Том 3. Справочник по кожным болезням - часть 444

При   применении   тест   -   системы   с   визуальным   учетом   результатов   также   рекомендуется

определение   титров   противотрепонемных   антител   в   резко   положительных   сывороточных   образцах
(4+).

Отрицательной   чертой   количественного   метода   исследования   с   целью   определения   титра

антител в сыворотке крови и ликворе является его неэкономичность. В связи с этим целесообразно
использовать другой критерий для характеристики концентрации антител - коэффициент позитивности
(КП),   равный   отношению   оптической   плотности,   полученной   для   каждого   образца,   к   критической
оптической   плотности:   КП   =   ОП/ОПкрит.   КП   у   положительных   образцов   выше   1,1,   сомнительных   -
находится   в  интервале   от  0,9  до  1,1  и  отрицательных   -  ниже  0,9.  Определение  КП  целесообразно
проводить  при выяснении динамики  выработки  антител   у пациента в процессе наблюдения за  ним
после лечения сифилиса, при этом обязательно нужно использовать ту же тест - систему, что и до
лечения больного. Эта методика не требует дополнительных финансовых затрат и дает представление
об эффективности лечения.

При использовании тест - системы иммуноферментной для качественного выявления антител к

возбудителю сифилиса в сыворотке крови человека ("АТ-Треп.-ИФТС", г. Ставрополь) возможен только
визуальный учет результатов реакции. При резко положительном (4+) результате субстратная смесь
имеет темно - коричневый цвет, при положительном (3+) - коричневый цвет, при слабоположительном
(2+) - светло - коричневый, при отрицательном (+,-) - светло - бежевый цвет или бесцветна.

Образцы, для которых получен сомнительный результат (соответствующая им ОП находится в

пределах "серой зоны" и КП в интервале от 0,9 до 1,1) подлежат повторному анализу. При повторном
сомнительном результате рекомендуется анализ с новой порцией крови, взятой через 3-7 дней.

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ ИФА ДЛЯ ЛИКВОРОДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

Для ликвородиагностики сифилиса могут быть использованы отечественные тест - системы ИФА,

предназначенные   для   выявления   иммуноглобулинов   класса   О   и   работающие   по   первой   схеме
проведения реакции. В настоящее время такими тест - системами являются:

1. Тест - система иммуноферментная для выявления антител к Treponema pallidum в сыворотке

или   плазме   крови   человека   "РекомбиБест   антипаллидум"   и   "РекомбиБест   антипаллидум   -   стрип"
производства   ЗАО   "Вектор   -   Бест"   (п.   Кольцово   Новосибирской   области);   2.   Тест   -   система
иммуноферментная   для   выявления   антител   к   возбудителю   сифилиса   "ИФА   -   АНТИ   -   LUIS"
производства   НПО   "Диагностические   системы"   (г.   Нижний   Новгород);   3.   Тест   -   система
иммуноферментная для выявления антител к возбудителю сифилиса (Treponema pallidum)Ha основе
рекомбинантных белков производства БТК "Биосервис" (г. Москва).

Ликвор в реакцию вводят цельным и неинактивированным. Мутный или с примесью крови ликвор

центрифугируют   и   отсасывают   надосадочную   жидкость.   Перед   исследованием   ликвор   можно
сохранять в морозильном  отделении холодильника при температуре от -12 град.С до -18 град. С в
пробирках под резиновыми пробками или в "эппендорфах" до 1 месяца. Размораживание производят
при комнатной температуре. Повторное замораживание и размораживание не допускается.

При   исследовании   ликвора   приготовление   рабочих   растворов,   проведение   ИФА   и   учет

результатов   осуществляют   в   соответствии   с   инструкцией   по   применению   тест   -   систем,   за
исключением пунктов, касающихся разведения ликвора и приготовления рабочих растворов конъюгата.
Так, исследование ликвора в отличие от исследования сыворотки или плазмы крови проводят в первой
фазе реакции при его разведении 1:2 (50 мкл ликвора и 50 мкл раствора для разведения) и во второй
фазе   реакции   с   рабочим   раствором   конъюгата,   концентрация   которого   увеличена   в   4   раза   по
сравнению с указанной в инструкции для сыворотки или плазмы крови.

Количественными   показателями   концентрации   противотрепонемных   антител   (степени

позитивности) в ликворе являются титр противотрепонемных антител или коэффициент позитивности.
Определение титров или коэффициентов позитивности целесообразно проводить как до лечения, так и
после   него   для   выяснения   динамики   выработки   антител   с   использованием   одной   и   той   же   тест   -
системы.

По своей диагностической эффективности при ликвородиагностике сифилиса ИФА близок к РИФ-

ц,   самой   чувствительной   и   специфичной   реакции   при   диагностике   нейросифилиса.   Положительной
чертой ИФА является его доступность благодаря наличию производственных высококачественных тест
- систем.

Источники   возникновения   ошибок   при   использовании   ИФА-тест   -   систем   делятся   на   вне-   и

внутрилабораторные. К первым относятся: нарушения техники взятия крови, условий транспортировки
и хранения тест - систем и проб. Ко вторым - некачественная работа лаборантов, любые отклонения от
инструкции по применению тест - системы, неисправность инструментов и приборов, неаккуратность
ведения документации.

9

Чтобы избежать ошибок при проведении ИФА, необходимо придерживаться следующих правил:
- не использовать для исследования хилезные, резко гемолизированные и проросшие сыворотки

крови, добиваясь стандартных условий взятия и хранения образцов;

-   не   практиковать   2-кратного   и   более   замораживания   -   размораживания   образцов   сыворотки

крови;

- не пользоваться просроченными наборами тест - систем;
- соблюдать стандартные требования к чистоте лабораторной посуды; использовать отдельные

посуду   и   наконечники   для   автоматических   пипеток   (при   их   многократном   использовании)   для
разведения конъюгатов и субстрата пероксидазной реакции (ОФД);

- проводить периодический контроль качества работы лаборантов;
- следить за строгим соблюдением инструкций по применению тест - систем;
- пользоваться  автоматическими пипетками с погрешностью  измерения  объемов не более 5%,

ежемесячно проводя метрологический контроль их работы;

-   соблюдать   правила   эксплуатации   оборудования   (спектрофотометры,   автоматические

промыватели планшет, рН-метры);

-  спектрофотометры   для   ИФА   должны   не  реже   одного   раза   в   год   проходить   метрологический

контроль, периодическому контролю подлежат также автоматические пипетки, термостаты, рН-метры;

- в ходе каждой постановки ИФА заполнять протокол исследования.
Главным достоинством ИФА является наличие отечественного выпуска тест - систем, их высокое

качество,   возможность   автоматизации   постановки   и   учета   его   результатов,   что   крайне   важно   при
исследовании большого  числа сывороток  крови,  в частности  от доноров.  При использовании тест -
систем   ИФА   для   лабораторий   с   небольшим   объемом   работы   следует   закупать   тест   -   системы   с
разборными планшетами (стрипы).

ИФА диагностика сифилиса - эффективный  метод.  Необходимым  является  его более широкое

использование в качестве скринингового и диагностического теста на сифилис, но обязательным при
этом должно быть высокое качество выпускаемых предприятием тест - систем. Недопустима продажа и
использование   в   медицинской   практике   тест   -   систем,   не   имеющих   утвержденной   фармакопейной
статьи и разрешения Минздрава РФ на их применение в практике здравоохранения. Все утвержденные
и рекомендованные в практику ИФА тест - системы прошли государственные испытания в ГИСК им.
Л.А.   Тарасевича   и   в   ЦНИКВИ.   В   процессе   их   промышленного   выпуска   должен   осуществляться
систематический   контроль   качества.   К   применению   в   медицинской   практике   разрешаются   тест   -
системы, чувствительность и специфичность которых не ниже 95%.

ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ИФА

Дата анализа: ________________________________________________
Исполнитель: _________________________________________________
Тест - система: ______________________________________________
Серия: ______ Контрольный N __________ Срок годности: ________

СХЕМА АНАЛИЗА:

Љ””””’”””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’”””””’””””’””””Ї
Ј    Ј 1 Ј  2 Ј  3 Ј  4 Ј  5 Ј  6 Ј  7 Ј  8 Ј  9 Ј  10 Ј 11 Ј 12 Ј
“””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤
Ј   АЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј
“””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤
Ј   ВЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј
“””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤
Ј   СЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј
“””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤
Ј   DЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј
“””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤
Ј   ЕЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј
“””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤
Ј   FЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј
“””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤
Ј   GЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј
“””””•”””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•””””•”””””•””””•””””¤
Ј   HЈ   Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј     Ј    Ј    Ј

10

ђ””””‘”””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘”””””‘””””‘””””‰

РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА:

РЕАКЦИЯ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ

СИФИЛИСА

Принцип   метода   заключается   в   том,   что   при   соединении   сыворотки   крови,   содержащей

специфические   антитела,   с   эритроцитами,   сенсибилизированными   соответствующим   антигеном,
наблюдается их характерная агглютинация. Постановка реакции может осуществляться в пробирках
или планшетах.

Сенсибилизация эритроцитов при изготовлении тест - системы для диагностики сифилиса может

производиться патогенными или культуральными бледными трепонемами.

Помимо наших производителей, ряд зарубежных фирм поставляет свою продукцию в Россию.
1. Гемагглютинационный тест для качественного и количественного определения антител против

Treponema   pallidum   ("Syphilis   TPHA   -   test"),   фирма   "Human",   странапроизводитель   -   Германия,
распространитель - фирмы: "Биохиммак", "Лабораторная диагностика", г. Москва.

2. Гемагглютинационный тест для качественного и количественного определения антител против

Treponema   pallidum   ("TPHA   -   nosticon"),   фирма   "Organon",   странапроизводитель   -   Голландия,
распространитель - фирма "Organon - technics", г. Москва.

3. Гемагглютинационный тест для качественного и количественного определения антител против

Treponema pallidum ("Syphilia TPHA 200"), фирма "Sanofi diagnostic Pasteur", страна - производитель -
Франция, распространитель - фирма "Sanofi diagnostic Pasteur", г. Москва.

4. Гемагглютинационный тест для качественного и количественного определения антител против

Treponema   pallidum   ("Syphilis   TPHA"),   фирма   "Randox",   страна   -   производитель   -   Великобритания,
распространитель - фирма ЗАО "Protea", г. Москва.

5.   Диагностикум   для   выявления   антител   к   Treponema   pallidum   в   реакции   пассивной

гемагглютинации ("Люис РПГА тест"), фирма "Ни-армедик Плюс", г. Москва.

В ЦНИКВИ на большом материале с отечественным диагностикумом изучена результативность

РПГА   по  сравнению   с   другими   тестами   на  сифилис   при   исследовании   сывороток   крови   больных   с
различными формами сифилиса до лечения. В РПГА получено 99,4% положительных результатов, в
РИФ-абс - 99,1%, РИФ-200 - 99,1%, РИТ - 87,7%, МР - 95,8%, в РСК с трепонемным антигеном - 95,8%,
РСК  с  кардиолипиновым  антигеном  -  90,2%.   В  зарубежной  литературе   имеются  указания   на  более
позднюю   выработку   гемагглютининов   у   больных   в   ранний   период   заболевания,   хотя   в   ЦНИКВИ
выявлен   высокий   процент   положительных   результатов   при   сифилисе   первичном,   серопозитивном   -
97,7%.

Общее мнение исследователей заключается в том, что РПГА является ценным диагностическим

тестом при всех формах сифилиса, но особенно чувствительна она при поздних формах заболевания.

Существует   микро-   и   макромодификации   постановки   РПГА,   чаще   используется   первая   из-за

экономичности,   быстроты   постановки   и   учета   результатов.   Кроме   того,   есть   качественный   и
количественный варианты постановки. Последний позволяет определять титры антител в крови. Но
при   этом,   необходимо   учесть,   что   при   повторных   исследованиях   крови   в   РПГА   необходимо
использовать одну и ту же тест - систему"

Результаты   РПГА   учитывают   через   1,5-2   ч   при   микрометоде   или   на   следующий   день   при

макрометоде.   Неподвижно   стоящие   пластины   даже   при   высыхании   их   содержимого   сохраняют
полученную картину:

"4+" - положительная РПГА. Эритроциты равномерно выстилают всю поверхность лунки (в виде

зонтика).   "3+"   -   положительная   РПГА.   Эритроциты   выстилают   всю   поверхность   лунки,   но   часть   их
соскальзывает к центру.

"2+" - слабоположительная  РПГА. Эритроциты образуют пленку на небольшом участке нижней

части лунки.

"1+" - отрицательный результат РПГА. На дне лунки эритроциты образуют рыхлый осадок.
"-" - отрицательная РПГА. Эритроциты ровным плотным "колечком" или "пуговкой" лежат на самом

дне лунки (без окружающего зернистого осаждения).

Испытание   сыворотки   крови   людей   в   первых   двух   разведениях   позволяет   при   качественной

постановке реакции быстро выявлять лиц, сыворотки крови которых содержат специфические антитела
к антигенам  бледной трепонемы. Испытание сыворотки  крови  количественным  методом  с помощью
двукратных разведений дает дополнительную информацию о концентрации специфических антител в
крови.

11

Материально - техническое обеспечение метода

Для постановки РПГА в лаборатории  должно быть следующее оборудование:  полистироловые

пластины, микротитраторы типа "Такаччи", холодильник, центрифуга, термостат (+37 град.С), пипетки
дозаторы и градуированные пипетки, лабораторная посуда и рН-метр.

При проведении серологических исследований на сифилис, в частности ИФА и РПГА, могут иметь

место как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты реакций.

Ложноположительные   результаты   могут   быть   получены   при   исследовании   сывороток   крови

пациентов   с   невенерическими   трепонематозами,   за   счет   ревматоидного   фактора   и   перекрестно
реагирующих   с   трепонемным   антигеном   антител,   образующихся   при   различных   системных   или
индуцированных   лекарствами   и   наркотиками   нарушениях   обмена,   из-за   аномального   уровня
иммуноглобулинов; у новорожденных детей - за счет образования в организме плода или ребенка IgM-
антител   к   IgG   матери,   что   осложняет   трактовку   результатов   и   диагностику   врожденного   сифилиса.
Ложноотрицательные   результаты   реакции   могут   быть   обусловлены   конкуренцией   между   IgMи   IgG-
антителами.

К   наиболее   типичным   техническим   ошибкам   при   постановке   РПГА,   приводящим   к   получению

недостоверных   результатов,   следует   отнести   неточное   разведение   ингредиентов,   нарушение
температурного   режима,   времени   инкубации   реагентов,   сроков   нанесения   их   на   планшет,
несоответствие рН растворов требуемым, загрязнение лабораторной посуды.

Образцы,   давшие   сомнительный   результат   в   РПГА   из-за   содержания   неспецифических

агглютининов, можно подвергнуть обработке с целью адсорбции этих агглютининов. Для этого 20 мкл
сыворотки   при   постановке   микромодификации   тщательно   смешивают   с   0,5   мл   контрольных
эритроцитов,  инкубируют  30  минут  и  центрифугируют   5  минут.  Надосадочную   жидкость  подвергают
повторному исследованию.

Для   постановки   РПГА,   как   и   других   серологических   тестов,   должны   быть   выделены   врачи,

лаборанты, медицинские сестры, прошедшие специальную подготовку по соответствующему вопросу.
Подготовка   врачей   -   серологов   и   повышение   их   квалификации   должны   осуществляться   в   кожно   -
венерологических   учреждениях,   а   также   на   кафедрах   микробиологии   и   лабораторной   клинической
диагностики в структурах последипломного образования врачей.

При   постановках   ИФА   и   РПГА   должны   соблюдаться   общепринятые   мероприятия   по   технике

безопасности.   Антиген   для   этих   реакций   непатогенен   (консервация).   Контрольные   сыворотки,
входящие в  состав  наборов,   инактивированы   и  также  содержат  консервант.  Его  содержат  и другие
компоненты   наборов,   в   связи   с   чем   необходимо   избегать   их   контакта   с   кожей   и   слизистыми
оболочками.   Испытуемые   сыворотки   крови   при   постановке   всех   серологических   тестов   следует
рассматривать как потенциально опасные для здоровья человека (гепатит, ВИЧ-инфекция и др.). При
работе   с   сыворотками   крови   необходимо   использовать   резиновые   перчатки,   не   пипетировать
сыворотку ртом, все промывные растворы обрабатывать 5-6% раствором хлорамина или 6% раствором
перекиси водорода в течение 3-х часов при температуре 18-25град.С; все твердые отходы сбрасывать
в   спецконтейнер   с   пломбируемой   крышкой   и   затем   подвергать   автоклавированию,   инструменты   и
оборудование до и после работы протирать 70% этиловым спиртом. Анализ исследуемых образцов
следует   проводить   на   рабочем   месте,   оборудованном   в   соответствии   с   требованиями,
предусмотренными для работы с инфекционным материалом.

Подробности постановки ИФА и РПГА описаны в соответствующих Пособиях (М., 1998,1999).

РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ

СЕРО- И ЛИКВОРОДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

Принцип   метода   заключается   в   соединении   специфического   комплекса   антиген   -   антитело   с

иммунной   антивидовой   сывороткой,   меченной   флюорохромом,   и   выявление   его   помощью
люминесцентного микроскопа.

Материально - техническое обеспечение метода:

люминисцентный микроскоп с ртутно - кварцевой лампой ДРШ-250, термостат, инактиватор.

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РИФ - АБС

Ингредиенты:
1. Испытуемая сыворотка крови. Кровь для получения сыворотки крови берут из локтевой вены в

чистую   и   сухую   пробирку   в   объеме   5   мл   и   обрабатывают   так   же,   как   для   постановки   реакции

12

Вассермана. Инактивируют сыворотки крови однократно при температуре 56 град. в течение 30 минут.
В связи с тем, что  РИФ-абс ставится  нестерильно,  использование   стерильной  посуды, соблюдение
условий стерильности при хранении сывороток крови не обязательно. Оно имеет значение только для
более длительного сохранения сывороток крови до исследования.

2.   Антиген.   В   качестве   антигена   используют   взвесь   патогенных   бледных   трепонем   штамма

Никольса из 7-суточного орхита кролика. Здоровых кроликов - самцов с отрицательными результатами
реакции Вассермана и РИТ заражают интратестикулярно и при возникновении орхита извлекают из
яичек   бледные   трепонемы   так   же,   как   в   случае   получения   антигена   для   РИТ.   Полученную   взвесь
бледных трепонем сливают с кусочков яичка в стерильные пробирки с ватными пробками и оставляют
в холодильнике при 4 град. на сутки, после чего отделяют от осадка и при тех же условиях сохраняют
весь период использования.

Получение и хранение антигена требует соблюдения условий стерильности, т. к. с одним и тем же

антигеном реакция может ставиться в течение 2-4 месяцев. Для антигена следует выбирать ту взвесь,
в   которой   не   наблюдается   агглютинация   трепонем   и   имеется   достаточное   их   количество.   Антиген
может   быть   получен  в  ампулах  из   других   лабораторий.   Перед   каждой   постановкой   реакции   взвесь
хорошо   перемешивают   и   исследуют   в   микроскопе   с   конденсором   темного   поля   зрения   для
определения   ее   густоты.   Для   постановки   РИФ-абс   необходимо   иметь   взвесь,   содержащую   40-60
трепонем в темном поле зрения, при наличии более густой взвеси ее необходимо развести.

3.   Сорбент.   В   качестве   сорбента   для   РИФ-абс   может   быть   использован   ультраозвученный

трепонемный   антиген   для   РСК.   Он   представляет   собой   разрушенную   ультразвуком   взвесь   смеси
культуральных бледных трепонем штаммов V, VII, VIII, IX и Рейтера.

Каждая серия сорбента перед использованием в РИФ- абс с диагностической целью должна быть

оттитрована.

Титрование сорбентов. Сорбенты титруют на 10 сыворотках крови больных сифилисом, дающих в

РИФ-5 с буфером резко (4+) и слабо (2+) положительный результат, а также на 20 сыворотках крови
лиц,   свободных   от   сифилитической   инфекции,   дающих   в   РИФ-5  отрицательный   результат,   а   также
неспецифическую   позитивность   (2+   и   более).   При   этом   для   РИФ-5   с   буфером   люминесцирующая
сыворотка должна быть оттитрована также, как для РИФ-абс с ее разведением от 1:100 до 1:140.

Пример определения титра сорбента. Цельный сорбент, разводят фосфатным буфером, РН=7,2 в

2, 3, 4 раза и более. Берут 3 сыворотки крови от больных сифилисом, одна из которых дает в РИФ-5
резкоположительный (4+) результат, две - слабоположительный (2+), и 5 сывороток крови от людей,
свободных от сифилитической инфекции, 3 из которых дают неспецифические результаты в РИФ-5 (2+
и более). Все сыворотки крови разводят в 5 раз сорбентом, разведенным в свою очередь в 2, 3, 4 и
более   раз   фосфатным   буфером.   Затем   сыворотки   крови   исследуют   в   реакции.   После   учета
результатов выбирают разведение сорбента, при котором сорбированные сыворотки крови больных
сифилисом   сохраняют   степень   позитивности,   аналогичную   полученной   с   сыворотками   крови,
разведенными фосфатным буфером, а сыворотки крови лиц, свободных от сифилитической инфекции,
не дают свечения. Это разведение сорбента является его титром.

Титром   сорбента   в  данном   случае   явилось   разведение   1:3,   при  котором   все   сыворотки   крови

больных   сифилисом   сохраняли   степень   позитивности,   полученную   в   контроле,   и   в   то   же   время
надежно снималась неспецифическая позитивность несифилитических сывороток крови.

Окончательный   титр   устанавливают   в   результате   исследования   30   сывороток   крови   больных

сифилисом и контрольных лиц.

Таблица N 13

РЕЗУЛЬТАТЫ ТИТРОВАНИЯ СОРБЕНТА

Љ”””””””””””””””””””””’””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””Ї
ЈИспытуемые сыворотки Ј            Результаты РИФ-5              Ј
Ј       крови         “”””””””””””’””””””””””””””””””””””””””””””¤
Ј                     ЈРазведение ЈРазведение сывороток крови 1:5Ј
Ј                     Јсывороток  Ј    сорбентом в разведении    Ј
Ј                     Јкрови 1:5  “”””””””””’”””””””””’””””””””””¤
Ј                     Јбуфером (К)Ј   1:2   Ј   1:3   Ј  1:4     Ј
“”””””””””””””””””””””•”””””””””””•”””””””””•”””””””””•””””””””””¤
ЈСыворотки крови боль-Ј           Ј         Ј         Ј          Ј
Јного сифилисом       Ј           Ј         Ј         Ј          Ј
Ј       N 1           Ј   4+      Ј    3+   Ј    4+   Ј  4+      Ј
Ј       N 2           Ј   2+      Ј    1+   Ј    2+   Ј  2+      Ј

13

Ј       N 3           Ј   2+      Ј    -    Ј    2+   Ј  2+      Ј
“”””””””””””””””””””””•”””””””””””•”””””””””•”””””””””•””””””””””¤
ЈНесифилитическая сы- Ј           Ј         Ј         Ј          Ј
Јворотка крови        Ј           Ј         Ј         Ј          Ј
Ј       N 1           Ј   3+      Ј    -    Ј    1+   Ј  2+      Ј
Ј       N 2           Ј   2/3+    Ј    -    Ј    -    Ј  2+      Ј
Ј       N 3           Ј   2+      Ј    -    Ј    -    Ј  2+      Ј
Ј       N 4           Ј   2+      Ј    -    Ј    -    Ј  2+      Ј
Ј       N 5           Ј   -       Ј    -    Ј    -    Ј  -       Ј
ђ”””””””””””””””””””””‘”””””””””””‘”””””””””‘”””””””””‘””””””””””‰

4. Антивидовая люминесцирующая сыворотка. Для исследования в РИФ - абс сывороток крови

людей   необходима   меченная   флюорохромом   сыворотка   крови   животных,   иммунизированных
сывороточным  белком человека.  Лиофильно высушенную люминесцирующую сыворотку растворяют
при соблюдении условий стерильности в дистиллированной воде в том  объеме, который  указан на
этикетке ампул, переливают в стерильную пробирку с резиновой пробкой и в процессе использования
хранят при 4 град. в течение 1-2 месяцев.

В   день   постановки   реакции   нужное   количество   этой   сыворотки   разводят   по   титру

дистиллированной   водой.   Указанное   на   этикетке   рабочее   разведение   сыворотки   не   годится   для
постановки   реакции   с   целью   серодиагностики   сифилиса,   поэтому   титр   каждой   серии   необходимо
определять заново.

Титрование   антивидовой   люминесцирующей   сыворотки.   Берут   5   сывороток   крови   больных

сифилисом и 5 сывороток крови здоровых людей, разводят их в 5 раз сорбентом (с учетом его титра) и
ставят   реакцию   с   использованием   во   II   фазе   различных   разведений   люминесцирующей   сыворотки
против сывороточных глобулинов человека той серии, титр которой определяется. Следует учесть, что
титр   люминесцирующих   сывороток,   выпускаемых   в   настоящее   время   ИЭМ   им.   Н.   Ф.   Гамалеи,
колеблется при постановке РИФ - абс от 1:100 до 1:140. При учете реакции предварительным титром
люминесцирующей   сыворотки   следует   считать   то   разведение,   при   использовании   которого   с
положительными   сыворотками   крови   получено   хорошее   свечение   трепонем,   а   с   отрицательными
свечение   антигена   не   получено.   Большее   разведение   люминесцирующей   сыворотки,   чем   титр,
приводит   к   понижению   чувствительности   реакции,   а   меньшее   -   к   снижению   специфичности.   После
определения   предварительного   титра   следует   его   уточнить   на   большем   числе   положительных   и
отрицательных сывороток крови. Окончательным титром можно считать тот, который проверен на 100
сыворотках крови, причем из них не менее 20 должно быть от больных сифилисом.

Для   предотвращения   пророста   после   разведения   сухой   люминесцирующей   сыворотки

дистиллированной водой к ней необходимо добавить мертиолат из расчета 1 объема его раствора
1:1000 к 9 объемам люминесцирующей сыворотки. При взятии новых ампул той же серии титр следует
только проверить и уточнить на 10 заведомо положительных и отрицательных сыворотках крови.

Пример   определения   предварительного   титра   люминесцирующей   антивидовой   сыворотки.

Готовят 60 препаратов, нумеруют их от 1 до 60. Берут 10 сывороток крови - 5 от больных сифилисом, 5
от здоровых людей. Все сыворотки крови разводят в 5 раз разведенным по титру сорбентом.

На пронумерованные 1-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60 препараты наносят в I фазе реакции

одни   и   те   же   10   сывороток   крови,   разведенных   в   5   раз   сорбентом.   Во   II   фазе   реакции   на   1-10
препараты   наносят   люминесцирующую   сыворотку,   разведенную   1:100,   на   11-20   -   1:110,   на   21-30   -
1:120, на 31-40- 1:130, на 41-50 - 1:140, на 51-60 - 1:150.

Оптимальным следует считать разведение, при котором свечение антигена будет хорошим при

постановке реакции с положительными сыворотками крови и не будет наблюдаться с отрицательными.

ТЕХНИКА ПОСТАНОВКИ РИФ - АБС

Из   антигена   готовят   препараты   на   тонких,   хорошо   обезжиренных   предметных   стеклах,   на

обратной   стороне   которых   стеклорезом   обозначены   кружки   диаметром   0,7   см   (по   10   кружков   на   1
предметном   стекле).   В   пределах   кружка,   на   стекло   наносят   антиген   -   взвесь   бледных   трепонем.
Запаянным   концом   пастеровской   пипетки   круговыми   движениями   взвесь   распределяют   в   пределах
кружка, высушивают на воздухе и фиксируют 10 минут в химически чистом ацетоне. Затем препараты
нумеруют. Инактивированные испытуемые сыворотки крови разводят в 5 раз сорбентом, разведенным
по   титру   буферным   раствором.   В   штатив   помешают   ряд   пробирок,   число   и   номер   которых
соответствует   числу   и   номеру   испытуемых   сывороток   крови.   В   пробирки   пипеткой   разливают
разведенный по титру сорбент по 0,2 мл, затем добавляют по 0,05 мл цельной испытуемой сыворотки
крови   и   хорошо   перемешивают.   Разведение   сыворотки   крови   можно   осуществлять   аппаратом

14

Флоринского.   Разведенные   сорбентом   сыворотки   крови   наносят   на   антиген   так,   чтобы   равномерно
покрыть мазок, и препараты помещают во влажную камеру, которую закрывают крышкой и помещают
на   30   минут   в   термостат   при   37град.   (I   фаза   реакции).   После   первой   фазы   препараты   осторожно
промывают в 2 порциях фосфатного буфера, причем во вторую порцию препараты помещают на 10
минут, высушивают, после чего их вновь помещают во влажную камеру, наносят разведенную по титру
люминесцирующую сыворотку и оставляют при комнатной температуре на 30 минут (II фаза реакции).
По   окончании   второй   фазы   препараты   промывают   фосфатным   буфером,   как   описано   выше,
высушивают и наносят на поверхность мазков по капле нелюминесцирующего иммерсионного масла
(диметилфталата).

Исследование   препаратов   производят   в   люминесцентном   микроскопе   с   ртутно   -   кварцевой

лампой ДРШ-250 с иммерсионной системой, окуляром 4х или 5х, фильтрами СЗС-7 или 14, ФС-1, БС-8
и   ЖС-18   или   Т-2Н.   Учет   реакции   осуществляется   путем   оценки   свечения   бледных   трепонем.
Положительными   в   РИФ-абс   считают   сыворотки   крови,   которые   дают   свечение   на   4+,   3+   и   2+.
Блестящее   зелено   -   желтое   свечение   оценивается   на   4+,   яркое   -   3+,   слабое   свечение   -   2+.
Отрицательными   считают   сыворотки   крови,   которые   дают   свечение   на  1+   (трепонемы   в   препарате
окрашены интенсивнее фона) или не дают его.

В каждой постановке РИФ-абс необходимо использовать следующие контроля:
Резкоположительный контроль. Сыворотка крови больного сифилисом, дающая свечение на 4+

при разведении буфером в 5 раз. При разведении в 5 раз сорбентом сыворотка крови не должна терять
степень позитивности более чем на 1+.

Слабоположительный контроль. Цельная или разведенная сыворотка крови больного сифилисом,

дающая слабую степень свечения антигена на 2+ при разведении буфером в 5 раз. При разведении
сорбентом позитивность ее должна сохраняться.

Неспецифический   контроль.   Несифилитическая   сыворотка   крови,   дающая   при   разведении

буфером   флюоресценцию   не   менее   2+.   При   разведении   сорбентом   позитивность   ее   должна   быть
ликвидирована.

Контроли   антигена,   сорбента,   люминесцирующей   сыворотки   могут   ставиться   только   при

использовании новых серий этих ингредиентов.

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РИФ-АБС С КАПИЛЛЯРНОЙ КРОВЬЮ

Постановка РИФ-абс возможна не только с сывороткой крови, но и с кровью, взятой из пальца.

Эту модификацию РИФ-абс можно использовать при обследовании на сифилис детей, при трудности
получения крови из вены у взрослых, при массовом обследовании различных контингентов на сифилис.

При постановке РИФ-абс с кровью применяют те же ингредиенты реакции, что и при постановке

РИФ-абс   с   сывороткой   крови   (антиген,   сорбент,   люминесцирующая   сыворотка).   Титр
люминесцирующей сыворотки определяют по вышеизложенной схеме, но при постановке реакции с
кровью. Кровь для исследования после прокола пальца пациента набирают микропипеткой до метки
0,1   мл,   быстро   выдувают   в   пробирку,   содержащую   0,3   мл   дистиллированной   воды,   тщательно
перемешивают пипеткой и фильтруют через бумажный фильтр, смоченный дистиллированной водой.
Постановка реакции с разведенной кровью возможна как в день взятия ее, так и через 1-2 дня при
условии хранения при 4 град.

Непосредственно перед постановкой реакции ко всем образцам крови, включенным в постановку

реакции,   добавляют   по   0,1   мл   цельного   сорбента,   перемешивают   пипеткой   и   встряхиванием,
помещают на 30 минут в термостат при 37 град. Затем кровь, обработанную сорбентом, наносят на
мазки антигена и помещают ее во влажную камеру при 37 град. (I фаза реакции). По истечении срока
экспозиции   препараты   промывают   в   первой   порции   фосфатного   буфера   так,   чтобы   на   стеклах   не
осталось следов крови, и помешают их на 10 минут во вторую порцию буфера. После высушивания
мазков   проводят   II   фазу   реакции.   При   этом   на   препараты   наносят   разведенную   по   титру,
установленному   для   данной   модификации   РИФ,   люминесцирующую   сыворотку   против   глобулинов
человека. Стекла во влажной камере вновь помещают в термостат при 37 град.

Через 30 минут препараты вновь промывают в 2 порциях фосфатного буфера в течение 10 минут,

высушивают   и   монтируют   для   люминесцентной   микроскопии.   Исследование   препаратов   и   учет
результатов реакции проводят так же, как при постановке РИФ-абс с сывороткой крови.

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РИФ-200

Методика   постановки   РИФ-абс   и   РИФ-200   близки.   При   постановке   РИФ-200   обработка

испытуемых   сывороток   крови,   приготовление   антигена,   подготовка   антивидовой   люминесцирующей
сыворотки и ее титрование производят так же, как при постановке РИФ-абс. Следует учесть только, что

15

титры люминесцирующей сыворотки, выпускаемой в настоящее время, в РИФ-200 колеблются от 1:20
до 1:50.

Техника   постановки   РИФ-200.   Испытуемые   сыворотки   крови   разводят   в   200   раз   фосфатным

буфером. Для этого в штатив помещают 3 ряда пробирок, число и нумерация которых в каждом ряду
соответствует числу и нумерации испытуемых сывороток крови в рабочем журнале. В первом ряду
налиты   цельные   испытуемые   сыворотки   крови,   во   втором   ряду   в   пробирки   наливают   по   0,45   мл
буфера, в третьем - по 0,95 мл буфера. Во втором ряду готовят разведение сывороток крови в 10 раз,
для чего из каждой пробирки первого ряда отдельной 1 мл градуированной пипеткой берут 0,05 мл
испытуемой сыворотки крови, переносят в соответствующую пробирку второго ряда и смешивают с
имеющимся там буфером. Из каждой пробирки второго ряда той же самой пипеткой переносят по 0,05
мл разведенной уже в 10 раз испытуемой сыворотки крови в соответствующую пробирку третьего ряда
и получают разведение в 200 раз.

При постановке реакции на помещенные во влажную камеру препараты наносят разведенные в

200   раз   испытуемые   сыворотки   крови   так,   чтобы   их   номера,   обозначенные   на   пробирках,
соответствовали номерам на предметных стеклах. После нанесения на препараты сыворотки крови
влажную камеру помещают на 30 минут в термостат с температурой 37 град. (I фаза реакции). Затем
препараты промывают 10 минут в 2 порциях буфера и высушивают. После этого их вновь помещают во
влажную   камеру   и   на   все   наносят   разведенную   по   титру   люминесцирующую   сыворотку   (II   фаза
реакции). Вторую фазу проводят 30 минут при комнатной температуре, после чего препараты 10 минут
промывают, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии.

Учет результатов РИФ-200 производят так же, как РИФ-абс.
В том случае, когда клиницистов интересует титр флюоресцирующих антител в сыворотке крови

больного,   РИФ-абс   и   РИФ-200   следует   ставить   с   последовательным   разведением   испытуемых
сывороток крови и титром флюоресцирующих антител считать то наибольшее разведение сыворотки
крови.   которое   еще   дает   положительный   результат   реакции.   Обозначать   титр   принято   числом,
характеризующим степень разведения испытуемой сыворотки крови, например, 5,10,20,40 и т. д. (РИФ-
абс) или 200,400, 800 и т. д. (РИФ-200).

При постановке обеих модификаций реакции для разведения испытуемых сывороток крови и для

промывания препаратов после I и II фаз следует использовать фосфатный буфер следующего состава:
1 л дистиллированной воды 6,8 г натрия хлорида, 1,48 г двузамещенного фосфорнокислого натрия,
0,43   г   однозамещенного   фосфорнокислого   калия   (рН=7,2).   Приготовленный   раствор   хранят   при
комнатной температуре не более недели.

В связи с возможностью получения отрицательных результатов при наличии флюоресцирующих

антител не следует исследовать кровь и сыворотку крови в РИФ-абс и РИФ-200 во время лечения
больных пенициллином.

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РИФ-Ц

Ранняя диагностика поражений нервной системы при сифилисе является актуальным вопросом в

деле борьбы с этим заболеванием. В связи с тем, что РИФ-ц обладает большей чувствительностью,
чем все другие используемые для ликвородиагностики сифилиса тесты, эта модификация РИФ может
быть рекомендована для диагностики сифилитических поражений центральной нервной системы при
всех формах сифилиса.

Для   постановки   РИФ-ц   используют   тот   же   антиген,   люминесцирующую   сыворотку,   что   и   для

постановки   РИФ-абс   и   РИФ-200   с   сывороткой   крови.   Аналогичны   также   определение
флюоресцирующих антител в ликворе и сыворотке крови и учет реакции.

Спинномозговая   жидкость   вводится   в   реакцию   неинактивированной   и   цельной.   До   постановки

реакции ее можно сохранять в морозильном отделении холодильника в пробирках под резиновыми
пробками до 2 недель. Оттаиванние производят при комнатной температуре.

Техника   постановки   РИФ-ц.   В   I   фазе   реакции   на   антиген   наносят   0,05   мл   неразведенной

испытуемой   спинномозговой   жидкости,   препараты   помещают   во   влажную   камеру   на   30   минут   при
комнатой температуре. Затем их промывают - фосфатным буфером, рН = 7.2, в течение 10 минут,
высушивают. Во II фазе на препараты наносят разведенную по титру люминесцирующую сыворотку,
которую титруют при постановке реакции со спинномозговой жидкостью. Выдерживают препараты при
комнатной   температуре   30   минут   во   влажной   камере,   промывают,   высушивают,   монтируют   для
люминесцентной микроскопии.

Источники ошибок:
- несоблюдение условий приготовления, хранения реагентов и постановки реакции;
- низкое качество люминесцирующей сыворотки и неточное определение ее титра;

16