Лабораторные методы исследования в клинике (Меньшиков В.В.) - часть 34

и его значение: Методические указания.— Наль-

чик, 1982.— 67 с.; Пигаревский В. Е., Ма-
зинг Ю. А. Лаб. дело, 1981, № 10, с. 579—582;

Шубин М. Г. Цитология, 1974, № 10, с. 1321 —

1322.

Л И П И Д Ы локализуются в цитоплазме кле-

ток главным образом в мембранах органелл и
обнаруживаются преимущественно в нейтро-

фильных гранулоцитах. Играют важную роль,
в проницаемости мембран. Цитохимическое ис-

следование основано на применении красящих

веществ, растворяющихся в жирах (судан  I I I ,

судан IV, черный судан и др.). Для выявления

нейтрального жира пользуются судаком  I I I , ок-
рашивающим жир в оранжевый цвет. Липоиды

выявляются лучше Суданом черным (черное ок-
рашивание).

Окраска судаком 111 (метод Гольдмана).

П р и н ц и п . Растворение жиров и окраска су-

даном  I I I в оранжевый цвет.

Р е а к т и в ы .  1 . Формалиновый спирт

(1 часть формалина и 4 части 96% спирта).

2. 70 % этиловый спирт (к 100 мл 96 % спирта
прибавить 39,18 мл дистиллированной воды).

3. сх-Нафтол. 4. Раствор Судана (к 100 мл 70 %

спирта добавляют 20 мл дистиллированной
воды, 1,2 г а-нафтола и в избытке судан  I I I .

Раствор кипятят в течение 10 мин и фильтруют).
5. Краситель Романовского — Гимзы.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е  н е

требуется.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Мазки крови фик-

сируют в формалиновом спирте в течение 1 —

3 мин. Красят в растворе Судана  I I I в течение

10 мин. Помещают в 70 % этиловый спирт на
1 мин. Докрашивают красителем Романовско-

го — Гимзы или гематоксилином в течение 5—

10 мин. Промывают дистиллированной водой.

Липиды выявляются в виде оранжевых зерен.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . В мазках

периферической крови липиды содержатся в ци-

топлазме нейтрофилов в виде обильной зернис-

тости. Большинство нейтрофилов (69—80%) у
здоровых людей красятся интенсивно (+ + +).

18—36 % дают окраску средней интенсивности

( + + ) и 10% слабо окрашены ( + ). СЦК

липидов в неитрофилах 2,65±0,033. В мазках

костного мозга в миелобластах обнаружено не-
большое содержание липидов, в промиелоцитах

их больше и по мере созревания нейтрофилов

содержание липидов увеличивается.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Повыше-

ние содержания липидов в неитрофилах наблю-

дается при острых лейкозах и обострении хрони-
ческих лейкозов. При острых лейкозах липиды

в властных клетках обнаружены у больных при

миелобластном и монобластном вариантах и не

выявлены при лимфобластном остром лейкозе.

При недифференцированном остром лейкозе
властные клетки  л и ш ь в небольшом количестве

(2,2±0,82 %) содержат липиды. Уменьшение

липидов в неитрофилах выявлено при ревматиз-

ме, воспалительных процессах.

Л и т е р а т у р а . Роскин Г. И., Левин-

сон Л. Б. Микроскопическая техника.— М.,

1957, с. 257.

ТЕСТ ВОССТАНОВЛЕНИЯ  Н И Т Р О С И Н Е -

ГО ТЕТРАЗОЛИЯ (НСТ-тест) дает возмож

ность судить о фагоцитарной и метаболической

функции гранулоцитов по образованию в цито-

плазме гранул формазана.

Метод Парка с соавт. в модификации

Ю. И. Бажоры И соавт.  П р и н ц и п . Погло-
щение гранулоцитами нитросинего тетразолия

и восстановление его в формазан, выявляемый

в виде гранул синего цвета.

Р е а к т и в ы . 1. Гепарин (20—25 ЕД/мл).

2. 0,15 М фосфатный буфер рН 7,2. 3. 0,2 % рас-
твор нитросинего тетразолия. 4. Изотонический

раствор хлорида натрия. 5. Метанол. 6. 2 % рас-

твор метилового зеленого.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .  1 .

Термостат. 2. Полистироловые пластинки (при-

меняемые для РТГА).

Х о д  о п р е д е л е н и я . В лунку пластинки

вносят 0,025 мл раствора гепарина и 0,1 мл кро-
ви, 0,05 мл фосфатного буфера и 0,05 мл рас-

твора тетразолия. Содержимое лунки перемеши-

вают с помощью пипетки. Пластинку накры-
вают фильтровальной бумагой, смоченной изо-

тоническим раствором хлорида натрия и стек-
лянной пластинкой соответствующих размеров.

Для создания влажной камеры стеклянную пла-
стинку прижимают с помощью пружинных за-

жимов. Инкубируют в термостате при 37 °С в те-
чение 15 мин, затем при комнатной температуре

в течение 15 мин. После каждого этапа инку-
бации смесь перемешивают пастеровской пипет-

кой (продувая воздух). Готовят мазки, высуши-
вают, фиксируют метанолом и докрашивают

метиловым зеленым.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь  м е т о д а . Ко-

эффициент вариации у здоровых 9,2 %, у боль-
ных — 6,6 % (не превышает допустимый).

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . У здоро-

вых гранулы формазана обнаруживают в 7,2 ±

+ 1,2% нейтрофилов.

Метод Стюарта и соавт. в модификации

Б. С. Нагоева.  П р и н ц и п см. Метод Парка.

Р е а к т и в ы . 1. Гепарин — 10 ЕД в 1 мл

0,9 % раствора хлорида натрия. 2. 0,1 % вод-

ный раствор нитросинего тетразолия. 3. 50 %
раствор формалина в 0,9 % растворе хлорида

натрия. 4. 3,4 % раствор хлорида натрия. 5. 4 %

формалиново-спиртовой раствор. 6. 0,5 % раст-
вор сафранина в 0,9 % растворе хлорида на-
трия.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .  1 .

Центрифуга. 2. Термостат или водяная баня

на 37 °С.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Смешивают 0,1  м л

крови из пальца с 0,1 мл раствора гепарина.

Добавляют 0,1 мл раствора нитросинего тетра-

золия. Инкубируют смесь на водяной бане (или

в термостате) при 37 °С в течение 10 мин.
Фиксируют смесь в растворе формалина 3  м и н .

Добавляют 3 мл дистиллированной воды на 20 с

(для лизиса эритроцитов). Добавляют 1 мл

3,4 % раствора хлорида натрия (для восста-
новления изотонии) и оставляют при комнатной
температуре на 10 мин. Центрифугируют 5 мин

при 1000 об/мин. Удаляют пастеровской пипет-
кой надосадочную жидкость, из осадка готовят

135

мазки. Фиксируют мазки в формалиново-спирто-

вом растворе 30 с и докрашивают сафранином.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы . У здоровых

людей положительный НСТ-тест выявлен в

9,34 ± 0,4 % нейтрофилов. У здоровых СЦК

составляет 13,3 ± 0,6.

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . НСТ-тест

повышен при инфекционных заболеваниях бак-

териальной этиологии, при гнойно-воспалитель-

ных процессах, злокачественных новообразова-

ниях.

Л и т е р а т у р а . Бажора Ю. И., Тимошев-

ский В. Н., Протченко П. 3., Головченко А. Н.

Лаб. дело, 1981, № 4, с. 198—200; Нагоев Б. С.,

Лаб. дело, 1983, № 8, 7—11; Park В. Н., Flr-

kig S. M., Smitwick E. M. Lancet, 1968, vol. 2,

p. 532—534; Stuart J., Gordon K, Lee T. J. Histo-

chem. Cytochem., 1975, vol. 7, p. 477.

3.5. ТРОМБОЦИТЫ

Кровяные пластинки — тромбоциты — отно-

сятся к третьей группе клеточных элементов

крови. Обладают антигенными свойствами,

основная роль их — участие в гемостазе (см.
раздел 4).

3.5.1. Подсчет количества

В практике при подсчете тромбоцитов ис-

пользуют методы, основанные на двух принци-

пах: 1) непосредственный подсчет в крови (с по-

мощью счетной камеры или счетчика) и 2) под-

счет в мазках крови на определенное количество

эритроцитов с пересчетом на 1 мкл или 1 л

с учетом общего количества эритроцитов в кро-

ви. Каждая группа методов имеет преимущества

и недостатки. Существенным преимуществом

первой группы методов является их большая

точность. Непосредственный подсчет тромбоци-

тов в крови удобен еще и потому, что не требует

для расчета сведений о количестве эритроци-

тов, но подсчет в камере более трудоемкий,

поскольку тромбоциты в нативном виде пред-

ставлены мелкими и плохо контрастированными

элементами. Недостатком этих методов является

необходимость подсчета тромбоцитов в ближай-

шие часы после взятия крови. Подсчет тромбо-

цитов в мазках крови значительно уступает по

своей точности методам непосредственного под-

счета в камере или с помощью счетчиков и

автоматов. Ошибки при подсчете в мазках крови

могут быть обусловлены несколькими причина-

ми: плохое качество мазка и связанное с этим

неравномерное распределение тромбоцитов, не-

точный подсчет эритроцитов в крови. Суще-

ственное неудобство метода — необходимость

одновременного подсчета тромбоцитов и эритро-

цитов в крови. Преимущество его — возможность

подсчета тромбоцитов в любое время независимо

от момента взятия крови. В качестве унифици-

рованных утверждены два метода, основанных

на обоих  п р и н ц и п а х .

Унифицированный метод подсчета в камере

(1972).  П р и н ц и п . Подсчет тромбоцитов в

1 мкл (или 1 л) с учетом разведения крови

и объема квадрата счетной сетки с примене-

нием фазово-контрастного устройства для

контрастирования тромбоцитов.

Р е а к т и в ы . Применяют реактив 1 или 2.

1. Кокаина гидрохлорид — 3 г, натрия хло-

рид — 0,25 г, фурацилин — 0,025 г, дистилли-

136

рованная вода — 100 мл. 2. 1 % раствор окса-

лата аммония. Раствор кипятят и фильтруют.

Хранят в холодильнике. Сравнительный анализ

разных разводящих жидкостей позволил счи-

тать лучшим 1 % раствор оксалата аммония,

так как он дает быстрый и полный лизис

эритроцитов.

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .  I .

Микроскоп. 2. Фазово-контрастное устройство.

3. Счетная камера Горяева. 4. Осветитель к

микроскопу (ОИ-7, ОИ- 18).

Х о д  о п р е д е л е н и я . Разводят исследуе-

мую кровь в 200 раз; для этого в сухую пробирку

набирают 4 мл реактива 1 или 2 и 0,02 мл

крови. Перемешивают и оставляют на 25 —

30 мин для гемолиза эритроцитов. Подготавли-

вают счетную камеру (см. подсчет лейкоцитов).

Перемешивают разведенную кровь и заполняют

камеру; подносят каплю ее с помощью стеклян-

ной палочки или пастеровской пипетки к краю

покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь

равномерно без пузырьков воздуха заполняла

всю поверхность сетки, не затекая в бороздки.

Помещают счетную камеру во влажную камеру

на 5 мин для оседания тромбоцитов (чашка

Петри с уложенной по краям смоченной водой

фильтровальной бумагой). Подготавливают

фазово-контрастное устройство в соответствии

с инструкцией, приложенной к нему. Произво-

дят подсчет тромбоцитов в 25 больших квадра-

тах.

Тромбоциты выглядят в счетной камере в

виде мелких, хорошо преломляющих свет

образований.

Расчет числа тромбоцитов проводят, исходя

из разведения крови (200), числа сосчитанных

квадратов (25) и объема одного большого ква-

X — число тромбоцитов в 1 мкл крови; а —

число тромбоцитов, сосчитанных в 25 больших

квадратах.

Практически число сосчитанных тромбоци-

тов умножают на 2000.

В о с п р о и з в о д и м о с т ь .  П о данным

Т. А. Одесской и соавт., ошибка метода состав-

ляет 6,5 %.

Унифицированный метод подсчета в мазках

крови (по Фонио).  П р и н ц и п . Метод основан

на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных

мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом

на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания

в этом объеме количества эритроцитов.

Р е а к т и в ы . Применяют реактив 1 или 2.

14 % раствор сульфата магния. 2. 6 % раствор

этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА).

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .  Н е

требуется.

Х о д  о п р е д е л е н и я . Смешивают кровь

с реактивом 1 или 2, для этого взятый капил-

ляром Панченкова реактив до метки «75» вно-

сят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую

тем же капилляром, до метки «О». Содержимое

пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки.

Фиксируют и окрашивают по Романовскому —

Гимзе (см. 3.3.2) в течение 2—3 ч (при исполь-

зовании реактива 1) и в течение 30—45 мин

(при использовании реактива 2).

Высохшие мазки микроскопируют с иммер-

сионным объективом, подсчитывая количество

тромбоцитов в тонких местах препарата (эри-

троциты должны быть расположены изолиро-

ванно) . Тромбоциты в мазках выглядят в виде

фиолетовых округлых образований размером

2—4 мкм с отчетливо видимой центрально рас-

положенной зернистой частью — грануломером

и более светлой периферической незернистой

зоной — гиаломером.

Подсчет производят следующим образом: в

каждом поле зрения микроскопа считают число

эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок

до тех пор, пока не будут просчитаны 1000

эритроцитов. Для удобства счета и большей

точности следует пользоваться специальным

окуляром с уменьшенным полем зрения; при

отсутствии окуляра можно уменьшить поле

зрения простым приемом (см. 3.3.6.).

Р а с ч е т : количество тромбоцитов на 1000

эритроцитов составляет А°/оо. Зная число эри-

троцитов в 1 мкл (в 1 л) крови, легко подсчи-

тать количество тромбоцитов в 1 мкл крови

(в

 1 л).

Например. А = 60%о; число эритроцитов

5000000 в 1 мкл (5 • 10

6

/мкл или 5 • 10

| 2

/л).

Составляют пропорцию:

60— 1000;

X — 5 000 000, откуда

= 300 • 1000 мкл (300 • 10

3

/мкл или 300 • 10

9

/л).

Подсчет в автоматическом счетчике. Исполь-

зование счетчиков и автоматов существенно

облегчает подсчет тромбоцитов в крови, повы-

шает точность и ускоряет процедуру подсчета.

Для автоматического подсчета количества

тромбоцитов приспособлены отечественный ге-

матологический комплекс КГ-2 и различные

зарубежные счетчики: «Пикоскель» PS-4 фирмы

«Medicor» (ВНР), «Coulter» 431A фирмы

«LJC — Instrument» (Швеция), «Tromboco-

unter С» фирмы «Coultronics France SA» (Фран-

ция), автомат «Hemalog-8» фирмы «Technicon»

(США) и др.

Принцип работы большинства счетчиков

основан на кондукторометрическом методе

(см. 3.3.1.).

С п е ц и а л ь н о е  о б о р у д о в а н и е .

Счетчик для тромбоцитов.

Х о д  и с с л е д о в а н и я соответствует ин-

струкции, приложенной к прибору.

Н о р м а л ь н ы е  в е л и ч и н ы .  П о данным

В. В. Соколова и И. А. Грибовой, количество

тромбоцитов у здоровых людей составляет.

180 • 10

 6

 — 320 • 10

6

/мкл (или 180  - 1 0

 9

-

320 • 10

9

/л).

К л и н и ч е с к о е  з н а ч е н и е . Снижение

количества тромбоцитов в крови — тромбоцито-

пения — является важным симптомом при не-

которых формах геморрагического диатеза.

Наиболее выраженная тромбоцитопения (50 X

X 10

3

/мкл и ниже) наблюдается при обостре-

нии тромбоцитопенической пурпуры. Тромбоци-

топения обычно сопутствует острым лейкозам

в развернутой стадии и особенно терминальной

стадии хронических лейкозов. Умеренная тромбоци-

топения (100 • 10

3

/мкл и более) наблюдается

при коллагенозах, циррозах печени. Повышение

количества тромбоцитов в крови — тромбо-

цитоз — характерно для миелопролифератив-

ных заболеваний, наблюдается при злокаче-

ственных новообразованиях. Высокий тромбоци-

тоз (1000 • 10

3

/мкл и более) может быть у

больных после спленэктомии.

Л и т е р а т у р а . Одесская Г. А., Шитико-

ва А. С., Папаян Л. П. Лаб. дело, 1970, № 2,

с. 78—79; Соколов В. В., Грибова И. А. Гемато-

логические показатели здорового человека.—

М.: Медицина, 1972.— 104 с.; Feissly R., Lu-

din H. Rev. Hemat., 1949, vol. 4, p. 481; Fonio A.

Dtsch. Ztschr. Chir., 1912, Bd. 117, S. 176.

3.5.2. Исследование функций

тромбоцитов

В клинической практике наиболее распро-

странены исследования агрегационных, адгезив-

ных и других свойств тромбоцитов (см. раз-

дел 4).

137

3.6.  И З М Е Н Е Н И Я КРОВИ ПРИ ЛЕЙКОЗАХ

Исследование крови имеет особоенно важное

диагностическое значение при гемобластозах.

Поэтому во всех случаях, когда клинически

возникает подозрение на лейкоз (слабость, лихо-

радка неясного генеза, геморрагический синд-

ром, увеличение печени, селезенки, лимфати-
ческих узлов, кожные поражения и др.), необ-

ходим общий клинический анализ крови.

Показатели красной крови. Появление ане-

мии — ранний лабораторный симптом острых

лейкозов. При этом анемия чаще нормохромно-

го типа. При  н а л и ч и и кровопотерь развивается

гипохромная микроцитарная анемия. При хро-

нических лейкозах анемия обычно развивается

уже в стадии развернутых клинико-гематологи-

ческих проявлений, а в начале заболевания

показатели красной крови обычно не изменены.

Исключение составляют лейкозы миелопролифе-

ративной природы, особенно эритремия, при

которой  р а н н и м и и основными лабораторными

симптомами являются эритроцитоз, повышение

содержания гемоглобина и гематокрита в крови.

Умеренный эритроцитоз может быть в начале

доброкачественного сублейкемического миелоза

(миелофиброза), который затем снижается до

нормальных цифр, а в дальнейшем, к терми-

нальной стадии, сменяется анемизацией.

При лимфопролиферативных заболеваниях

в начальной стадии показатели красной крови

нормальны, по мере прогрессирования процесса

развивается анемия. Малокровие обычно бывает

нормохромного, нормоцитарного или макроци-

тарного типа, с небольшим повышением числа

ретикулоцитов, иногда умеренным нормобласто-

зом. Следует иметь в виду возможность разви-

тия при хронических лейкозах, особенно при

хроническом лимфолейкозе, аутоиммунной гемо-

литической анемии. В этих случаях выявляется

анемия нормохромного типа с высоким содержа-

нием ретикулоцитов в крови, нередко появле-

нием нормобластов в мазках периферической

крови.

Лейкоциты и лейкоцитарная формула. Общее

количество лейкоцитов в крови резко изменяет-

ся при лейкозах. Особенно выраженные измене-

ния в виде гиперлейкоцитоза (100-10

3

/мкл,

или 100-10

9

 /л и выше) наблюдаются при

хроническом миелолейкозе, хроническом лимфо-

лейкозе. Умеренный лейкоцитоз (до 15 • 10

 9

 -

2 0 - 10

9

/л) может быть при эритремии, хро-

ническом моноцитарном лейкозе, сублейкеми-

ческом миелозе. В последнем случае может

наблюдаться и лейкопения. При парапротеине-

мических гемобластозах чаще развивается

лейкопения, но может быть и нормальное число

лейкоцитов в крови. Изменения числа лейкоци-

тов при острых лейкозах непостоянны; наряду

с нормальным количеством может наблюдаться

лейкопения и умеренный лейкоцитоз. Наиболь-

шее значение в лабораторной диагностике

лейкозов имеет исследование лейкоцитарной

формулы (табл. 26). Важнейший признак острых

лейкозов появление в мазках крови властных

клеток — бластемия. Количество властных

клеток может варьировать от единичных (5—

10%) до значительного числа (70—80%).

Соответственно резко сокращается число зрелых

гранулоцитов. Количество незрелых грануло-

цитов чаще небольшое или они вовсе отсут-

ствуют. К последним случаям применим термин

« h i a t u s leukemicus».

Значительно реже встречаются так называе-

мые алейкемические формы (стадии) острых

лейкозов, когда в периферической крови бласт-

ные клетки отсутствуют. Диагноз в этих случаях

может быть установлен после исследования

пунктата костного мозга (см. 3.7).

Помимо количественных сдвигов лейкоци-

тарной формулы, важное диагностическое зна-

чение имеет изменение морфологических особен-

ностей клеток. Так, при острых лейкозах власт-

ные клетки могут иметь неправильную форму.

Отличаются полиморфным ядром, с укрупнен-

ными нуклеолами, включениями в цитоплазме.

При разных формах острых лейкозов морфо-

логия властных клеток различна. При остром

миелобластном и миеломонобластном лейкозе

ядра клеток круглые, иногда неправильной

формы, в цитоплазме содержат азурофильную

зернистость и нередко тельца Ауэра. При остром

промиелоцитарном лейкозе отмечается выра-

женный полиморфизм властных клеток, ха-

рактерна крупная фиолетовая зернистость,

обильно заполняющая цитоплазму клеток, часто

встречаются тельца Ауэра.

При остром монобластном лейкозе властные

клетки крупные с бобовидным ядром и скудной

мелкой зернистостью в цитоплазме. При остром

лимфобластном лейкозе бласты меньших разме-

ров, ядро округлое с 1—2 нуклеолами, цито-

плазма обычно не содержит зернистости. Мор-

фологические черты властных клеток не всегда

надежны для дифференциации различных форм

острых лейкозов. С этой целью обычно проводят

цитохимические исследования. Для практиче-

ских целей может быть достаточным небольшой

набор цитохимических реакций (PAS — ре-

акция, исследование активности пероксидазы,

неспецифических эстераз). В табл. 27 приведены

результаты исследования властных клеток при

наиболее часто встречающихся формах острых

лейкозов.

Для хронических лейкозов миелопролифе-

ративной природы характерно наличие большо-

го числа гранулоцитов (до 80—90 %) в мазках

крови при уменьшении лимфоцитарных и моно-

цитарных элементов. При хроническом миело-

лейкозе в лейкоцитарной формуле находят все

переходные формы от властных клеток до зрелых

нейтрофилов. Часто отмечают увеличение числа

эозинофилов и базофилов. В развернутой клини-

ко-гематологической стадии хронического мие-

лолейкоза обнаруживают следующую лейко-

цитарную формулу: миелобласты 1—3 %, про-

миелоциты 3—8 %, нейтрофильные миелоциты

5—10 %, нейтрофильные метамиелоциты 10—

15 %, нейтрофильные палочкоядерные 12—
15 %, нейтрофильные сегментоядерные 25—

138