содержание .. 4 5 6

РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА. Курс лекций - часть 6

2. S. Lory. Secretion of proteins and assembly of bacterial surface organelles: shared pathways of extracellular

protein targeting. Current Opinion in Microbiology 1998, 1:27-35

(Сравнительная характеристика 4 путей секреции)

4. L. W. Cheng and O. Schneewind. Type III machines of Gram-negative bacteria: delivering the goods. Trends

in Microbiology 214-220 Vol. 8 No. 5 May 2000

5. C. J. Hueck. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology

And Molecular Biology Reviews, 1998, p. 379-433 Vol. 62, No. 2

14. Строгий ответ

Это реакция клеток на аминокислотное голодание, приводящая к значительному замедлению

синтеза стабильных РНК (рРНК и тРНК) и некоторых мРНК, необходимых для синтеза рибосомных

белков, факторов элонгации EF-Ts, EF-Tu и EF-G, α-субъединицы РНК-полимеразы, а также к

усилению транскрипции оперонов биосинтеза аминокислот. Общий синтез РНК снижается в итоге до 5-

10% от нормального. Возрастает скорость деградации белка, уменьшается синтез нуклеотидов, липидов

и углеводов.

Строгая регуляция осуществляется несколькими генами, наиболее изученным из которых является

ген relA. Этот ген отвечает за синтез двух специфических нуклеотидов, накапливающихся при

аминокислотном голодании - гуанозинтетрафосфата (ppGpp) и гуанозинпентафосфата (pppGpp). Эти

нуклеотиды и являются ингибиторами синтеза специфических типов РНК. Сигналом образования

ppGpp служит не непосредственно отсутствие какой-либо аминокислоты, а недостаток аминоацил-

тРНК. Белок RelA в ассоциации с рибосомами синтезирует (p)ppGpp только когда в А-сайте рибосомы

оказывается ненагруженная аминикислотой тРНК.

Строгий ответ

- фундаментальный механизм регуляции, свойственный практически всем

бактериям, но интересно, что некоторые из них приспособили его в качестве сенсорной системы для

регуляции других клеточных функций. Так, миксобактерии используют гуанозинтетрафосфат в

качестве сигнала к образованию плодовых тел. Клетки миксобактерий не имеют жгутиков, однако

способны передвигаться за счет скольжения по различным поверхностям, включая поверхность других

клеток. Используя такую способность, миксобактерии строят свои плодовые тела, начиная с

однородного тонкого слоя клеток. Весь процесс занимает несколько часов. сначала появляется

несколько локальных скоплений клеток, затем, как только в одном из них соберется около 105 клеток,

начинается миграция всех остальных клеток популяции в это скопление, формирование плодового тела

характерной для каждого вида формы и дифференциация палочковидных клеток в сферические споры.

Голодание по любой аминокислоте вызовет накопление (p)ppGpp, а поскольку синтез аминоацил-

тРНК зависит от АТФ, недостаток энергии или фосфата будет иметь тот же эффект, что и

аминокислотное голодание. У миксобактерий накопление (p)ppGpp имеет тот же эффект, что и у E. coli,

но дополнительно еще запускает программу дифференциации, контроль которой осуществляется рядом

секретируемых пептидных факторов и соответствующих сенсоров вкупе с системами передачи сигнала.

Строгий ответ индуцирует экспрессию генов, необходимых для перестройки внутриклеточного

метаболизма в соответствии с голоданием, а также индуцирует синтез специфического феромона

- А-

фактора. A-фактор активирует экспрессию группы генов, необходимых для агрегации миксобактерий.

Одним из этих генов является csgA, кодирующий синтез следующего межклеточного сигналa, C-

фактора - поверхностного белка размером 17 кДа. C-фактор, в свою очередь, контролирует три

процесса - агрегацию клеток, экспрессию целого ряда генов (включая сам csgA) и споруляцию. C-

фактор, закрепленный на поверхности одной клетки, при контакте с другой индуцирует активацию

двухкомпонентной сенсорной системы с регулятором транскрипции FruA. FruA имеет три мишени - frz,

devTRS и csgA. Первая мишень кодирует белки, гомологичные Che белкам E. coli и отвечающие за

направление скольжения миксобактерий, и результатом такой активации является агрегация клеток в

плодовые тела. Продукты оперона devTRS необходимы непосредственно для споруляции.

- 82 -

15. SOS ответ

Бактерии очень часто подвергаются воздействию различных природных и антропогенных

воздействий, которые нарушают целостность ДНК. Повреждения ДНК блокируют ее репликацию и

поэтому представляют серьезную угрозу выживанию клетки. Для борьбы с такими повреждениями

бактерии имеют целый ряд белков, репарирующих ДНК, нормализующих клеточное деление,

повышающих толерантность к повреждениям, которые координированно экспрессируются после

повреждения ДНК. Такая глобальная реакция получила название "SOS-ответ"

Основная регуляция SOS-ответа у E. coli осуществляется двумя белками - рекомбиназой RecA и

транскрипционным репрессором LexA, которые и сами тоже являются SOS-индуцируемыми.

Накопление повреждений в ДНК приводит к активации копротеазной активности белка RecA. В

активированном состоянии RecA индуцирует автокаталитическое расщепление белка LexA. В

результате резко падает концентрация функционально активного димера LexA. освобождаются

операторы генов SOS-регулона и резко возрастает их транскрипция.

Повреждение ДНК не индуцирует SOS-ответ непосредственно. Предполагается, что однонитевая

ДНК, которая накапливается в клетке при ингибировании репликации ДНК повреждениями, дает тот

метаболический сигнал, который и активирует копротеазную активность RecA. В активированном

состоянии RecA образует спиральные нуклеопротеиновые филаменты на однонитевой ДНК. LexA

распознает эту структуру и связывается с глубокой спиральной бороздкой RecA-нуклеофиламента. Это

связывание индуцирует быстрое автокаталитическое расщепление белка LexA в области шарнира,

соединяющего два домена LexA

- карбоксиконцевой димеризационный и аминоконцевой ДНК-

связывающий. Таким образом, репрессор LexA ресщепляется автокаталитически, так же как и белки

UmuD, MucA и репрессор фага λ CI. А роль белка RecA заключается лишь в активации этой

автокаталитической реакции (из-за чего RecA и называют копротеазой).

Гены SOS-регулона можно разделить на две группы. "Классические" негативно регулируются на

транскрипционном уровне белком LexA и индуцируются в результате его автокаталитического

протеолиза, стимулируемого активированным RecA. Эти гены имеют в своей промоторной области

четко выраженный LexA сайт (консенсус 5'-taCTGTatatatatACAGta-3').

Наиболее значимыми "классическими" членами SOS-регулона являются следующие гены (их

сейчас известно около 30):

Гены

Продукты/функции

lexA

Индукция SOS-ответа

recA

Рекомбинационная репарация; индукция SOS-ответа

ruvAB

Рекомбинационная репарация

recN

Рекомбинационная репарация

uvrA

Эксцизионная репарация (белок, узнающий повреждения в ДНК)

uvrB

Эксцизионная репарация (эндонуклеаза)

uvrD

Эксцизионная репарация (хеликаза)

umuDC

Склонная к ошибкам репарация (SOS-мутагенез)

sulA

Ингибитор клеточного деления

Все больше и больше обнаруживается SOS-индуцируемых генов, которые не регулируются

непосредственно LexA.

SOS-регулон интересен тем, что всего одна пара регуляторных белков обеспечивает несколько

вариантов ответа на повреждение ДНК. Такое поведение частично можно объяснить различной

аффинностью репрессора к операторным сайтам, расположенным в промоторных областях

соответствующих генов. Чем слабее связывание репрессора с оператором, тем раньше произойдет

индукция соответствующего гена при SOS-ответе. Так, UvrA белок, контролирующий эксцизионную

репарацию, индуцируется практически немедленно после возникновения повреждений ДНК, и первые

20-30 минут SOS-ответа клетка репарирует повреждения путем вырезания поврежденных нуклеотидов

и оснований. Через полчаса в клетке накапливается достаточно RecA (его количество увеличивается

более, чем в

10 раз), RuvAB и RecN для активации рекомбинационной репарации, которая

продолжается еще около 30 минут. Приблизительно через час после индукции "включается" склонная к

ошибкам репарация (контролируемая генами umuDC), которая продолжается еще 30-40 минут. Такая

- 83 -

временная последовательность событий характерна для клеток E. coli, растущих относительно медленно

на синтетической среде с временем удвоения 50 минут.

Наиболее важным следствием такой регуляции является то, что такая "ступенчатая" индукция

членов SOS-регулона позволяет клеткам с минимальными повреждениями индуцировать системы

безошибочной (но достаточно медленной) репарации (такой как эксцизионная и рекомбинационная), не

включая другие, потенциально склонные к ошибкам

(хотя и быстрые) репарационные пути. И

действительно, индукция генов umuDC, необходимых для склонной к ошибкам репарации в обход

крупных повреждений, требует гораздо более сильного повреждения ДНК. И, наконец, длительное

присутствие в клетке нерепарируемых повреждений приводит к индукции SulA-зависимой

филаментации и позволяет профагам "удрать" из гибнущей клетки путем индукции литического цикла.

SOS-мутагенез

Достаточно давно было замечено, что индукция SOS-ответа приводит к существенному

увеличению частоты мутаций. Этот феномен оказался связан с вариантом репарации, который

индуцируется при SOS-ответе в последнюю очередь. Идея UmuDC-зависимой репарации заключается в

том, что, когда клетка не может (или не успевает) восстановить исходную последовательность ДНК, она

пытается продолжить репликацию ДНК, вставляя случайные основания в синтезируемую цепь напротив

повреждений. Это позволяет репликационной вилке продолжить работу (и таким образом восстановить

жизнеспособность клетки). Это позволяет клетке решить немедленную проблему, однако создает

потенциальные проблемы в дальнейшем из-за очень высокой вероятности возникновения мутаций.

Для индукции SOS-мутагенеза требуются ферменты реплисомы, белок RecA и белки UmuD и

UmuC, причем UmuD должен претерпеть автопротеолитическое расщепление (аналогично LexA) с

образованием UmuD', две субъединицы которого образуют комплекс с UmuC (UmuD'2UmuC), который

вместе с другими компонентами реплисомы и обеспечивает мутагенный синтез ДНК (поэтому комплекс

UmuD'2UmuC называют еще ДНК-полимеразой V). UmuD'2UmuC связывается с концом RecA-

нуклеофиламента, затем с ДНК-полимеразой, что позволяет клетке возобновить репликацию ДНК, а

возобновление репликации приводит к разрушению нуклеофиламента (и, соответственно, ликвидации

SOS-индуцирующего сигнала).

Литература:

1. W.H. Koch, R. Woodgate. DNA Repair in Prokaryotes and Lower Eukaryotes. DNA Damage and

Repair.vol.1: Edited by: Nickoloff and MF Hoekstra

2. G.C. Walker. The SOS Response of Escherichia coli. The Bible. 1996 p 1400-1416

17. Регуляция стабильности мРНК

Синтез определенного количества матричной РНК не обязательно гарантирует продукцию

пропорционального количества белка. Сила экспрессии определенного гена зависит не только от

эффективности его транскрипции, но в значительной мере от того, что происходит с транскриптом

после его синтеза. Сразу после синтеза транскрипт приобретает определенную вторичную структуру, от

чего в значительной степени будут зависеть его стабильность и скорость процессинга (у эукариот), а

также эффективность трансляции. Дополнительные возможности регуляции имеются у эукариот в связи

с наличием сложного процессинга первичных транскриптов. Наконец, эффективность экспрессии гена

очень сильно зависит от стабильности его мРНК. Так, у прокариот время полужизни различных мРНК

варьирует в пределах от 20 секунд до более чем 20 минут.

Стабильность мРНК обычно не зависит напрямую от ее размера, а определяется многими

факторами, основными из которых являются ее вторичная структура, элементы первичной

последовательности (сайты узнавания для специфических рибонуклеаз) и эффективность трансляции.

Наличие элементов вторичной структуры, как правило, стабилизирует РНК, поскольку

препятствует работе многих РНКаз (Рис. 17.1). Большинство мРНК имеют на своем нетранслируемом 3'

конце достаточно стабильные шпилечные структуры. Это в первую очередь терминаторы, однако

имеются и другие элементы вторичной структуры. Так, у E. coli имеется около 500 так называемых REP

(repetitive extragenic palindromes) элементов

- палиндромов, способных образовывать достаточно

крупные шпилечные структуры на 3' концах матричных РНК. В некоторых случаях шпилечные

структуры могут присутствовать и на 5' концах мРНК.

- 84 -

Немаловажным

для

5' Стабилизирующий

стабильности

мРНК является

REP последовательность

элемент

наличие

хорошего

старт

Терминатор

рибосомсвязывающего сайта

(на

трансляции

транскрипции

надлежащем расстоянии перед

конец

старт-кодоном).

Рибосома,

RBS

трансляции

транслирующая мРНК, защищает

35-50 нуклеотидов от атаки

рибонуклеаз,

которые

могут

сайты действия

разрушить РНК. Если мРНК

рибонуклеаз

эффективно транслируется, она

фактически полностью будет

Рис.17.1. Факторы, влияющие на стабильность

покрыта

рибосомами,

что

прокариотической мРНК

Protected

существенно уменьшит вероятность ее деградации

3′ end

рибонуклеазами.

Даже во время трансляции мРНК может выступать

субстратом для рибонуклеаз. Уже один разрыв в молекуле

мРНК с большой вероятностью ее инактивирует. Если в

5¢

3¢

результате

разрыва

оказывается

удален

рибосомсвязывающий сайт, такая мРНК, естественно, не

Endonuclease

может транслироваться. Если же разрыв произойдет где-то

посередине кодирующей последовательности, трансляция

будет происходить, однако белок окажется укороченным и

5¢

3¢

почти наверняка нефункциональным. Кроме того, клетка,

скорее всего, повесит на такой укороченный белок ярлык,

направляющий его на протеолиз (напр., при помощи ssrA

Exonuclease

РНК у E. coli). Кроме того, обычно, если деградация мРНК

уже началась, процесс ее разрушения завершается очень

5¢

быстро.

Деградация мРНК у E. coli осуществляется совместно

эндо- и экзорибонуклеазами. Две экзонуклеазы, РНКаза II и

Рис.17.2. Деградация мРНК

полинуклеотидфосфорилаза

(ПНФаза, PNPase), разрушают

прокариот

РНК в направлении

3'->5'. Похожие экзорибонуклеазы

широко распространены как у про-, так и у эукариот. РНКаза

(a)

5′-3

¢pathway

- гидролитический фермент, дающий при расщеплении

PAB PAB PAB

РНК нуклеотидмонофосфаты. ПНФаза использует при

5¢Gppp

AAAA

3¢

гидролизе

неорганический

фосфат,

генерируя

Deadenylation and decapping

нуклеотиддифосфаты. Инактивация обоих экзорибонуклеаз

приводит к накоплению в клетке промежуточных продуктов

деградации мРНК и является летальной.

5¢

концы многих мРНК

(в первую очередь

образовавшиеся в результате ρ-независимой терминации)

образуют стабильные шпилечные структуры, которые

(b)

3¢-5

¢pathway

PAB PAB PAB

защищают РНК от деградации экзорибонуклеазами.

5¢Gppp

AAAA

3¢

Расщепление мРНК "в середине" при помощи

эндорибонуклеазы может убрать шпильку, образуя

Deadenylation

незащищенный 3' конец, доступный для экзорибонуклеаз.

Эндорибонуклеаза E (РНКаза E, RNAse E), первоначально

5¢Gppp

3¢

идентифицированная как необходимая для процессинга

рибосомной 5S РНК, также определяет стабильность многих

мРНК.

Эндонуклеазное расщепление РНК менее важно у

Рис.17.3. Деградация мРНК

эукариот, где основная деградация мРНК обеспечивается

эукариот

экзонуклеазами.

дрожжей

описано

два

- 85 -

экзонуклеолитических механизма, работающих в направлениях 5'->3' и 3'->5'. Эукариотические мРНК

защищены от деградации кэпом на 5' конце и поли(А) хвостом в комплексе с поли(А)-связывающим

белком

(PAB) на

3' конце, и декэпирование и деаденилирование являются необходимыми

предпосылками для деградации. У дрожжей в 5'->3' пути деградации декэпирование зависит от

деаденилирования, и а мРНК деградируется экзонуклеазой XRN1.

3'->5' путь деградации

обеспечивается мультибелковым комплексом - экзосомой. Интересно, что E. coli не имеет 5'->3'

экзонуклеазного пути. 5' конец мРНК у прокариот не кэпирован, а 5'->3' экзорибонуклеазы не известны,

однако структура, подобная кэпу, все же имеется. На 5' конце эубактериальных мРНК , как правило,

находится трифосфат, и его присутствие ингибирует действие эндорибонуклеаз. После первого

расщепления мРНК эндорибонуклеазой на вновь образованном 5' конце РНК остается монофосфат, уже

неспособный блокировать дальнейшее эндонуклеолитическое расщепление. Именно поэтому первая

атака эндорибонуклеазой является лимитирующей по времени, а дальнейшее расщепление мРНК при

помощи эндонуклеаз и

3'->5' экзонуклеаз

(для последних первое расщепление мРНК также

обеспечивает незащищенный 3' конец) происходит очень быстро.

Бактериальные РНКазы, участвующие в деградации мРНК

РНКаза Е

Описана у E. coli. Кодируется геном rne. Продукт гена - крупный белок (1061 аминокислотный

остаток). активен в виде гомодимера. Белок можно разделить на три домена. В центре расположен

богатый аргинином РНК-связывающий домен. N-концевой каталитический домен имеет слабую

гомологию с рибосомным белком S1. Имеется также некоторая гомология между РНКазой Е и

миозином.

Специфичность РНКазы Е по отношению к субстрату не очень четкая. В качестве консенсус-

последовательности сайта предпочтительного узнавания был предложен пентануклеотид

(A/G)AUU(A/U), однако по другим данным единственным ограничением по отношению к

последовательности РНК является разрезание "слева" от динуклеотида AU в однонитевых участках

молекулы. Еще одним ограничением является то, что РНКаза Е наиболее активно действует только в

непосредственной близости от свободного 5' конца, причем это должен быть конец с монофосфатом.

Наконец, двухцепочечная РНК резистентна к деградации РНКазой Е. Таким образом, для успешного

расщепления субстрата РНКаза Е должна распознать специфический внутренний сайт и свободный 5'

нуклеозидмонофосфат.

Экспрессия РНКазы Е находится под негативным контролем, причем регулятором является сама

РНКаза Е, и контроль осуществляется за счет ее собственной РНКазной активности. В условиях

эксперимента можно добиться 40-кратного различия в количествах rne-транскрипта за счет изменения

клеточной концентрации функциональной РНКазы Е.

РНКаза III

РНКаза III (кодируемая геном rnc) была обнаружена у E. coli как эндорибонуклеаза, разрезающая

двухцепочечные молекулы РНК. Разрез может быть одно- или двунитевым, что частично зависит от

степени спаренности оснований вокруг сайта разрезания. Специфичность по отношению к конкретной

последовательности контролируется негативно, т.е. присутствие ряда оснований в определенных

позициях сильно ингибирует разрезание.

РНКаза III участвует в процессинге рРНК и деградации ряда мРНК, хотя стабильность

большинства клеточных мРНК не изменяется у мутанта по РНКазе III. Инактивация rnc летальна у B.

subtilis, но не летальна у E. coli.

РНКаза III - гомодимер из субъединиц размером 25.4 кДа. Фермент содержит четко выраженные

РНК-связывающий и РНКазный домен. Экспрессия rnc авторегулируется (как и в случае РНКазы Е ,

каталитическая активность РНКазы III напрямую участвует в авторегуляции). Активность РНКазы III

регулируется также и на посттрансляционном уровне путем фосфорилирования.

Полинуклеотидфосфорилаза

Кодируется геном pnp. Гомотример из субъединиц размером 77.1 кДа. Катализирует обратимый

фосфоролиз полирибонуклеотидов с освобождением нуклеозиддифосфатов. Содержит два РНК-

связывающих домена - один гомологичен некоторым эукариотическим гяРНК, а второй - рибосомному

белку S1. Фермент широко распространен у бактерий. Экспрессия полинуклеотидфосфорилазы, как и

описанных выше РНКаз, находится под автоконтролем.

- 86 -

РНКаза II

Кодируется геном rnb. Как и полинуклеотидфосфорилаза, процессивно деградирует однонитевую

РНК с 3' конца, однако делает это путем гидролиза, а не фосфоролиза мРНК, освобождая

нуклеозидмонофосфаты. Мономер с молекулярной массой 72.3 кДа. Содержит карбоксиконцевой РНК-

связывающий S1 домен. Экспрессия РНКазы II находится в обратной корреляции с уровнем

полинуклеотидфосфорилазы, что предполагает участие этих двух РНКаз в деградации матричных РНК

друг друга

Активность обеих экзорибонуклеаз ингибируется элементами вторичной структуры, однако

полинуклеотидфосфорилаза к такому ингибированию значительно менее чувствительна.

Мультибелковые комплексы деградации РНК.

При очистке РНКазы Е из E. coli был обнаружен крупный мультибелковый комплекс - РНК-

деградосома. Основными компонентами этого комплекса являются РНКаза Е, ПНФаза и РНК-хеликаза

RhlB (Рис. 17.4). Ассоциация РНКазы Е с ПНФазой в одном комплексе дает прямое доказательство их

кооперации при деградации мРНК. В составе комплекса также выделяется енолаза (гликолитический

фермент) и (в субстехиометрических количествах) полифосфаткиназа PPK и шапероны DnaK и GroEL;

роль этих компонентов в деградации мРНК неясна.

РНКаза Е - крупный мультидоменный белок. Эндонуклеазная активность связана с N-концевым

доменом. Этот же домен обладает дополнительной активностью, отвечающей за деградацию поли(А) и

поли(U) хвостов. C-концевая половина белка взаимодействует с тремя основными компонентами

деградосомы, RhlB, PNPазой и енолазой. Таким образом, РНКаза Е - сложный мультидоменный белок,

N-конец которого является каталитическим, а C-конец выполняет роль каркаса, на котором собираются

остальные компоненты деградосомы.

Несколько мультибелковых РНК-

деградирующих комплексов, структурно и

функционально гомологичных бактериальной

РНК-деградосоме, описано у эукариот. Все

эти комплексы отвечают за деградацию РНК

в 3'->5' направлении. Комплекс, содержащий

гомологи PNPазы и РНКазы Е, участвует в

процессинге и деградации мРНК в

хлоропластах шпината. Еще два комплекса

описаны у дрожжей. Комплекс mtEXO,

содержащий экзонуклеазу, сходную с

РНКазой II из E. coli, деградирует интроны

мРНК в митохондриях Saccharomyces

cerevisiae.

Экзосома

cerevisiae,

Рис.17.4. Прокариотическая РНК-деградосома

участвующая как в процессинге рибосомной

РНК, так и в деградации мРНК, содержит

пять

3'->5' экзорибонуклеаз, четыре из

которых гомологичны РНКазе II или PNPазе из E. coli. Человеческий гомолог дрожжевой экзонуклеазы

Rpr4p был обнаружен в составе большого комплекса, что свидетельствует в пользу наличия экзосомы и

в клетках животных.

РНК-хеликазы в деградации РНК

Идентификация РНК-хеликазы RhlB в составе бактериальной деградосомы явилась первым

свидетельством активной роли РНК-хеликаз в деградации РНК. RhlB принадлежит к классу DEAD-бокс

белков. Это семейство АТФ-зависимых РНК-хеликаз, имеющих 8 консервативных мотивов, включая

аминокислоты аспартат (D), глутамат (E), аланин (A) и опять аспартат (D). Белки-члены этого семейства

участвуют в разнообразных процессах, включая сборку рибосом, инициацию трансляции и сплайсинг

РНК. В экспериментах in vitro функция RhlB в составе деградосомы была четко показана. Элементы

вторичной структуры в РНК часто создают препятствия для продвижения таких ферментов, как

ПНФаза. Показано, что присутствие RhlB в составе деградосомы стимулирует в АТФ-зависимой манере

деградацию при помощи ПНФазы субстрата с выраженной вторичной структурой. RhlB "раскручивает"

- 87 -

двухцепочечные участки РНК, что позволяет экзорибонуклеазе продвинуться дальше по субстрату.

RhlB сильно активируется взаимодействием с C-концевой частью РНКазы Е. Дрожжевые экзосома и

комплекс mtEXO также имеют в своем составе хеликазы, подобные RhlB.

Полиаденилирование оказывает противоположный эффект на стабильность бактериальных и

эукариотических мРНК.

Поли(А)-полимераза I (PAP I) из E. coli кодируется геном pcnB (plasmid copy number), который

был первоначально идентифицирован по его действию на копийность плазмид с ColEI репликоном. PAP

I участвует в деградации РНК I - небольшой регуляторной РНК, которая взаимодействует с РНК II -

праймером, инициирующим репликацию ДНК ColEI. РНК I, время полужизни которой составляет 2

минуты, первоначально укорачивается РНКазой Е на 5 нуклеотидов с 5' конца. Время полужизни

полученного интермедиата (РНК I-5) возрастает в 10 раз в pcnB штамме (у которого отсутствует PAP I

активность). E. coli имеет еще один белок с поли(A)-полимеразной активностью (PAP II). Инактивация

обеих поли(A)-полимераз летальна. PAP I из E. coli гомологичен эукариотическим поли(A)-

полимеразам.

Степень полиаденилирования бактериальных мРНК невысока, и у E. coli только небольшой

процент всех транскриптов полиаденилирован. Однако, несмотря на низкую степень

полиаденилирования, оно выполняет существенную функцию при деградации РНК. Добавление

поли(А) способствует деградации РНК, чьи концы защищены от действия экзонуклеаз вторичной

структурой. Такие экзорибонуклеазы, как ПНФаза и РНКаза I, нуждаются в одноцепочечном "хвосте",

за который можно "ухватить" 3' конец мРНК и начать ее деградацию. Полиаденилирование 3' конца как

раз и создает сайт связывания для экзорибонуклеаз.

Открытие дестабилизирующего влияния

3' поли(А)-хвостов на мРНК у бактерий явилось

сюрпризом, поскольку у эукариот функция полиаденилирования противоположная (стабилизирующая).

Такое отличие объясняется тем, что поли(А)-хвосты эукариот значительно длиннее и, кроме того,

защищены особым белком PAB

(poly(A)-binding). Короткие не связанные с белком поли(А)

последовательности и у эукариот оказывают дестабилизирующее действие на мРНК.

Литература:

1. M. Grunberg-Manago. Messenger rna stability and its role in control of gene expression in bacteria and

phages Annu. Rev. Genet. 1999. 33:193-227

- 88 -

содержание .. 4 5 6