Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 78

парина (G. Richter), разведенного 1 : 10, вносят

10 мл крови из кубитальной вены. Кровь тща-

тельно перемешивают и центрифугируют 10 мин

при 1000 об/мин. Плазму вместе со слоем лейко-

цитов осторожно отсасывают и помещают в

чистую центрифужную пробирку, добавляя 5—

6 мл среды 199. Лейкоциты отмывают центри-

фугированием 10 мин при 1000 об/мин. Надоса-

дочную жидкость удаляют, а находящиеся в

осадке лейкоциты ресуспендируют в среде 199

дважды, каждый раз повторяя процедуру «Мяг-

кого» центрифугирования. После последнего

центрифугирования пипеткой отсасывают над-

осадочную жидкость и часть клеточной взвеси,

оставив в центрифужной пробирке 0,2 мл

(10Х10

6

 кл/мл) клеточной взвеси в среде 199.

С косого агара с суточной культурой стафило-

кокка стерильным изотоническим раствором нат-

рия хлорида смывают колонии микробов. Ис-

пользуя стандарт оптической мутности, разводят

микробную взвесь до концентрации 1 млрд.

микробных клеток в 1 мл; 0,3 мл этой взвеси

вносят в пробирку, содержащую 0,2 мл лейко-

цитов в среде 199, и добавляют 0,15 мл пула

свежих донорских сывороток  A B ( I V ) группы

(для опсонизации). Осторожным ротированием

перемешивают компоненты и термостатируют

30 мин при 37 °С. По истечении указанного вре-

мени в пробирку добавляют 5 мл прогретого до

37 °С изотонического раствора натрия хлорида,

встряхивают и центрифугируют 10 мин при

1500 об/мин. По окончании центрифугирования

надосадочную жидкость удаляют и делают мазки

из лейкоцитарной взвеси, остатки которой вновь

помещают в термостат при 37 °С для продолже-

ния инкубации еще в течение 90 мин. Затем мазки

приготавливают повторно из осадка двухчасовой

инкубации.

Мазки готовят как обычно, на тщательно

вымытых обезжиренных предметных стеклах.

Каплю лейкоцитарной взвеси помещают неда-

леко от края стекла и шлифованным предметным

стеклом, поставив его под углом 45° к поверх-

ности впереди капли и подождав, пока капля

равномерно распределится вдоль его ребра,

легким быстрым движением проводят вперед,

не отрывая от предметного стекла раньше, чем

иссякнет вся капля.

Правильно сделанный мазок имеет равно-

мерно матовый оттенок, не достигает краев стек-

ла и заканчивается остроконечными язычками.

Приготовленные мазки сушат на воздухе,

затем фиксируют 10 мин в абсолютном метило-

вом спирте и красят по Романовскому—Гимзе

азур-эозином.

Состав готового красителя: азур II — 3 г,

водорастворимый желтый эозин — 0,8 г, мети-

ловый спирт — 250 мл и глицерин — 250 мл.

Для окраски мазков берут 2 капли основного

раствора красителя на 1 мл дистиллированной

воды.

Можно готовить краску непосредственно пе-

ред окрашиванием мазков из азура II, эозина

и дистиллированной воды в соотношении  3 : 2 : 5 .

На один мазок наслаивают 3 мл раствора кра-

сителя. Длительность окраски 45—50 мин.

После окрашивания мазки просматривают

под микроскопом в иммерсионной системе (счи-

тают не менее 200 клеток) и производят расчет

показателей фагоцитоза.

1. Фагоцитарный индекс (ФИ) — процент

клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего их

числа.

2. Фагоцитарное число (ФЧ) — среднее

число бактерий, находящихся внутриклеточно

(частное от деления общего числа поглощен-

ных бактерий на число клеток, вступивших в

фагоцитоз).

3. Оба показателя рассчитывают на мазках,

сделанных после 30- и 90-минутной (т. е. в общей

сложности 120-минутной) инкубации, иными

словами, речь идет о ФИЗО и ФИ120, соответст-

венно ФЧЗО и ФЧ120.

4. Коэффициент фагоцитарного числа:

ФЧЗО

ФЧ120 '

5. Индекс бактерицидности нейтрофилов:

где Чу — число убитых внутри фагоцитов микро-

бов; Чп — общее число поглощенных фагоци-

тами микробов.

6. Опсонический индекс поглощения:

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы : ФИЗО

94,18+1,55%; ФИ120 92,00 + 2,52%; ФЧЗО

11,29 + 1,00%; ФЧ120 9,81+0,96%; КФЧ

1,16

 + 0,04 %; ИБН 66,3 + 2,58 %.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Изучение

показателей фагоцитоза имеет значение в комп-

лексном анализе диагностики иммунодефицит-

ных состояний: часто рецидивирующие гнойные

воспалительные процессы, длительно не зажи-

вающие раны, склонность к послеоперационным

осложнениям. Помогает в диагностике вторичных

иммунодефицитных состояний, вызванных ле-

карственной терапией. В связи с тем что фаго-

циты участвуют в элиминации иммунных комп-

лексов и активность фагоцитоза тесно связана

с активностью компонентов комплемента, а имен-

но Сз, концентрацией IgG антител, наличием

других опсонирующих факторов, исследование

фагоцитоза играет роль в диагностике, оценке

активности и эффективности терапии при ревма-

тических болезнях, коллагенозах.

Наиболее информативным для оценки фаго-

цитарной активности следует считать индекс

поглощения, т. е. фагоцитарное число, коэффи-

циент фагоцитарного числа, которые отражают

завершенность фагоцитоза и индекс бактери-

цидности — способность фагоцита переваривать

захваченный микроб. Особое значение в выявле-

нии причин изменений фагоцитарной активности

имеет определение опсонического индекса погло-

щения, так как он характеризует наличие сыво-

роточных факторов, сопутствующих миокарди-

там, ревматизму, ревматоидному артриту и др.,

способных изменить активность иммунокомпе-

гентных и фагоцитирующих клеток.

Р а з д е л 7

МЕТОДЫ  К Л И Н И Ч Е С К О Й  М И К Р О Б И О Л О Г И И

7. 1.  О Б Щ И Е  С В Е Д Е Н И Я

Микробиологические исследования при гной-

но-воспалительных заболеваниях проводят с

целью их диагностики, изучения этиологической

структуры, определения чувствительности воз-
будителей к антибактериальным препаратам.

Результаты микробиологического исследования
способствуют выбору наиболее эффективного

препарата для антибактериальной терапии,
своевременному проведению мероприятий для

профилактики внутрибольничных инфекций.

Возбудителями гнойно-воспалительных за-

болеваний (ГВЗ) наиболее часто являются

условно-патогенные микроорганизмы (УПМ),
входящие в состав естественной микрофлоры че-

ловека или попадающие извне. УПМ вызывают
заболевания преимущественно у людей с пони-

женной иммунологической реактивностью, этио-

логическая структура их непостоянна, часто

встречаются ассоциации микроорганизмов.

Микробиологические исследования при за-

болеваниях, вызванных УПМ, направлены на
выделение всех микроорганизмов, находящихся

в патологическом материале, что существенно

отличает их от аналогичных исследований при
заболеваниях, вызванных истинно патогенными

м и к р о о р г а н и з м а м и , когда проводится поиск
определенного возбудителя.

Для получения адекватных результатов

анализа при ГВЗ особенно важно соблюдать ряд

требований при взятии материала для исследо-

вания, его транспортировки в лабораторию, про-
ведения анализа и оценки его результатов.

7.1.1. Сбор и транспортировка проб

При взятии материала для проведения мик-

робиологического исследования необходимо соб-

людать ряд правил.

1. Брать материал до начала антибакте-

риальной терапии или через определенный про-

межуток времени после введения препарата, не-
обходимый для его выведения из организма

(практически через 8—10 ч после введения боль-

шинство антибиотиков уже выводится из орга-
н и з м а ) .

2. Брать материал непосредственно из очага

инфекции или исследовать соответствующее от-

деляемое (гной из фистулы, мочу, желчь и  п р . ) .

3. Брать материал во время наибольшего со-

держания в нем возбудителей заболевания: на-

пример, кровь для выделения гемокультуры

в  н а ч а л е озноба, при повышении температу-

ры

 и т. п.

4. Соблюдать строжайшую асептику во из-

бежание загрязнения пробы микрофлорой окру-
жающей среды.

5. Материал для выделения аэробов и фа-

культативных анаэробов брать стерильными

ватными тампонами (отделяемое из раны, мазки
со слизистых оболочек, из глаза, носа, зева, цер-
викального канала, влагалища, анального от-

верстия), шприцем (кровь, гной, экссудаты),

непосредственно в стерильную посуду (моча,

мокрота, фекалии) (подробно см. соответствую-
щие разделы).

Материал для выделения строгих анаэробов

получают из патологического очага путем пунк-

ции шприцем, из которого предварительно уда-

лен воздух; при исследовании кусочков ткани их
берут из глубины очага. При необходимости

использовать тампоны их нужно сразу после

взятия материала погружать в транспортную
среду. '

6. Количество материала должно быть доста-

точным для проведения исследования, и для его

повторения в случаях необходимости.

7. Транспортировку нативного клинического

образца в лабораторию следует производить в

максимально короткие сроки — это определяет
эффективность микробиологического исследо-

вания. При длительном хранении материала

происходит гибель наиболее требовательных к
питательным веществам видов микробов, на-

чинают размножаться менее требовательные и
быстро растущие виды, что приводит к наруше-

нию количественного соотношения видов и дез-

ориентирует врача-микробиолога при интерпре-
тации полученных результатов. Если материал
нельзя немедленно транспортировать в лабора-

торию, хранить его следует в холодильнике или

использовать транспортные среды.

Клинические образцы для культивирования

строгих анаэробов следует транспортировать в

лабораторию, максимально защищая их от воз-

действия кислорода воздуха. Используют спе-

циальные флаконы, заполненные газом, не со-

держащим кислорода. Уколом иглы через рези-

новую крышку, плотно завальцованную, во фла-
кон вносят исследуемый материал. Материал

См. с. 313.

312

можно транспортировать  п р я м о в шприце,

на кончик которого надета стерильная

пробка.

Транспортировку материала осуществляют

также в транспортных средах  ( н а п р и м е р , в смеси

лизированной крови донора 10 %, глицерина

10 %, изотонического раствора хлорида натрия

80%).

Материал для микробиологического иссле-

дования транспортируют в специальных биксах,

пеналах и т. п.

8. К клиническому образцу, направляемому

в лабораторию, прилагают сопроводительный

документ, содержащий основные сведения, необ-

ходимые для проведения микробиологического

исследования (характер материала, фамилия,

имя и отчество больного, название учреждения

или отделения, номер истории болезни, предпо-

лагаемый диагноз заболевания, предшествую-

щая антимикробная терапия, дата и время взя-

тия материала, подпись врача, направляющего

материал на  а н а л и з ) .

7.2.  П Р О В Е Д Е Н И Е  М И К Р О Б И О Л О Г И Ч Е С К О Г О  И С С Л Е Д О В А Н И Я

7.2.1. Микроскопическое

исследование мазка

Микроскопию мазка, окрашенного по Граму

или другими красителями, проводят при иссле-

довании мокроты, гноя, отделяемого из ран, сли-

зистых оболочек (мазок из зева, носа, глаза,

цервикального канала и пр.) и некоторых других

клинических образцов. Это позволяет ориенти-

ровочно судить о характере микрофлоры, ее ко-

личественном содержании и соотношении раз-

ных видов микроорганизмов в патологическом

материале. Иногда микроскопия помогает вы-

явить микроорганизмы, плохо растущие на

обычных питательных средах. На основании

данных микроскопии проводят выбор набора

питательных сред для выделения микробов,

обнаруженных в мазке.

7.2.2. Культивирование микроорганизмов

Посев исследуемого материала на питатель-

ные среды производят с целью выделения чистых

культур микроорганизмов, определения их так-

сономического положения, чувствительности к

антибактериальным препаратам. Используют

питательные среды, позволяющие выделить

наибольшее количество видов микроорганизмов:

оптимальными являются питательные среды, со-

держащие кровь животного или человека, а так-

же сахарный бульон, среды для анаэробов.

Одновременно производят посев на дифферен-

циально-диагностические и селективные среды

для выделения определенных групп микроорга-

низмов, изучения свойств культур. Посевы инку-

бируют при 35—37 °С 18—24 ч или при других

режимах, учитывают требовательность культи-

вируемых микроорганизмов к СЬ, ССЬ. Для

культивирования строгих анаэробов используют

анаэростаты.

Количественную обсемененность материала

микрофлорой устанавливают по числу колоние-

образующих единиц (КОЕ) в 1 мл или 1 мг испы-

туемого образца.

Важным этапом бактериологической диагно-

стики является получение каждого микроба в чи-

стой культуре для дальнейшего изучения. Выде-

ление чистых культур бактерий в значительной

степени определяется правильностью распреде-

ления посевного материала на плотных пита-

тельных средах. Специальный прием в виде

штрихового последовательного посева на чашку,

разделенную на 3 части, обеспечивает такое рас-

средоточение микробов, что из одной клетки в

процессе ее роста и размножения формируется

отдельная колония. Посевы культивируют при

37 °С, учитывая требовательность бактерий к

кислороду, наличию СО2 или анаэробных усло-

вий.

Выявляют некоторые особенности изменения

цвета среды, ее просветления в процессе роста

культур. Многие группы микробов образуют ха-

рактерные формы колонии, выделяют пигменты,

которые окрашивают колонии или среду вокруг

них; колонии изучают визуально, отмечая фор-

му, величину, характер края, поверхностей, кон-

систенцию. Из каждой колонии делают мазки,

окрашивают по Граму и микроскопируют в све-

товом микроскопе с иммерсией при увеличении

в 700—900 раз. Оценивают однородность клеток,

форму и размер, наличие спор или других вклю-

чений, капсулы, расположение клеток (одиноч-

ное, парное, гроздья, цепочки), отношение к ок-

раске по Граму, интенсивность и равномерность

распределения краски в клетке.

Колонии отсевают на плотные, жидкие, полу-

жидкие питательные среды, оптимальные для

культивирования определенного вида микробов.

Выделенные чистые культуры подвергают даль-

нейшему изучению в диагностических тестах,

основанных на морфологических, ферментатив-

ных, биологических свойствах и антигенных осо-

бенностях, характеризующих представителей

соответствующего семейства, рода, вида, ва-

рианта.

7.2.3. Дифференциация и идентификация

бактерий — возбудителей

гнойно-воспалительных заболеваний

Идентификация — это комплекс бактерио-

скопических и бактериологических методов изу-

чения бактерий, позволяющий определить их си-

стематическое положение в соответствии с со-

временным кодом и номенклатурой микроорга-

низмов.

Для подтверждения этиологической значи-

мости выведенных микробов при заболевании

определение рода и вида, к которому они отно-

сятся, является обязательным и должно быть

313

отражено в названии в виде биноминального

наименования, например Klebsiella pneumoniae,

Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli.

Дальнейшее подразделение на био-, серо-,

фаго-, колициноварианты позволяет маркиро-

вать выделенные штаммы, что помогает в оценке

их этиологической роли, определении идентично-

сти культур, выделенных из разных источников,

при проведении эпидемиологического обследо-

вания в лечебных учреждениях.

7.2.4. Определение чувствительности

микроорганизмов к антимикробным

препаратам

Чувствительность к антимикробным препа-

ратам изучают у культур микроорганизмов,

имеющих этиологическое значение. Определение

антибиограмм помогает лечащему врачу пра-

вильно выбрать препарат для лечения больного.

7.2.5. Серологические

методы исследования

Применяют для диагностического подтверж-

дения бактериальных инфекций в случаях невоз-

можности выделения возбудителя заболевания

или установления его этиологической роли. На-

растание титра антител в сыворотке больных не

менее чем в 3—4 раза подтверждает диагноз за-

болевания.

7.2.6. Оценка результатов

исследования

Принадлежность УПМ к естественной микро-

флоре организма человека создает ряд трудно-

стей при оценке этиологической роли. УПМ мо-

гут представлять нормальную микрофлору ис-

следуемых жидкостей и тканей или контамини-

ровать их из окружающей среды. Поэтому для

правильной интерпретации результатов иссле-

дования необходимо знать состав естественной

микрофлоры изучаемого образца. В тех случаях,

когда исследуемый материал в норме стерилен,

как, например, кровь, ликвор, экссудаты, все вы-

деленные из него микробы могут считаться воз-

будителями заболевания. В тех случаях, когда

исследуемый материал имеет собственную мик-

рофлору, как, например, фекалии, мокрота и пр.,

нужно учитывать изменения ее качественного

и количественного состава, появление несвойст-

венных данному биотопу видов микроорганиз-

мов, количественную обсемененность материала.

Так, например, при микробиологическом иссле-

довании мочи степень бактериурии (число мик-

робных клеток в 1 мл мочи), равная и выше 10

5

,

свидетельствует об инфекции мочевых путей. Бо-

лее низкая степень бактериурии встречается

у здоровых людей и является следствием загряз-

нения мочи естественной микрофлорой мочевых

путей.

Установить этиологическую роль условно-

патогенной микрофлоры помогают также нара-

стание количества и повторность выделения мик-

робов одного вида от больного в процессе забо-

левания. Существенную помощь оказывают изу-

чение патогенных свойств выделенных культур,

принадлежность их к определенным био-, серо-,

фаговариантам.

При интерпретации данных микробиологиче-

ского анализа следует учитывать клинику забо-

левания, антибактериальную терапию, предше-

ствующую исследованию. Стерильность посева

или скудность роста в изучаемых пробах может

быть следствием антибактериальной терапии,

так же как изменение микробного пейзажа в

жидкостях и тканях организма, имеющих собст-

венную микрофлору. Особое внимание при оцен-

ке результатов анализа следует обращать на

правильное взятие материала для исследования

и быстроту его транспортировки в лабораторию.

7.3.  И С С Л Е Д О В А Н И Е БИОЛОГИЧЕСКОГО  М А Т Е Р И А Л А

7.3.1. Кровь

Микробиологическое исследование крови

производят при заболеваниях, связанных с про-

никновением микроорганизмов в ток крови. В

норме кровь человека стерильна. В ток крови

микробы попадают в результате осложнения при

ряде заболеваний, при переливании крови и раз-

личных манипуляциях, когда развиваются сеп-

сис, бактериемия, бактериальный шок. Исследо-

вание крови на содержание микроорганизмов

следует проводить у больных с длительной неяс-

ной лихорадкой, особенно у людей с пониженной

иммунологической реактивностью.

Э т и о л о г и я . Септицемия и бактериемия

могут быть вызваны практически всеми микро-

организмами — патогенными и условно-пато-

генными. Среди грамположительных бактерий

наиболее частыми возбудителями сепсиса яв-

ляются Staph. aureus. Streptococcus группы D,

Str. viridans, Str. pneumoniae. Среди грамотри-

цательных преобладают Е. coli, Klebs. pneumo-

niae, Ps. aeruginosa, Bacteroides  f r a g i l i s . Из гри-

бов чаще других встречается Candida albicans.

В з я т и е  к р о в и  д л я  и с с л е д о в а -

н и я . Кровь для посева следует брать до начала

антибактериальной терапии или через опреде-

ленный промежуток времени (8—10 ч) после

введения лекарственного препарата, необходи-

мый для его выведения из организма. Если по-

сев крови производят во время антибактериаль-

ной терапии, рекомендуется добавлять в пита-

тельные среды вещества, нейтрализующие дей-

ствие лекарственных препаратов. Так, при пени-

циллинотерапии с этой целью можно использо-

вать пенициллиназу, при применении цефало-

314