Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 79

споринов — цефалоспориназу, тетрацикли-

нов —ионы магния, являющиеся антагонистами

тетрациклина.

Кровь от больного для посева следует брать

в начале озноба при подъеме температуры.

Кровь для посева берут из вены, строго соб-

людая правила асептики. Для этого кожу на ме-

сте венопункции тщательно обрабатывают спир-

том и йодом повторно. Шприцем, стерилизован-

ным в автоклаве, набирают 10—15 мл крови

(2—3 мл у маленьких детей), которую либо не-

посредственно у постели больного засевают в пи-

тательную среду, либо помещают в стерильную

посуду, содержащую вещества, препятствующие

свертыванию крови (0,3 % раствор цитрата нат-

рия, 0,1 % оксалата натрия, 1 мл гепарина

и др.). Материал быстро транспортируют в лабо-

раторию, где производят дальнейшее исследова-

ние. Хранить кровь в холодильнике можно не

более 1—2 ч, при более длительном хранении

возможен лизис бактерий.

П р о в е д е н и е  и с с л е д о в а н и я . Про-

изводят посев 5—10 мл крови на 50—100 мл

жидкой питательной среды — 1 % сахарный

бульон, «двухфазную» среду, а также жидкие и

полужидкие среды для культивирования анаэро-

бов '. При подозрении на брюшной тиф или дру-

гие инфекции применяют специальные питатель-

ные среды [Биргер М. И., 1982]. Для количест-

венного определения массивности обсеменения

крови делают посев нескольких капель крови из

шприца на поверхность чашки Петри с 5 % кро-

вяным агаром. Посевы инкубируют в термостате

в течение 10 дней. Просмотр посевов производят

ежедневно. При наличии роста на питательных

средах делают высевы на чашки с 5 % кровяным

агаром, которые инкубируют в аэробных и анаэ-

робных условиях. Из колоний, выросших на

чашках с кровяным агаром, выделяют чистую

культуру, идентифицируют ее и определяют чув-

ствительность к антибиотикам. Посевы крови на

«двухфазной» среде просматривают, наклоняя

флакон и таким образом увлажняя поверхность

скошенного агара бульоном с кровью. При этом

исключается необходимость в высевах на плот-

ные среды и снижается возможность загрязне-

ния посевов. Во избежание высыхания питатель-

ных сред пробки флакона парафинируют. В та-

ком виде флаконы можно выдерживать в течение

месяца, что бывает необходимо при выделении

медленно растущих микроорганизмов.

Однократный посев крови не всегда приводит

к выделению гемокультуры. Более информатив-

ным является трехкратный посев крови с интер-

валами между посевами в сутки. У леченых

больных кровь для посева следует брать 5—

6 раз.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в микробиоло-

гического исследования крови зависит от вида

выделенных микроорганизмов и массивности ро-

ста. Выделение патогенных видов с несомнен-

ностью свидетельствует об их этиологической

роли в заболевании. В том случае, когда из кро-

ви выделены УПМ, следует учитывать их коли-

1

 См. с. 315.

чественное содержание (выделение единичных

клеток чаще свидетельствует о контаминации),

наличие монокультуры или ассоциации (ассо-

циации чаще выделяются при загрязнении посе-

ва, однако у больных со сниженной иммунологи-

ческой реактивностью возможна смешанная ин-

фекция), повторность выделения одной и той же

культуры от больного и идентичность гемокуль-

туры с культурами, выделенными из другого

материала от этого же больного.

При окончательном заключении микробиолог

должен сопоставить данные микробиологическо-

го исследования с клиникой заболевания и ре-

зультатами других анализов.

Если через 10 дней после посева крови роста

микробов на питательных средах не обнаружено,

анализ можно считать отрицательным.

С р е д ы  д л я  к у л ь т и в и р о в а н и я

а н а э р о б о в . 1. Плотная питательная среда

типа КАБ: 1 г. твин 80, 2 г Na

2

HPO

4

, 1 г раство-

римого крахмала, 1 г гидрокарбоната натрия

растворяют при подогревании в 60 мл дрожжево-

го аутолизата. Раствор фильтруют, добавляют к

940 мл растопленного мясо-пептонного агара,

хорошо перемешивают и автоклавируют в тече-

ние 20 мин при 0,5 атм. После фильтрации при-

бавляют 250 мг 1-цистеина гидрохлорида, 0,4 мл

тиогликолевой кислоты и 6 г глюкозы; устанав-

ливают рН 7,0—7,2, разливают в пробирки по

10 мл, стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. Эту осно-

ву хранят в условиях холодильника. Перед ис-

пользованием среду регенерируют 20 мин в кипя-

щей водяной бане, быстро охлаждают до 50 °С,

прибавляют 0,1 мл раствора гемина (50 мг геми-

на растворяют в 1 мл 1 н. NaOH, добавляют

100 мл дистиллированной воды, автоклавируют

при 1 атм 15 мин); 1 мл лизированной двукрат-

ным замораживанием и оттаиванием цитратной

крови донора перемешивают, выливают в чашку

Петри, после застывания подсушивают 10—

15 мин. Используют для посева или помещают

для хранения в анаэробные условия при комнат-

ной температуре. Для придания среде селектив-

ных свойств перед разливом в чашки прибав-

ляют один из следующих антибиотиков:

75 мкг/мл неомицина или канамицина, 50 мкг/мл

гентамицина, 40 мкг/мл налидиксовой кислоты

(невиграмон, неграм).

2. Жидкая питательная среда. Ее основной

состав и способ приготовления те же, что и для

плотной среды. Однако вместо мясо-пептонного

агара используют мясо-пептонный бульон (со-

держание агар-агара в среде 0,6 г/л). Приготов-

ленную основу разливают по 100—150 мл во

флаконы и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин, хра-

нят в холодильнике. Перед использованием сре-

ду регенерируют 20  м и н на кипящей водяной

бане, быстро охлаждают до 50 °С, прибавляют

1 мл раствора гемина (на 100 мл среды), 10—

15 % по объему стерильной сыворотки крупного

рогатого скота (можно использовать лошади-

ную сыворотку, стерильную асцитическую жид-

кость), разливают по 5 мл в пробирки и хранят

в анаэробных условиях при комнатной темпера-

туре, выдержав предварительно микроанаэро-

статы со средой при 37 °С в течение 2 сут для

контроля стерильности среды. Используется так-

315

Рис. 14. Схема посева мочи секторным методом.

А, I,  I I ,  I I I — последовательность посева мочи по

секторам.

же стандартная «Питательная среда для контро-

ля стерильности сухая», к которой добавляют

растворимый крахмал, твин 80, гемин в коли-

чествах и способом, как указано выше. Готовые

к употреблению среды хранят также в анаэроб-

ных условиях.

3. Желточная анаэробная среда. К 500 мл ре-

генерированной плотной среды для анаэробов

(основа), охлажденной до 60 °С, с соблюдением

правил асептики прибавляют желток одного

я й ц а (поверхность должна быть деконтаминиро-
вана погружением яйца на 1 ч в 96 % спирт;
яйцо не должно содержать антибиотиков), пере-

мешивают, разливают в чашки Петри. После за-

стывания подсушивают, хранят в анаэробных
условиях.

7.3.2. Моча

Микробиологическое исследование мочи про-

изводят при воспалительных заболеваниях моче-
испускательных путей.

Э т и о л о г и я . Наиболее частыми возбуди-

телями воспалительных процессов мочевого
тракта являются грамотрицательные бактерии:

Е. coli, Proteus, Providencia, Enterobacter, Kleb-
siella, Ps. aeruginosa, Serratia, Streptococcus

группы Д. Возбудителями могут быть также

Staph. aureus, Staph. epidermidis, Candida  a l b i -

cans, Mycoplasma и другие микроорганизмы.

В з я т и е  м о ч и  д л я  и с с л е д о в а -

н и я . Микробиологическое исследование мочи
нужно проводить до начала антибактериальной

терапии.

После тщательного туалета наружных поло-

вых органов в стерильную посуду собирают
среднюю порцию свободно выпущенной мочи
в количестве 3—5 мл. Взятие мочи с помощью
катетера связано с риском  и н ф и ц и р о в а н и я моче-

316

вых путей, поэтому его желательно избегать.

Катетеризацию производят только в случаях

необходимости — если больной неспособен мо-

читься или для разграничения воспалительного

процесса в почках и мочевом пузыре. С этой

целью мочевой пузырь опорожняют и вводят
в него 50 мл раствора, содержащего 40 мг неоми-

цина и 20 мг полимиксина. Через 10 мин берут
пробы мочи для исследования. При локализации

процесса в мочевом пузыре моча остается сте-

рильной, при инфекции в почках отмечается
бактериурия.

Мочу можно получить от больного путем над-

лобковой  п у н к ц и и мочевого пузыря. Этот метод

взятия мочи дает наиболее достоверные резуль-

таты исследования, однако имеется опасность

и н ф и ц и р о в а н и я больного.

Микробиологическое исследование мочи на-

до проводить как можно быстрее после ее полу-

чения от больного, с тем чтобы избежать раз-

множения находящихся в ней микроорганизмов.
Размножение микробов в моче до начала анали-

за приводит к ложным результатам при количе-
ственном определении бактериурии и может дез-
ориентировать в отношении возбудителя заболе-

вания. Если немедленное исследование мочи
невозможно, то ее следует хранить в холодиль-

нике при 4 °С не более суток.

П р о в е д е н и е  и с с л е д о в а н и я . Оп-

ределяют степень бактериурии — количество

колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл мочи

методом секторных посевов мочи. Платиновой

петлей диаметром 2 мм (вместимостью 0,005 мл)
производят посев мочи — 3—4 штриха на

сектор  ч а ш к и Петри с простым агаром (рис. 14).
После этого петлю прожигают и производят 4

штриховых посева из сектора А в сектор I и ана-

логичным образом из сектора I в сектор II и из
сектора II в сектор  I I I (каждый раз прожигая

петлю). Чашки инкубируют при 37 °С 18—24 ч,
после чего подсчитывают число колоний, вырос-
ших в разных секторах. Определение степени

бактериурии по количеству выделенных колоний

производят согласно табл. 47.

Колонии, выросшие на плотной питательной

среде, отсевают в пробирки со скошенным ага-

ром, выделенную чистую культуру идентифици-
руют и определяют ее чувствительность к анти-

бактериальным препаратам.

У с к о р е н н ы е  м е т о д ы  о п р е д е л е -

н и я  с т е п е н и  б а к т е р и у р и и основаны
на определении продуктов метаболизма, обра-

зующихся при размножении микроорганизмов
в моче. Они дают менее точные результаты, чем
метод секторных посевов, и используются преи-

мущественно при массовых профилактических

обследованиях больших контингентов людей или

для экспресс-диагностики. При положительном

результате, полученном ускоренными методами,

необходимо дальнейшее исследование с по-
мощью более точного бактериологического ме-

тода.

Нитратный тест. Нитриты, являющиеся про-

дуктами метаболизма представителей семейства

энтеробактерий, могут быть обнаружены в моче
с помощью реактива Грисса. Готовят два рас-
твора: а) 1,25 г сульфаниловой кислоты раство-

Т а б л и ц а 47. Определение степени бактериурии

методом секторных посевов

Сектор А

1-6

8—20

20—30

30—60

70—80

100—150

Не сосчи-

тывается

То же

» »

» »

» »

Количество колоний

в секторах

I

—

—

—

—

5—10

20—30

40—60

100—140

Не сосчи-

тывается

То же

11

—

—

—

—

—

—

—

10—20

30—40

60—80

111

—

—

—

—

—

—

—

—

—

Еди-

нич-

ные

коло-

нии

Количество

бактерий в

1 мл мочи

Менее 1000

3000

5000

10000

50

 000

100000

500 000

1 000 000

5 000 000

10000000

100000000

ряют в 500 мл 30 % уксусной кислоты; б) 2,5 г

а-нафтиламина растворяют в 500 мл 30 % уксус-

ной кислоты. Оба раствора хранят в защищен-
ном от света месте.

Непосредственно перед исследованием оба

раствора смешивают в равных количествах, 1 мл

смеси добавляют к 1 мл мочи. Появление крас-

ного окрашивания свидетельствует о присутст-
вии в 1 мл мочи не менее 10

5

 микробных клеток.

ТТХ-тест. Трифенилтетразолия хлорид (ТТХ)

под действием продуктов жизнедеятельности

микроорганизмов переходит из бесцветного в
красный нерастворимый в воде трифенилформа-
зан. Интенсивность окраски находится в прямой

зависимости от степени бактериурии.

Готовят три раствора: 1) насыщенный рас-

твор двузамещенного фосфата натрия; 2) 750 мл
ТТХ растворяют в 100 мл раствора 1; 3) рабо-

чий раствор: 4 мл раствора 1 смешивают со

100 мл раствора 2. Хранят растворы в прохлад-

ном защищенном от света месте. Срок  х р а н е н и я
растворов 1 и 2 — до 2 мес, рабочего раствора —
не более 2 нед.

При постановке реакции пользуются сте-

рильной посудой.

К 2 мл мочи прибавляют 0,5 мл рабочего

раствора и помещают после перемешивания

в термостат при 37 °С. После 4-часовой инкуба-

ции учитывают результаты. Появление на дне
пробирки красного осадка свидетельствует о на-

личии в 1 мл мочи не менее 10

5

 микробных кле-

ток.

Ускоренные методы позволяют дать немед-

ленный ответ. При использовании бактериологи-
ческих методов лаборатория дает предваритель-

ный ответ через день — после получения резуль-

татов определения степени бактериурии и окон-

чательный — через 3—4 дня, после выделения
микроорганизмов, их идентификации и опреде-

ления чувствительности к антибактериальным

препаратам. В окончательном ответе указывают

степень бактериурии, вид выделенных культур,
их чувствительность к лекарственным веще-
ствам.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . Основная за-

дача при интерпретации полученных  д а н н ы х

заключается в доказательстве этиологической
роли микроорганизмов, выделенных из мочи.

Учитывают комплекс тестов: степень бактериу-
рии, вид выделенных культур, повторность их

выделения в процессе заболевания, присутствие
в моче монокультуры или ассоциации микро-

организмов.

Степень бактериурии позволяет дифференци-

ровать инфекционный процесс в мочевых путях
от контаминации мочи нормальной микро-
флорой.

Оценку производят на основании следующих

критериев.

1. Степень бактериурии, не превышающая

10

3

 КОЕ/мл мочи, свидетельствует об отсутст-

вии воспалительного процесса и обычно являет-

ся результатом  к о н т а м и н а ц и и мочи.

2. Степень бактериурии, равная 10

4

 КОЕ/мл,

расценивается как сомнительный результат.
Исследование следует повторить.

3. Степень бактериурии, равная и выше

10

5

 КОЕ/мл мочи, указывает на наличие воспа-

лительного процесса.

Изменение степени бактериурии в процессе

заболевания может быть использовано для
контроля за течением процесса и эффектив-

ностью терапии: уменьшение степени бактериу-

рии свидетельствует о благоприятном течении
заболевания и эффективности использованных

лекарственных препаратов.

В некоторых случаях у больных, получающих

антибактериальную терапию, при плохом оттоке
мочи, при ее низкой относительной плотности

и рН ниже 5,0 может наблюдаться низкая сте-
пень бактериурии при имеющемся заболевании.
Поэтому, помимо степени бактериурии, следует

учитывать вид выделенных из мочи микроорга-
низмов. Эшерихии, протей, синегнойная палоч-

ка, клебсиеллы чаще выделяются из мочи боль-
ных уроинфекцией. Дифтероиды, лактобациллы

и другие грамположительные палочки обычно

выделяются из мочи здоровых людей. Повторное
выделение из мочи культуры одного вида, типа,
варианта свидетельствует о инфекционном про-
цессе.

Монокультура чаще выделяется при острых

воспалительных процессах и коррелирует с вы-

сокой степенью бактериурии. Ассоциации  м и к -
роорганизмов чаще встречаются при хрониче-
ских процессах.

При окончательной оценке результатов мик-

робиологического исследования мочи необходи-

мо учитывать данные  к л и н и к и и другие лабора-

торные анализы.

7.3.3. Отделяемое при инфекциях

нижних дыхательных путей

Микробиологическое исследование проводят

при воспалительных заболеваниях дыхательных

путей: пневмонии, бронхитах, плевритах, брон-
хоэктатической болезни, абсцессе легкого и др.

317

Э т и о л о г и я . Возбудителями воспалитель-

ных процессов нижних дыхательных путей могут

быть бактерии, микоплазмы, вирусы, риккетсии,

грибы и простейшие. Наиболее частыми возбу-

дителями среди бактерий являются Str. pneumo-

niae, Staph. aureus, Klebsiella pneurnoniae,

H.  i n f l u e n z a e , Ps. aeruginosa и др.

При метастатических и аспирационных пнев-

мониях с очагом инфекции в брюшной полости,

органах малого таза и забрюшинном простран-

стве доминируют неспорообразующие анаэробы

(бактероиды, пептококки), реже выделяются

клостридии.

В з я т и е  м а т е р и а л а  д л я  и с с л е -

д о в а н и я . Исследуют мокроту, содержимое

бронхов, полученное при бронхоскопии, плев-

ральную жидкость, аспираты и пунктаты из тра-

хеи, легочную ткань, полученную при пункции

и биопсии легкого.

Наиболее информативно исследование пунк-

татов из легких, трахеи. Однако применение ука-

занных методов связано с определенным риском,

в связи с чем их следует использовать лишь при

тяжелых заболеваниях и при отсутствии мокро-

ты или отрицательном результате ее исследо-

вания.

Мокроту для микробиологического исследо-

вания следует брать до начала антибактериаль-

ной терапии или через определенный промежу-

ток времени после введения препарата, необхо-

димый для его выделения из организма больного.

Исследуют утреннюю порцию мокроты. Перед

сбором мокроты больной должен прополоскать

рот кипяченой водой или слабым раствором ан-

тисептика, почистить зубы. Мокроту собирают

в стерильную посуду — плевательницу, чашки

Петри и пр. Наиболее информативно исследова-

ние мокроты, полученной при бронхоскопии, так

как она практически не загрязнена микрофлорой

верхних дыхательных путей и полости рта. Хра-

нить мокроту до исследования следует в холо-

дильнике при 4 °С не более 2—3 ч. При более

длительном хранении погибают малоустойчивые

виды микроорганизмов (стрептококки), разви-

ваются процессы брожения и гниения, искажаю-

щие результаты исследования.

П р о в е д е н и е  и с с л е д о в а н и я . Ис-

следуют гнойные комочки мокроты, которые мак-

симально освобождают от микрофлоры верхних

дыхательных путей промыванием их в чашке

Петри, содержащей изотонический раствор нат-

рия хлорида. Готовят мазки, растирая комочек

мокроты между стеклами, окрашивают их по

Граму и Цилю — Нильсену (для обнаружения

в мокроте туберкулезных палочек). При бакте-

риоскопии мазков можно ориентировочно судить

о характере и количестве микрофлоры в мокроте.

Микроскопия мазка помогает также выявить

трудно культивируемые микроорганизмы. Ино-

гда бактериоскопия определяет характер куль-

турального исследования.

Посев мокроты (отмытых гнойных комочков)

производят на ряд питательных сред: 5 % кровя-

ной агар (лучше использовать баранью или кро-

личью кровь), среду Эндо, среду Левинталя, сре-

ду для анаэробов. Посев производят шпателем,

равномерно растирая комочек мокроты по по-

318

верхности питательной среды. На поверхность

кровяного агара, засеянную исследуемым мате-

риалом, можно положить диски с сапонином,

чтобы создать селективные условия для роста

H. influenzae.

Среды с посевами инкубируют при 37 °С в те-

чение 18—24 ч. Из выросших колоний выделяют

чистые культуры, идентифицируют их и опреде-

ляют чувствительность к антибактериальным

препаратам.

При обнаружении в микроскопическом пре-

парате грибов делают посев на среду Сабуро или

другие среды для выращивания грибов. При по-

дозрении на туберкулез или микоплазменную

инфекцию делают посевы на соответствующие

среды.

Чтобы различить контаминацию мокроты

микрофлорой верхних дыхательных путей и по-

лости рта, используют количественные методы

исследования.

Мокроту для количественного исследования

[Селина Л. Г., Дорожкова И. Р., 1980] собирают

в стерильную банку с бусами для гомогенизации

материала или в обычную посуду, но перед посе-

вом растирают тщательно в ступках. В стериль-

ную банку с бусами помещают 1 мл (0,5 мл) мок-

роты, добавляют туда 9 мл (4,5 мл) 2 % пептон-

ной воды или питательного бульона. Смесь

встряхивают в течение нескольких минут, из по-

лученной гомогенизированной мокроты готовят

последовательные десятикратные разведения,

добавляя к 0,1 мл мокроты 0,9 мл изотонического

раствора натрия хлорида. Затем по 0,1 мл полу-

ченных разведений засевают на чашки с 5 %

кровяным агаром, растирая материал шпателем

по поверхности среды. Через сутки инкубации

при 37 °С учитывают результаты: подсчитывают

однотипные по внешнему виду колонии, их число

умножают на 10, так как производят посев 0,1 мл

мокроты, и на степень разведения материала. Из

колоний готовят мазки, выделяют чистые куль-

туры, идентифицируют, определяют чувстви-

тельность к антибактериальным препаратам.

Для выделения пневмококка можно внутри-

брюшинно заражать белых мышей 0,5 мл взвеси

первичного материала в бульоне или частью

осадка после центрифугирования материала.

Через 6—8 ч у зараженной мыши берут экссудат

из брюшной полости, делают посев на чашки с

5 % кровяным агаром, из остатка экссудата го-

товят мазки, которые окрашивают по Граму.

Можно также забить зараженное животное и

сделать посев крови из сердца на сывороточный

бульон и чашки с кровяным агаром и мазки-от-

печатки из селезенки на предметном стекле (ок-

раска по Граму). При наличии пневмококка в

исследуемом материале на питательных средах

вырастет чистая культура.

О ц е н к а  р е з у л ь т а т о в . Наиболее

сложно определить этиологическую роль со-

держащихся в мокроте микроорганизмов, кон-

таминирующих ее при прохождении через верх-

ние дыхательные пути и ротовую полость. Для

разделения этой микрофлоры от микроорганиз-

мов  н и ж н и х дыхательных путей используют ряд

тестов. С помощью количественного метода

определяют содержание в мокроте определен-