекторы - непосредственные регуляторы физиологического ответа (как правило, на уровне

транскрипции).

Трансмембранные рецепторы.

Что и как детектируется?

Механизм детекции сигнала не совсем ясен.

Детектируемый сигнал может быть как вне-, так и внутриклеточным. В некоторых случаях

показано, что сигнал детектируется периплазматическим доменом. Так, PhoQ - регулятор экспрессии

факторов вирулентности у Salmonella typhimurium, - является сенсором дивалентных катионов, которые,

связываясь непосредственно с периплазматическим доменом, стабилизируют неактивную

конформацию PhoQ.

Сигнал может быть внутриклеточным. Рецептор Aer, участвующий в регуляции аэротаксиса,

детектирует внутриклеточный запас энергии, связываясь с FAD. Еще один пример

- детекция

внутриклеточной концентрации глутамина при регуляции азотного метаболизма.

В ряде случаев показано, что сенсором является трансмембранный домен. Так, Cpx-путь

активирован у мутантов E. coli, лишенных фосфатидилэтаноламина

- таким образом, простое

нарушение мембранной структуры приводит к активации этого сигнального пути. У белка EnvZ E. coli -

гистидинкиназы, участвующей в осморегуляции, периплазматический домен может быть делетирован

без потери сенсорной функции.

Механизм передачи сигнала.

Многие бактериальные рецепторы имеют периплазматический домен-детектор

(P) и

цитоплазматический сигнальный домен

(C), заякоренные в мембране двумя α-спиральными

- 26 -

трансмембранными сегментами. Линейная структура таких белков может быть представлена как TM1-

P-TM2-L-C, где L - цитоплазматический линкер

Сигнальный домен либо сам является гистидинкиназой

(EnvZ) либо с гистидинкиназой

взаимодействует (MCP рецепторы хемотаксиса).

Механизм передачи сигнала с сенсорного на сигнальный домен неясен. Рецепторы обычно

являются мембранными белками, гомодимерами. Предполагалось, что конформационные изменения,

возникающие при связывании субстрата, передаются через мембрану на цитоплазматические домены

рецептора, что влияет на взаимодействие сигнальных доменов между собой. Однако делеция одного из

двух сигнальных доменов (равно как и удаление всех трансмембранных сегментов) у димера не лишает

его активности.

Двухкомпонентные системы

В конце 80-х слово "двухкомпонентные" было использовано для обозначения нового класса

регуляторных систем, найденных у бактерий. На сегодняшний день описаны сотни таких систем у

бактерий, архей и некоторых эукариот. Двухкомпонентные системы выступают в качестве основного

механизма сопряжения реакции со стимулом, позволяющего организмам реагировать на многие

изменения условий окружающей среды. Эти сигнальные системы достаточно сложны и

характеризуются модульной организацией, хорошо адаптированной ко многим клеточным сигнальным

путям и интегрированной с ними.

Стимул

Типичная

ГК

двухкомпонентная

система

состоит из двух белков

ЦМ

гистидиновой

протеинкиназы

Автофосфорилирование

(ГК),

содержащей

консервативный киназный домен

ATP ADP

H-P

и регулятора ответа

(РО),

содержащего

консервативный

Фосфатаза

(ATP)

регуляторный

домен.

Киназа

Внеклеточные

сигналы

детектируются ГК, что приводит

Дефосфорилирование

РО

D-P

к изменению ее активности.

Фосфорилирование

Затем ГК передает фосфогруппу

на РО (реакцию катализирует сам

РО). Перенос фосфата на РО

Ответ

приводит

активации

эффекторного домена этого

белка, что и вызывает в конечном

Рис. 6.1. Модель двухкомпонентной регуляторной системы

итоге

специфический

ГК- гистидинкиназа, РО - регулятор ответа, H - консервативный

физиологический ответ.

гистидиновый остаток ГК, D - консервативный остаток

аспарагиновой кислоты РО

основе

работы

двухкомпонентной системы лежат три реакции, дающие два фосфорилированных продукта:

1. Автофосфорилирование ГК:

ГК-His + АТФ ÅÆ ГК-His~Ф + АДФ

2. Перенос фосфата:

ГК-His~Ф + РО-Asp ÅÆ ГК-His + РО-Asp~Ф

3. Дефосфорилирование:

РО-Asp~Ф + H2O ÅÆ РО-Asp + PI

- 27 -

γ-фосфат из АТФ сначала переносится на боковую цепь консервативного гистидинового остатка

ГК (1). Затем РО катализирует перенос фосфата от фосфогистидина на аспартатный остаток своего

регуляторного домена (2). Наконец, фосфат переносится от фосфоаспартата к воде в реакции гидролиза

(3).

Хоть ГК и похожи по своей основной функции (фосфорилирование белков) на "классические"

Ser/Thr/Tyr киназы, химизм реакции принципиально отличается - ГК образует не фосфоэфирную, а

фосфоамидную связь. Реакция гидролиза фосфоамидной связи имеет гораздо большее отрицательное

значение ∆G по сравнению с гидролизом фосфоэфирной связи, поэтому равновесие р-и (1) сдвинуто в

сторону нефосфорилированного белка ГК. Следовательно, только очень небольшой процент ГК

существует в фосфорилированном виде => не фосфорилирование ГК как таковое, а перенос фосфата

является основным в работе этого фермента. Богатая энергией связь N~P идеально подходит для

передачи фосфата. Именно поэтому такая же связь используется хорошо знакомыми вам ферментами I

и II ФТС, основной функцией которых является также не фосфорилирование как таковое, а передача

фосфата "по цепочке" в направлении его конечного акцептора - фосфорилируемого сахара.

В молекуле РО фосфорилируется остаток аспартата. Предположительно, именно этот остаток

используется, т.к. фосфорилирование его длинной ацильной цепи вызывает протяженные

конформационные изменения в молекуле РО, необходимые для изменения эффекторной активности.

Еще одним важным свойством фасфоаспартата является быстрый гидролиз ацилфосфата как в кислой,

так и в щелочной среде. К тому же, многие РО имеют автофосфатазную активность, еще более

уменьшающую время полужизни фосфоаспартата.

Таким образом, основным результатом выбора для фосфорилирования специфических остатков в

молекулах ГК и РО является высокая мобильность системы. При отсутствии стимула оба компонента

будут дефосфорилированы. Детекция стимула гистидинкиназой вызовет ее фосфорилирование и очень

быструю передачу фосфата молекуле регулятора ответа, что приведет к быстрому ответу бактерии на

изменившиеся условия. В свою очередь, легкость дефосфорилирования молекулы РО приведет к

быстрому возвращению всей регуляторной системы, а вместе с ней и метаболизма бактериальной

клетки, в исходное

(нефосфорилированное) состояние при исчезновении стимула, вызвавшего

первоначальное фосфорилирование ГК.

Распространенность двухкомпонентных систем

Двухкомпонентные сигнальные системы с участием фосфорилируемых остатков гистидина и

аспартата наиболее часто встречаются у бактерий. Несмотря на обнаружение таких систем у эукариот,

здесь в сигнальных цепях доминируют сигнальные каскады с переносом фосфата между остатками

серина, треонина и тирозина. С друкой стороны, Ser/Thr/Tyr киназы у прокариот тоже имеются. Пока

нет удовлетворительного объяснения предпочтительному использованию той или иной системы у про-

и эукариот. Количество генов, кодирующих белки двухкомпонентных систем, значительно варьирует в

геномах различных организмов - от 0 у Mycoplasma genitalium до 2.5% генома у Synechocystis sp. В

полностью сиквенированных геномах общее количество ГК и РО следующее:

Mycoplasma genitalium - 0

Haemophilus influenzae - 9

Helicobacter pylori - 11

Thermotoga maritima -19

Escherichia coli - 62

Bacillus subtilis - 70

Synechocystis sp. - 80

---------------

Methanococcus jannaschii - 0

Methanobacterium thermoautotrophicum - 24

---------------

Caenorhabdis elegans - 0

Saccharomyces cerevisiae - 4 (одна система)

У эукариот пока описаны лишь единичные примеры ГК и РО, однако у некоторых организмов их

число больше - так, у слизевика Dictyostelium discoideum имеется как минимум 11 ГК. Кроме того,

эукариотические системы имеют ряд отличий от прокариотических. Прежде всего, гибридные ГК,

- 28 -

содержащие и РО домен, редки у прокариот (5 из 30 ГК у E. coli), тогда как у эукариот все описанные

ГК гибридные (с пока единственным исключением). Прокариотические РО являются, как правило,

транскрипционными факторами, тогда как только один из описанных пока эукариотических РО имеет

ДНК-связывающий домен.

Структура и функции гистидиновых протеинкиназ

У типичных двухкомпонентных систем сенсорные ГК "следят" за внешними стимулами и

передают полученную информацию РО путем его фосфорилирования. ГК, как правило, содержит две

основных "части"

- характеризующуюся большим разнообразием сенсорную и консервативную

киназную. Общая активность киназы модулируется сигналами, детектируемыми сенсорным доменом.

ГК претерпевает АТФ-зависимое автофосфорилирование по инвариантному гистидиновому остатку,

расположенному в киназном же домене. ГК - димер, причем в реакции автофосфорилирования один

мономер ГК фосфорилирует консервативный гистидиновый остаток другого. В отличие от типичных

киназных каскадов, в которых одна киназа имеет множество мишеней, в случае двухкомпонентных

систем РО стехиометрически переносит фосфат с фосфо-ГК на консервативный Asp своего

регуляторного домена. К тому же многие ГК имеют фосфатазную активность, позволяющую им

дефосфорилировать свой РО. Такие ГК используются при необходимости быстро "выключать"

сигнальную цепочку.

ГК исключительно разнообразны, и

Сенсорный домен

Каталитический домен

все это разнообразие было создано за

счет простых комбинаций сенсорных,

каталитических и вспомогательных

доменов (Рис. 6.2). Модульная структура

этих белков позволяет адаптировать

свойства каждой ГК к специфическим

нуждам конкретной сигнальной системы.

(a)

Различные ГК имеют размер в пределах

Принимающий

Эффекторный домен

Класс

40-200 kDa. Более крупные ГК могут

состоять

из

5-6

структурно и

D13

D57

K109

Связывание ДНК

OmpR

функционально различных доменов.

D13

D57

K109

Связывание ДНК

FixJ

Несмотря на такое разнообразие ГК

могут быть разделены на два больших

D13

D57

K109

АТФаза

Связывание ДНК

NtrC

класса: классические и гибридные.

Метилэстераза/

D13

D57

K109

CheB/SprE

Наиболее "традиционные" ГК,

деградация

например, осмосенсор EnvZ из E. coli,

D13

D57

K109

CheY

действуют как мембранные рецепторы с

(b)

сенсорным доменом, расположеным в

периплазме.

EnvZ

имеет

две

Рис. 6.2. Доменная организация гистидинкиназ (a) и

трансмембранных α-спирали, которые

регуляторов ответа (b).

разделяют белок на периплазматический

Серыми овалами обозначены трансмембранные домены.

аминоконцевой сенсорный домен и

Консервативные участки каталитических доменов

цитоплазматический карбоксиконцевой

обозначены буквами.

киназный домен. Другие ГК могут иметь

больше трансмембранных сегментов (до

4-8) или не иметь их вовсе (киназы хемотаксиса CheA и азотного регулона NtrB). В последнем случае

ГК являются цитоплазматическими и детектируют внутриклеточные изменения (непосредственно либо

в результате взаимодействия с цитоплазматическими регуляторными белками).

ГК, принадлежащие ко второму классу, гибридных ГК, имеют множественные донорные и

акцепторные сайты для передачи фосфата. Вместо одного акта передачи фосфата гибридные ГК

используют многоступенчатые схемы "ретрансляции" сигнала фосфорилирования. Сложность общей

структуры гибридных ГК позволяет иметь несколько "входов", а иногда и "выходов" для одного

сигнального пути. Типичным представителем гибридных ГК является белок ArcB, регулятор

активности ряда генов в анаэробиозных условиях. ArcB имеет два N-концевых трансмембранных

сегмента, за которым следуют киназный домен, затем домен, сходный с регуляторным у РО и, наконез,

- 29 -

второй гистидинсодержащий домен, называемый HPt-домен

(от His-containing phosphotransfer

гистидинсодержащий фосфатпереносящий)

Каталитическое киназное ядро.

Унифицирующим структурным свойством семейства ГК является характерное киназное ядро,

состоящее из домена димеризации и АТФ/АДФ-связывающего фосфотрансферного или

каталитического домена.

Киназное ядро имеет размер ~350 АК и отвечает за связывание АТФ и осуществление киназной

реакции. Консервативный остаток гистидина, являющийся субстратом киназной реакции, располагается

в домене димеризации.

HPt-домены

у прокариот встречаются исключительно в составе гибридных киназ, тогда как у эукариот - как

отдельные белки. Эти домены имеют размер около 120 АК и содержат остаток гистидина, способный

участвовать в фосфотрансферных реакциях. HPt-домены не имеют ни киназной, ни фосфатазной

активности, поэтому они идеально приспособлены для коммуникации между различными белками.

Интересно, что при всем разнообразии первичных последовательностей HPt-доменов их третичная

структура очень схожа и напоминает таковую домена димеризации киназного ядра, включая

расположение консервативного гистидинового остатка.

Сенсорный домен

Изменения в окружающей среде детектируются непесредственно

(или опосредованно)

аминоконцевым сенсорным доменом ГК. Между разнообразными мембранными сенсорными доменами

практически полностью отсутствует сходство на уровне первичной последовательности, что

поддерживает идею о специфичности детектируемых ими взаимодействий. В большинстве случаев

специфический стимул и механизм его детекции остаются неизвестными. Информация о трехмерной

структуре этих доменов начинает появляться только сейчас, поэтому как сигнал передается к киназному

ядру, пока не ясно.

Примером цитоплазматических сенсоров являются PAS-домены. Эти универсальные модули

"чувствуют" изменения освещенности, окислительно-восстановительного потенциала, концентрации

кислорода и небольших лигандов. Имя домена происходит от первых букв названий трех

эукариотических белков, в которых он был впервые обнаружен. С доменом обычно связана одна из

нескольких простетических групп, которые как раз и определяют распознавание разнообразных

сигналов. Такими кофакторами могут быть, например, гем, ФАД, ФМН и т.д. PAS-домены имеют

небольшой размер (~100 АК) и располагаются перед (ближе к N-концу) киназным ядром, как правило,

после одной или нескольких пар трансмембранных сегментов. Таким образом, цитоплазматические

сенсоры с PAS-доменами тоже являются мембранными белками. Однако имеются и не связанные с

мембраной цитоплазматические сенсоры, например, NtrB, участвующий в регуляции азотного

метаболизма.

(более подробно о снсорных доменах и механизме работы трансмембранных сенсорных ГК

поговорим в разделе о хемотаксисе).

Линкерный домен

У трансмембранных ГК периплазматический сенсорный домен соединяется с цитоплазматическим

киназным ядром при помощи трансмембранной α-спирали и цитоплазматического линкера. Линкерные

домены совершенно необходимы для нормального функционирования сенсорных ГК, однако об их

функциях известно немного. Размер линкеров варьирует в пределах 40-180 АК. Многие из них имеют

характерный α-спиральный coiled coil мотив, в большинстве случаев предшествующий

фосфорилируемому гистидиновому остатку киназного ядра. Две наиболее вероятные функции

линкерных доменов - правильное расположение мономеров в димере ГК и передача сигнала от

сенсорной к киназной части белка.

Структура и функции регуляторов ответа

Активности и структура

У большинства прокариот РО - конечное звено сигнального пути, функционирующее как

зависящий от фосфорилирования "выключатель" адаптивного ответа. РО катализирует перенос фосфата

от фосфогистидина ГК к консервативному остатку аспартата в своем регуляторном домене.

Большинство РО также катализируют автодефосфорилирование, что ограничивает время пребывания

- 30 -

РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА. Курс лекций - часть 2