содержание .. 441 442 443 444 ..

Том 3. Справочник по кожным болезням - часть 443

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПРИКАЗ

26 марта 2001 г.

N 87

О СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА

Эпидемиологическая ситуация с заболеваемостью сифилисом остается крайне напряженной. С

начала 90-х годов она возросла почти в 40 раз и в 1999 г. достигла 186,7 случаев на 100 тыс.
населения.

Серьезность ситуации усугубляется тем, что сифилис, как и другие инфекции, передаваемые

половым путем, способствует распространению ВИЧ - инфекции.

Одним из основных мероприятий, направленных на предупреждение дальнейшего

распространения заболеваемости сифилисом, является его ранняя диагностика.

Однако материально - техническая база серологических лабораторий не соответствует

потребностям учреждений здравоохранения. За последние десять лет число кожно - венерологических
диспансеров, не имеющих в своем составе серологических лабораторий, возросло с 25,3% в 1989 г. до
31,2% в 1999 г.

С целью совершенствования лабораторной диагностики сифилиса, повышения качества работы и

обеспечения единства подхода по ее организации:

ПРИКАЗЫВАЮ:
1. Утвердить:
1.1. Методические указания "Постановка отборочных и диагностических тестов на сифилис"

(приложение N 1).

1.2. Методические указания "Расчетные нормы времени проведения лабораторных исследований

при диагностике сифилиса методом реакции пассивной гемагглютинации" (приложение N 2)

2. Директору Центрального научно - исследовательского кожно - венерологического института

Минздрава России А.А.Кубановой, директору Уральского научно - исследовательского института
дермато - венерологии и иммунопатологии Минздрава России Н.В.Кунгурову, директору
Нижегородского научно - исследовательского кожно - венерологического института Минздрава России
Н.К.Никулину:

2.1. Обеспечить организационно - методическое руководство по внедрению диагностических

тестов в субъектах Российской Федерации в соответствии с приложениями N 1 и N 2.

2.2. До 01.06.2001 подготовить и представить в установленном порядке необходимые материалы

на аккредитацию серологических лабораторий научно - исследовательских институтов в качестве
экспертных в здравоохранении.

2.3. Обеспечить проведение внешнего контроля качества лабораторной диагностики сифилиса.
3. Руководителям органов управления здравоохранением субъектов Российской Федерации:
3.1. Организовать работу по серологической диагностике сифилиса в соответствии с

приложениями N 1, N 2.

3.2. Принять неотложные меры по развитию и укреплению материально - технической базы

серологических лабораторий, обратив особое внимание на организацию таких лабораторий в составе
кожно - венерологических диспансеров.

4. Считать не действующим на территории Российской Федерации приказ Министерства

здравоохранения СССР от 2 сентября 1985 г. N 1161 "О совершенствовании серологической
диагностики сифилиса".

5. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на Первого заместителя Министра

А.И.Вялкова.

Министр

Ю.Л.ШЕВЧЕНКО

Приложение N 1

Утверждено прказом

Минздрава России

от 26.03.2001 г. N 87

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПОСТАНОВКА ОТБОРОЧНЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ

ТЕСТОВ НА СИФИЛИС

Аннотация

Методические указания предназначены для лабораторных работников и клиницистов

дерматовенерологической   службы   России.   Указания   посвящены   современным   методам   серо-   и
ликвородиагностики   сифилиса,   широко   апробированным   в   научно   -   исследовательских   и  лечебно   -
профилактических  учреждениях  страны.  Представлены   новые высоко  чувствительные   специфичные
методики постановки  реакций на сифилис.  Освещено предназначение различных  тестов в качестве
отборочных, диагностических и контрольных для оценки эффективности лечения. Описаны принципы
реакций,   методики   их   постановки,   материально   -   техническое   обеспечение,   источники   получения
ошибочных   результатов   и   мероприятия   по   технике   безопасности   при   работе   с   инфекционным
материалом.

Организация - разработчик: ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ.
Авторы: докт. биол. наук, проф. Г.А.Дмитриев, докт. мед. наук, проф. В.Н.Беднова, докт. мед. наук

Г.Ф.Тимченко, канд. мед. наук Г.А.Киселева, канд. мед. наук Т.И.Милонова, канд. мед. наук
О.А.Стоянова, З.П.Акопова.

Введение

Для серо- и ликвородиагностики сифилиса в России могут применяться следующие методы:
1. Микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном (МР), которая является

отборочным   тестом   при   обследовании   населения   на   сифилис.   Постановка   МР   осуществляется   с
плазмой   или   инактивированной   сывороткой   крови.   Зарубежные   тесты   ВДРЛ   (VDRL),   РПР   (RPR)   и
другие   аналогичны   МР   как   по   принципу   постановки   реакции,   так   и   по   чувствительности   и
специфичности.

2. Иммуноферментный анализ (ИФА). Антиген из культуральных или патогенных бледных

трепонем.

3. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Антиген из культуральных или патогенных

бледных трепонем.

4. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) в следующих модификациях: РИФ-абс, РИФ-ц, РИФ с

капиллярной кровью из пальца. Антиген - патогенная бледная трепонема штамма Никольса.

5. Комплекс серологических реакций на сифилис (КСР), состоящий из реакции связывания

комплемента (РСК) с трепонемным  и кардиолипиновым  антигенами,  и МР.  Поскольку  трепонемным
антиген является  специфическим,  КСР относится  к диагностическим  тестам. В связи  с разработкой
более   чувствительных,   специфичных   и   менее   трудоемких   реакций   стало   возможным   заменить   при
постановке КСР реакцию связывания комплемента на ИФА или РПГА также в сочетании с МР.

6. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), в которой в качестве антигена используют

патогенные бледные трепонемы штамма Никольса.

РИТ, РИФ, ИФА и РПГА являются высокочувствительными и высокоспецифичными реакциями на

сифилис. Они относятся к диагностическим подтверждающим тестам. При этом в связи с простотой
постановки и наличием коммерческих тест - систем ИФА и РПГА могут быть и высокоэффективными
отборочными тестами.

Ввиду различной чувствительности при разных формах сифилиса, специфичности и сложности

постановки каждая из указанных реакций имеет свое предназначение.

Профилактическое обследование населения на сифилис можно проводить с помощью МР, КСР,

ИФА и РПГА. Все организационные вопросы по применению данных реакций с этой целью решаются
органами здравоохранения на местах в зависимости от местных условий и возможностей.

При получении положительного результата в МР пациент должен обследоваться

дерматовенерологом с повторным исследованием крови в любом диагностическом тесте на сифилис.

При профилактическом обследовании на сифилис больных глазных, психоневрологических,

кардиологических стационаров, беременных, в частности, направляемых на искусственное прерывание
беременности, должны использоваться КСР, ИФА или РПГА.

При обследовании доноров необходимо применять КСР или ИФА или РПГА, но обязательно в

сочетании с МР. Постановка двух реакций одновременно обусловлена высокой ответственностью
данного исследования.

МР в количественном варианте с экономической точки зрения необходимо использовать в

качестве контроля эффективности лечения, заменив ею количественную постановку РСК с
кардиолипиновым антигеном.

Вышеуказанные специфические тесты служат для диагностики всех форм сифилиса, в частности,

скрытого, а также для распознавания ложноположительных результатов, полученных в МР и КСР. При
диагностике скрытого сифилиса целесообразна постановка двух специфических тестов одновременно.

Поскольку ИФА и РПГА являются более высокочувствительными, специфическими и

воспроизводимыми тест - системами, которые можно использовать в качестве отборочных и
подтверждающих тестов, осуществить до 2006 г. замену комплекса серореакций (КСР)
вышеуказанными реакциями при диагностике сифилиса.

Таким образом, последовательность обследования пациентов на сифилис представляется

следующим образом:

- при первичном обследовании производится постановка отборочной (скрининговой) реакции

микропреципитации (РМП) или ее модификации (RPR- РПР, TRUST - ТРАСТ, VDRL - ВДРЛ) в
количественном и качественном вариантах и в случае положительного результата - любого
специфического подтверждающего трепонемного теста (РПГА, ИФА, КСР, РИФ, РИТ);

- после окончания терапии ставится РМП или ее модификация и по снижению титра судят о

динамике инфекционного процесса и эффективности терапии. Подтверждением эффективности
проведенной терапии считается снижение титра в 4 и более раз в течение 1 года;

- по окончании этого срока осуществляется постановка той же специфической реакции, что и при

первичном обследовании. Следует учитывать, что специфические трепонемные тесты могут
оставаться положительными (не негативировать) в течение ряда лет, а в отдельных случаях остаются
положительными на всю жизнь.

Методика постановки и суть различных модификаций МР, ИФА, РПГА, РИФ, РСК и РИТ подробно

описаны в настоящих Методических указаниях.

Формула метода

Впервые детально описаны 6 методов, используемых для серо- и ликвородиагностики сифилиса

включающих 15 модификаций. Рекомендована замена РСК при определении эффективности лечения
сифилиса МР, что дает экономический эффект. Введена в инструкцию количественная методика
постановки РИТ, расширяющая возможности поздних форм сифилиса. Включены методики постановки
РСК, РИТ, РИФ-ц и ИФА для ликвородиагностики сифилиса.

Показания к применению метода

Серо- и ликвородиагностика всех форм сифилиса.

Противопоказаний нет.

МИКРОРЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ С КАРДИОЛИПИНОВЫМ АНТИГЕНОМ

(ЭКСПРЕСС - МЕТОД)

Принцип. При добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом эмульсии

кардиолипинового антигена образуется преципитат (комплекс антиген - антитело), выпадающий в виде
хлопьев белого цвета.

Материально - техническое обеспечение метода

Оборудование для взятия крови и постановки МР:
- капиллярные пипетки аппарата Панченкова;
- градуированные пипетки 1, 2, 5 и 10 мл;
- автоматические пипетки на 20-200 мкл;
- наконечники для автоматических пипеток;
- пробирки длиной 8-10 см и 14-15см, диаметром 1-1,5 см или центрифужные;
- пластинки из прозрачного материала с лунками диаметром 1-1,2 см, глубиной не менее 0,5 см;
- иглы для взятия крови из пальца и вены; шприцы;

- центрифуга, дающая не менее 1000 об/мин;
- аппарат для встряхивания;
- стерилизатор для кипячения игл, шприцов, инструментов.

    Ингредиенты для МР:
              - антиген кардиолипиновый для микрореакции;
              - холин - хлорид (включается в упаковку с антигеном);
              - натрий хлорид х.ч.;
              - натрий лимоннокислый (цитрат натрия)трехзамещенный
                Na C H O   5H O;
                  3 6 5 7    2
              - мертиолат C H O S Na Hg.
                           9 9 2
    Растворы:
              - изотонический раствор натрия хлорида 0,9%;
              - 10%  раствор холин - хлорида  готовится  следующим
              образом: к  29,65  мл изотонического раствора натрия
              хлорида добавляют 0,35 мл 0,01% раствора  мертиолата
              и 5 мл 70% раствора холин - хлорида. Смесь тщательно
              перемешивают.   При   отсутствии   мертиолата    для
              приготовления   10%   раствора   холин   -   хлорида
              необходимо  к  30  мл   стерильного   изотонического
              раствора  натрия хлорида добавить 5 мл 70%  раствора
              холин - хлорида;
              - 5%    раствор   трехзамещенного   цитрата   натрия
              готовится на дистиллированной  воде  и  фильтруется.
              Раствор  не стоек.  При помутнении его надо заменять
              свежим.  Хранится  в  холодильнике  при  4  град.  в
              течение 5-6 дней.

Контрольные лиофилизированные сыворотки крови необходимы для установления пригодности

эмульсии   антигена.   Отрицательную   и   положительную   контрольные   сыворотки   крови   используют
неразведенными,   слабоположительную   получают   из   положительной   путем   ее  разведения   по   титру,
установленному   в   день   приготовления   эмульсии   антигена.   При   отсутствии   лиофилизированных
сывороток   крови   используют   нативную   положительную   или   смесь   положительных   в   РСК   с
кардиолипиновым   антигеном   или   микрореакции   инактивированных   сывороток   крови,   которые
разливают по 0,5 мл в пробирки с плотно закрывающимися пробками, хранят в морозильном отделении
холодильника, используют с титром выше 1:8. В день постановки реакции сыворотку крови титруют на
пластинке  с  целью  подтверждения   ранее установленного   титра,   для  контроля   качества  эмульсии   и
получения слабоположительного результата, который используют затем в течение рабочего дня.

Титрование контрольной сыворотки проводят следующим образом: в 9 лунок пластинки, начиная

со второй лунки, вносят по 90 мкл изотонического раствора натрия хлорида и добавляют в первую и
вторую   лунки   по   90   мкл   контрольной   сыворотки   крови.   Содержимое   второй   лунки   перемешивают
пипеткой, насасывая и выпуская его в лунку 5-6 раз. Затем набирают 90 мкл содержимого второй лунки
в пипетку и 90 мкл переносят в третью  лунку. Содержимое третьей лунки перемешивают таким  же
образом и переносят в четвертую лунку и так далее до последней лунки. Из последней лунки 90 мкл
удаляют.   Во   все   лунки   добавляют   по   30   мкл   эмульсии   кардиолипинового   антигена.   Пластинку
встряхивают   в   аппарате   в   течение   5   минут,   добавляют  по  90  мкл  изотонического   раствора   натрия
хлорида и оставляют при комнатной температуре на 5 минут, после чего регистрируют результаты.
Разведение сыворотки крови, давшее слабоположительный результат (+/ 2+), используют в качестве
слабоположительного контроля. Для получения его делают соответствующее разведение. Например,
если слабоположительный результат получен с разведением сыворотки крови 1:8, то для получения
контрольной слабоположительной сыворотки крови в пробирку вносят 0,7 мл изотонического раствора
натрия хлорида и 0,1 мл положительной сыворотки крови, перемешивают.

При правильно проведенном титровании положительной сыворотки крови по мере ее разведения

наблюдается равномерное уменьшение величины хлопьев преципитата.

При снижении реактивности хранящейся нативной контрольной сыворотки крови используют

разведение,   дающее   слабоположительный   результат   при   повторном   титровании.   Контрольную
сыворотку   крови   можно   использовать   до   тех   пор,   пока   она   дает   положительный   результат   (4+)   в
разведении   не   ниже   1:2,   и   слабоположительный   результат   (2+)   в   разведении   не   меньше   1:4.   При

дальнейшем снижении реактивности употреблявшуюся положительную контрольную сыворотку крови
заменяют новой.

При хранении контрольных сывороток крови не допускаются повторные замораживания их и

оттаивание, т.к. в этом случае реактивность их снижается.

О снижении реактивности контрольной сыворотки крови, а не эмульсии антигена, судят по

параллельному   титрованию   этой   сыворотки   крови   с   использованием   хранившейся   и   вновь
приготовленной эмульсии. Если получают один и тот же титр антител в МР с обеими антигенными
эмульсиями,   то   считают,   что   снижение   реактивности   зависит   от   хранения   контрольной   сыворотки
крови, если же снижение реактивности наблюдают только при использовании хранившейся эмульсии
антигена,   то   это   обусловлено   снижением   реактивности   эмульсии   антигена,   которую   необходимо
заменить свежеприготовленной.

Серологические лаборатории кожно - венерологических диспансеров должны снабжать

контрольными сыворотками крови лаборатории района, использующие в своей работе экспресс - метод
и не имеющие положительных и отрицательных сывороток крови. При отсутствии контрольных
сывороток крови реакцию ставить нельзя.

Эмульсия кардиолипинового антигена готовится из специального кардиолипинового антигена для

микрореакции преципитации. Нельзя использовать в микрореакции кардиолипиновый антиген,
предназначенный для реакции связывания комплемента.

Перед приготовлением эмульсии обращают внимание на прозрачность ампулированного

антигена. При выпадении кристаллов холестерина их растворяют нагреванием ампул в термостате или
водяной бане при 37 град. или 56 град. соответственно.

Прежде чем приготовить эмульсию, рассчитывают необходимое количество ее на рабочий день

или рабочую неделю (на 50 исследований требуется 1 мл кардиолипинового антигена). В пробирку
вносят сухой пипеткой не более 2 мл антигена, добавляя его к равному объему 0,9% изотонического
раствора натрия хлорида, перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 минут, затем
центрифугируют при 1000 об/мин  до получения  прозрачной  жидкости,  которую  удаляют,  а к осадку
добавляют 3,5 объема (по отношению к взятому антигену) 10% раствора холин - хлорида. Например,
если требуемый объем антигена равен 0,5 мл, то для вычисления количества холин - хлорида 0,5 мл
умножают   на   3,5   и   получают   1,75   мл,   т.е.   необходимый   объем   холин   -   хлорида.   Пробирку   плотно
закрывают   пробкой   и   содержимое   перемешивают,   опрокидывая   пробирку,   до   полного
ресуспендирования. Полученная эмульсия готова к употреблению. При необходимости приготовления
большого   количества   эмульсии,   ее   готовят   не   в   одном   флаконе   большой   емкости,   а   в   нескольких
пробирках,   внося   в   каждую   из   них   по   2   мл   антигена.   Такие   объемы   обеспечивают   лучшее
перемешивание   антигена,   предохраняют   его   от   загрязнений   при   повторном   взятии   для   постановки
реакции, а также от нагревания и действия солнечных лучей.

Эмульсию антигена хранят в холодильнике при 4 град. не более недели, а при добавлении

раствора мертиолата - в течение 2 недель. В день постановки реакции нужное для данного рабочего
дня   количество   эмульсии   берут   из   холодильника,   оставляют   для   согревания   при   комнатной
температуре на 30 минут и перемешивают ее, опрокидывая пробирку, закрытую пробкой, не менее 30
раз,   затем   проверяют   ее   пригодность   на   контрольных   сыворотках   крови.   Применяемую   эмульсию
необходимо защищать от света, обернув пробирки с ней черной бумагой. Пригодность каждой новой
серии   антигена   проверяют   в   экспресс   -   методе   одновременно   с   уже   бывшей   в   работе   серией   на
заведомо   положительных   и   отрицательных   сыворотках   крови.   О   пригодности   антигена   судят   по
величине   титров,   наблюдаемых   при   одновременном   титровании   положительных   сывороток   крови   с
новой   и   проверенной   сериями   антигенов.   Получение   близких   результатов,   т.е.   величин   титров
реагентов,   отличающихся   на   +/-1   разведение,   одинаковой   выраженности   хлопьев   преципитата,
наблюдаемых   в   одних   и   тех   же   разведениях   положительных   сывороток   крови   свидетельствует   о
пригодности исследуемой серии антигена. Серию антигена бракуют, если одновременное титрование
контрольной   положительной   сыворотки   крови   с   новой   серией   антигена   показывает:   а)слабо
выраженный преципитат (2+/1+) при минимальных разведениях сыворотки крови; б) более низкий (на 2-
3 разведения) титр реагинов, чем с употреблявшейся проверенной серией; в) наличие преципитата в
отрицательных сыворотках крови.

Получение плазмы крови:
Кровь берут из пальца так же, как для исследования скорости оседания эритроцитов (СОЭ). При

взятии крови смачивают капилляр аппарата Панченкова 5% раствором цитрата натрия, набрав раствор
до метки "25", а оставшийся цитрат натрия выливают в центрифужную пробирку, куда затем вносят три
капилляра крови, взятой до метки "К", перемешивают. Кровь отстаивают при комнатной температуре, а
в экстренных случаях центрифугируют с целью получения плазмы крови, которую отсасывают
автоматической пипеткой для проведения исследования.

Получение инактивированной сыворотки крови:
Кровь берут из вены, получают сыворотку крови и инактивируют ее так же, как для РСК.

Методика постановки микрореакции:
Качественную и количественную постановки микрореакции с испытуемой плазмой и

инактивированной сывороткой крови следует осуществлять следующим образом.

При использовании качественной методики постановки микрореакции автоматической пипеткой

забирают   по   90   мкл   плазмы   или   инактивированной   сыворотки   крови   и   вносят   в   лунки,   куда   затем
добавляют   по   30   мкл   эмульсии   кардиолипинового   антигена.   В   каждую   лунку   вносят   плазму   или
сыворотку   крови   от   одного   обследуемого   и   нумеруют   соответственно   списку   в   регистрационном
журнале.   Ингредиенты   перемешивают   встряхиванием   пластины   во   встряхивателе   (100   качаний   в   1
минуту) в течение 5 минут, затем в каждую лунку добавляют по 90 мкл изотонического раствора натрия
хлорида, перемешивают покачиванием пластины и оставляют при комнатной температуре на 5 минут
(оптимальный   температурный   режим   реакции   23-28   град.).   Результаты   учитывают   только   после
появления хлопьев в контрольной слабоположительной сыворотке крови.

При использовании количественной методики постановки микрореакции в 9 лунок

горизонтального ряда пластины, начиная со второй лунки, вносят по 90 мкл изотонического раствора
натрия хлорида и добавляют в первую и вторую лунки по 90 мкл исследуемой плазмы или сыворотки
крови. Содержимое второй лунки перемешивают автоматической пипеткой, забирая его и выпуская из
нее в лунку 5-6 раз, затем забирают 90 мкл и переносят в третью лунку. Из третьей лунки 90 мкл
переносят в четвертую и т. д. по десятую лунку, из которой 90 мкл удаляют. Таким образом получают
двукратные разведения плазмы или сыворотки крови 1:2, 1:4, 1:8 и далее до 1:516. В первую лунку
изотонический раствор натрия хлорида не приливают, а вносят только 90 мкл плазмы или сыворотки
крови,   т.е.   исследуют   цельную   плазму   или   сыворотку   крови.   Во   все   лунки   добавляют   по   30   мкл
эмульсии   кардиолипинового   антигена.   Пластину   встряхивают   5   минут,   после   чего   во   все   лунки
добавляют   по   90   мкл   изотонического   раствора   натрия   хлорида.   Через   5   минут   регистрируют
результаты так же, как при постановке качественной реакции.

Титром преципитинов считают последнее разведение плазмы или сыворотки крови, где

обнаружен преципитат. Величина титра указывает на активность процесса, а его снижение во время
лечения - на эффективность терапии. Стабильность титров настораживает клиницистов в отношении
эффективности терапии, увеличение же их требует пересмотра лечения.

Для получения достоверных результатов следует пользоваться одной и той же серией препарата

при обследовании больного в процессе лечения, что относится ко всем реакциям на сифилис.

К моменту снятия леченного больного с учета неспецифические тесты с кардиолипиновым

антигеном обычно негативируются, в то время как позитивность специфических реакций может
наблюдаться долго после окончания лечения, в связи с чем эти тесты не могут служить критерием
излеченности и больные снимаются с учета с положительными результатами РИТ, РИФ, ИФА, РПГА.

Источники ошибок при постановке МР:
- неправильное взятие крови из пальца (наличие пузырей воздуха в капилляре пипеток);
- исключение из постановки реакции контрольных сывороток крови, в частности,

слабоположительных;

- неравномерная концентрация антигена в эмульсии вследствие недостаточного перемешивания

ее перед использованием;

- бактериальное загрязнение эмульсии;
- нарушение сроков и условий хранения плазмы и сыворотки крови, антигена и его эмульсии,

растворов;

- замена трехзамещенного цитрата натрия двухзамещенным;
- использование при постановке реакций загрязненных пробирок, пипеток, пластинок, растворов.
Вышеуказанные ошибки могут приводить к появлению как ложноотрицательных, так и

ложноположительных результатов реакции.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ СЕРО- И ЛИКВОРОДИАГНОСТИКИ

СИФИЛИСА

Принцип иммуноферментного анализа заключается в соединении комплекса "антиген - антитело"

с конъюгатом, содержащим ферментную метку, выявляемую с помощью субстратной смеси. В
настоящее время в нашей стране ИФА тест - системы разрабатываются по трем схемам проведения
реакции.

В основе первой схемы лежит следующее:

На твердофазном носителе (чаще лунки полистиролового планшета) зафиксирован антиген

возбудителя сифилиса, который инкубируется с испытуемой сывороткой, плазмой крови или ликвором.
При наличии в этом материале от пациентов противотрепонемных антител происходит их связывание в
комплекс "антиген - антитело" (I фаза реакции). После удаления не связавшихся иммуноглобулинов
следует инкубация с мечеными ферментом антителами к антивидовым иммуноглобулинам (конъюгат),
в ходе которой на поверхности носителя происходит присоединение к имеющимся комплексам "антиген
- антитело"  антител,  меченных ферментом (II фаза). После удаления  не связавшегося  конъюгата в
ходе   инкубации   с   раствором   субстрата   (в   случае   использования   пероксидазного   конъюгата,   это
перекись водорода в сочетании с орто - фенилендиамином (ОФД), 5-аминосалициловой кислотой (5-
АСК)   или   тетраметилбензидином   (ТМБ))   происходит   взаимодействие   фермента   с   субстратом,   в
результате чего развивается цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества связанных
сывороточных антител (III фаза). Результат реакции оценивается спектрофотометрически с выводом
цифровых данных, что исключает субъективность оценки, или визуально, что может быть полезным
при  отсутствии   в   лабораториях   соответствующего   оборудования.   По   такому   принципу  в   настоящее
время построено большинство ИФА тест - систем для диагностики сифилиса.

Вторая схема - ИФА с фиксированными антителами или "ловушка для антител". Здесь на

твердофазном   носителе   фиксируются   аффиноочищенные   антитела   против   определенного   класса
иммуноглобулинов   (М,  G  или  А),  которые   связывают  находящиеся  в  испытуемых сыворотках  крови
иммуноглобулины   соответствующего   класса   (I   фаза   реакции).   Образование   комплекса   "антитело   -
специфический иммуноглобулин" выявляют с помощью конъюгата, состоящего из антигенов бледной
трепонемы, меченных ферментом (II фаза). При инкубации с субстратом (III фаза) в случае наличия
сифилитических антител в испытуемой сыворотке или плазме крови наступает окрашивание раствора.
В   нашей   стране   разрабатываются   подобные   тест   -   системы,   в   основном   для   выявления
противотрепонемных IgM.

Третья схема ИФА используется для выявления суммарных антител, специфических для

определенного  антигена,   независимо   от  их   класса.   Ее   суть   заключается   в  том,   что   специфические
сывороточные   антитела   одновременно   взаимодействуют   с   антигеном,   зафиксированным   на
твердофазном   носителе,   и   с   тем   же   антигеном,   меченным   ферментом,   при   совместной   инкубации
испытуемого образца и конъюгата (I фаза реакции). Наличие образовавшегося комплекса определяют
с помощью субстрата (II фаза).

В зависимости от используемых антигенов все ИФА тест - системы для выявления антител

подразделяются на:

1) лизатные (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный

в культуре);

2) рекомбинантные - используются полученные генно - инженерным способом белки - аналоги

определенных белковых антигенов возбудителя;

3) пептидные - использующие синтетические фрагменты белков.
Среди отечественных ИФА тест - систем для выявления сифилитических антител, уже

рекомендованных Министерством здравоохранения РФ к применению в медицинской практике,
имеются лизатные, рекомбинантные и пептидные.

1. Тест - система иммуноферментная для выявления антител к Treponema pallidum в сыворотке

или плазме крови человека "РекомбиБест антипаллидум" и "РекомбиБест антипаллидум - стрип".
Разработчик - ЗАО "Вектор - Бест", п. Кольцово Новосибирской области. Назначение - выявление
специфических IgG.

2. Тест - система иммуноферментная для выявления антител к Treponema pallidum в сыворотке

или плазме крови человека "РекомбиБест антипаллидум - суммарные антитела". Разработчик - ЗАО
"Вектор - Бест", п. Кольцово Новосибирской области. Назначение - выявление специфических IgM и
IgG.

3. Тест - система иммуноферментная для выявления антител к возбудителю сифилиса "ИФА-

АНТИ-LUIS". Разработчик - НПО "Диагностические системы", г. Нижний Новгород. Назначение -
выявление специфических IgG.

4. Тест - система иммуноферментная для выявления антител к возбудителю сифилиса

(Treponema pallidum) на основе рекомбинантных белков. Разработчик - БТК "Биосервис", г. Москва.
Назначение - выявление специфических IgG.

5. Тест - система иммуноферментная для выявления IgM и IgG антител человека к антигенам

Treponema pallidum ("ЛюисСкрин"). Разработчик - ЗАО "Ниармедик" и АЗОТ "Диаклон", г. Москва.
Назначение - выявление специфических IgM и IgG.

6. Тест - система иммуноферментная для выявления антител к возбудителю сифилиса ("ЭКОлаб -

антипаллидум - скрин"). Разработчик - ТОО "ЭКОлаб", г. Электрогорск Московской области. Назначение
- выявление специфических IgG.

7. Тест - система иммуноферментная для выявления антител к возбудителю сифилиса ("ИФА-

анти - трепонема"). Разработчик - ЗАО "Вектор - Майстар", г. Новосибирск. Назначение - выявление
специфических IgG.

8. Тест - система иммуноферментная для качественного выявления антител к возбудителю

сифилиса в сыворотке крови человека ("АТ-Треп.-ИФТС"). Разработчик - ГП "Аллерген", г. Ставрополь.
Назначение - выявление специфических IgM и IgG.

9. Тест - система иммуноферментная для выявления антител к возбудителю сифилиса Treponema

pallidum (Сиф - Ат - NN 1,2). Разработчик - ТОО НИИ "Аквапаст", г. Санкт - Петербург. Назначение -
выявление специфических IgM и IgG.

10. Тест - система иммуноферментная для выявления суммарных антител к возбудителю

сифилиса ("ИФАанти-СИФ"). Разработчик - НПК "Препарат", г. Нижний Новгород. Назначение -
выявление специфических IgM и IgG.

Иммуноферментные тест - системы для диагностики сифилиса выпускаются в виде

многокомпонентных наборов, содержащих все реагенты, необходимые для проведения реакции, и
инструкцию по их применению.

Материально - техническое обеспечение метода:

Лаборатории, в которых осуществляется постановка ИФА, должны быть укомплектованы:
- набором автоматических пипеток (микродозаторов), который включает в себя одноканальные

пипетки переменного объема, рассчитанные на дозирование 5-40, 40-200 и 200-1000 мкл жидкости, а
также 8-канальные пипетки переменного объема на 5-50 (при использовании тест - систем с рабочим
разведением образцов 1:100 и 1:200) и 50-300 мкл;

- набором мерной химической посуды;
- термостатом, рассчитанным на поддержание температуры 37 град. С;
- дистиллятором лабораторным для получения дистиллированной воды;
- спектрофотометром планшетным;
- холодильником;
- рН-метром.
Результаты ИФА с сывороткой крови и ликвором при использовании всех тест - систем с

автоматическим учетом регистрируют на спектрофотометре для планшетов немедленно после
постановки реакции с измерением оптической плотности (ОП) раствора субстрата при длине волны 492
нм.

Выведение спектрофотометра на нулевой уровень ("бланк") осуществляют по воздуху. Учет

результатов реакции проводят согласно методике и цифровым данным, изложенным в инструкции по
применению,   имеющейся   в   каждом   используемом   наборе.   При   автоматическом   учете   результатов
реакции   по   величине   цифровых   показателей   ОП   в   лунках   с   испытуемыми   образцами   судят   о
концентрации   специфических   антител   в   исследуемой   сыворотке   крови   и   ликворе.   В   связи   с   этим
данный   метод   оценки   результатов   называют   количественным.   При   каждой   постановке   ИФА
рассчитывают критическое значение ОП (ОПкрит.) и "серую зону". "Серой зоной" является интервал от
ОПкрит.   -   10%   до   ОПкрит.   +   10%.   Исследуемый   образец   учитывают   как   положительный,   если   ОП
данного образца выше "серой зоны", как сомнительный, если ОП находится в пределах "серой зоны", и
как отрицательный, если ОП ниже "серой зоны". Так учитывают результаты во всех тест - системах,
кроме   тест   -   системы   "ЛюисСкрин".   В   тест   -   системе   "ЛюисСкрин"   исследуемая   сыворотка
расценивается как положительная, если ее ОП превышает ОП отрицательного контроля не менее, чем
в 2 раза.

К сожалению, при учете результатов реакции все ИФА тест - системы невозможно привести к

единому стандарту. Один и тот же образец может давать в разных тест - системах совершенно разный
уровень   окрашивания   раствора   субстрата.   Это   зависит   от   конструкции   самой   тест   -   системы,
используемого антигена, концентрации конъюгата и др., а также от величины ОПкрит. Поэтому более
точной оценкой результатов ИФА является титр противотрепонемных антител каждого положительного
образца.   С   целью   определения   титра   производят   последовательные   2-кратные   разведения
испытуемой   сыворотки   крови,   давшей   положительный   результат.   За   титр   принимают   наибольшее
разведение   сыворотки,   дающее   положительный   результат.   Следовательно,   титр   является
количественным   показателем   уровня   специфических   антител   в   данном   образце   и   степени   его
позитивности.   Но   следует   учитывать,   что   повторное   исследование   сыворотки   крови   должно
осуществляться с той же тест - системой, так как титр антител в одном и том же образце может быть
различным при использовании разных тест - систем.

содержание .. 441 442 443 444 ..