ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ БЕЛКОВ ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПААГ

Аппаратура, сцинтилляторы, различные методы счета радио-
активности белков, а также способы оценки эффективности этих
методов требуют отдельного подробного рассмотрения. Ниже в
очень сжатом виде будут описаны только некоторые приемы
оценки радиоактивности белков после их электрофореза в
ПААГ.

Счет радиоактивности в элюатах белка

Все перечисленные в предыдущем разделе способы элюции
белков из геля позволяют оценивать их радиоактивность с по-
мощью приемов счета радиоактивности в растворах. Следует
помнить, что элюция белка из геля никогда не бывает полной,
поэтому количественная оценка содержания белка в полосе геля
при таком подходе носит более или менее приближенный харак-
тер. Кроме того, элюция связана со значительным разбавлением
белкового раствора.

Один из специфических вариантов счета радиоактивности
элюата из геля после электрофореза белков в комплексе с
ДДС-Na отработан именно для концентрирования белкового
препарата. В нем используется способность комплекса белок—
ДДС-Na при пониженной температуре и обработке 10%-ным рас-
твором ТХУ образовывать мицеллы, которые сорбируются на
нитроцеллюлозных фильтрах типа «Millipore НА». К элюату бел-
ка в 1%-ном растворе ДДС-Na с 6 М мочевиной добавляют в
качестве носителя бычий сывороточный альбумин до концентра-
ции 0,25 мкг/мл, а затем 2 объема 15%-ного раствора ТХУ.
Смесь хорошо встряхивают и оставляют на 15 мин во льду. Пос-
ле этого ее можно фильтровать и промывать на фильтре 5%-ным
раствором ТХУ. Счет радиоактивности ведут на фильтрах. Ис-
пользование фильтра типа «Millipore» здесь обязательно, так как
в присутствии ДДС-Na ТХУ не дает обычного осадка белка, а
на бумажных или стекловолокнистых фильтрах мицеллы комп-
лексов белок—ДДС-Na не задерживаются [Buisson et al., 1976].

Для качественного определения радиоактивности ¹⁴С и ¹²⁵I
белковые полосы и пятна (при толщине геля не более 1,5 мм)
можно вырезать и просто высушить на поверхности любого из
стекловолокнистых фильтров типа «Whatman GF» или даже на
бумажном фильтре «Whatman N 1». Сушить достаточно 30 мин
при 50° или 2 ч при комнатной температуре. Счет радиоактивно-
сти ведут в толуоловом сцинтилляторе [Leinen, Wittliff, 1978].

 

109

Другой вариант с использованием фильтров типа GF/C вклю-
чает диффузию нефиксированных комплексов белок—ДДС-Na
из кусочков геля толщиной 0,7 мм в фильтры, смоченные
10%-ным раствором NH₄OH. Диффузия идет в течение суток при
комнатной температуре в атмосфере аммиака. Затем фильтры
.сушат и просчитывают в толуоловом сцинтилляторе. Как и всег-
да при диффузии, полнота выхода белков зависит от их молеку-
лярной массы и пористости геля [Helliner, Wunner, 1971].

Растворение ПААГ

Полноту счета радиоактивности белка можно обеспечить
растворением геля. Обычный ПААГ можно растворить при по-
вышенной температуре в 30%-ном растворе перекиси водорода.
Если белки мечены ¹⁴С, то к раствору Н₂О₂ следует добавить
NH40H ,до концентрации 1%, чтобы улавливать радиоактивный
¹⁴СО₂. Проще всего кусочек геля с белком растворять именно в
такой смеси при 65° в течение 4—6 ч и далее просчитывать ра-
диоактивность в сцинтилляторе на основе диоксана. Однако
эффективность счета в диоксановом сцинтилляторе ниже, а воз-
можность артефактов — тушения и хемолюминесценции — вы-
ше, чем в толуоловом сцинтилляторе, поэтому после описанного
растворения геля в Н₂О₂ с NH₄OH иногда предпочитают исполь-
зовать один из фирменных «солюбилизаторов» и считать радио-
активность в сцинтилляторе на основе толуола [Goodman, Mat-
zura, 1971 ]. Хорошие результаты дает растворение ПААГ в
30%-ной Н₂О₂ с 5% NH40H (37°, 6 ч) в комбинации со сцинтил-
лятором на основе ксилола, выпускаемым фирмой NEN под наз-
ванием «Aquasol». Для подавления хемолюминесценции щелоч-
ного раствора в сцинтиллятор добавляют около 0,01 объема ле-
дяной уксусной кислоты.

Растворять ПААГ или хотя бы белок внутри него можно и
без перекиси водорода, с помощью некоторых фирменных солю-
билизаторов. Так, «Soluene» фирмы «Packard» растворяет ПААГ
в результате энергичного встряхивания в течение суток при 60—
65°. В солюбилизаторе NCS фирмы «Nuclear Chicago» при ана-
логичной обработке гель сильно набухает, белок растворяется и
выходит в сцинтиллятор [Paus, 1971]. Фирма NEN («New Eng-
land Nuclear») рекомендует для обработки ПААГ использовать
3%-ный раствор солюбилизатора «Protosol» в сцинтилляцион-
ной смеси под названием «Econofluor». За ночь при 37° гель на-
бухает, и около 80% белка переходит в сцинтиллятор. Наконец,
недавно был предложен специальный «коктейль», содержащий
6 г ППО, 10 мг NCS и 10 мл «Hyamine 10X hydroxide» в 1 л то-
луола. По утверждению автора, за 24 ч при комнатной темпера-
туре в эту смесь из ПААГ выходит до 95% белка [Aloyo, 1979].

Тщательное сопоставление всех перечисленных выше мето-
дов для счета тритиевых препаратов после электрофореза в
ПААГ было недавно проведено Муром [Moore, 1980]. Наилуч-

 

110

шие результаты, по данным автора, дает обработка' предвари-
тельно растертого геля в течение ночи при комнатной темпе-
ратуре 1%-ным раствором солюбилизатора «Soluene 350» в то-
луоле, содержащим 0,5% ППО и 0,05% вторичного сцинтиллято-
ра MSB фирмы «Packard». Для ускорения процесса можно
предварительно солюбилизировать кусочек геля в 0,5 мл «Solue-
ne 350» при 50° в течение 3 ч, а затем добавить 10 мл того же
толуолового сцинтиллятора. Эффективность счета трития состав-
ляет около 60%, а выход достигает 90—95%.

Полное растворение геля легко осуществить в том случае,
когда при полимеризации вместо метиленбисакриламида гель
сшивают более лабильным бифункциональным агентом. В гла-
ве 1 уже был назван в этом качестве NN^/-диaллилтapтapдиaмид
(ДАТД) и указаны условия растворения сшитого им геля в
йодной кислоте [Anderson, McClure, 1973]. В другом варианте
растворимого геля используют NN^/-(l,2-диoкcиэтилeн)-биcaкpи-
ламид (ДОЭБА), который легко синтезировать из акриламида и
глиоксаля. Гель, сшитый ДОЭБА, растворяется в 0,025 М НЮ4
при 50° в течение 48 ч. Авторы работы [O'Connel, Brady, 1976]
утверждают, что гели, сшитые ДОЭБА, отличаются более вос-
производимыми характеристиками, чем при использовании
ДАТД. Описан также растворимый ПААГ, сшитый бисакрилил-
цистамином, который готовят из цистамина и акрилилхлорида
[Hansen, 1976]. Этот гель растворяется в b-меркаптоэтаноле за
2—3 мин. В приготовлении таких гелей имеется целый ряд тон-
костей, которые необходимо учитывать во избежание образова-
ния дополнительных, устойчивых к воздействию (3-меркаптоэта-
нола сшивок [Hansen et al., 1980]. NN^/-Бисакрилилцистамин в
настоящее время выпускается фирмой, так же как ДАТД и
ДОЭБА.

Несмотря на свою кажущуюся привлекательность раствори-
мые ПААГ не получили широкого распространения — скорее
всего; ввиду худшей воспроизводимости их характеристик. Очень
легко — простым нагреванием — расплавляются гели агарозы,
но их применяют в основном для электрофореза нуклеиновых
кислот, поэтому рассмотрение этого вопроса имеет смысл отло-
жить до следующей главы.

Импрегнирование сцинтиллятора в гель

Возможен и обратный подход к решению проблемы счета ра-
диоактивности белка после электрофореза — вместо элюции бел-
ка можно попытаться импрегнировать сцинтиллятор в кусочек
геля, заменив им водное окружение радиоактивного белка и со-
хранив при этом прозрачность геля. Такая попытка реальна.
В одном из описанных вариантов ПААГ дегидратируют в абсо-
лютном этаноле, потом этанол заменяют на толуол, а его—на
толуол-тритоновый сцинтиллятор [Gezelins, 1977]. По-видимому,
лучше начинать с замены воды в геле на диметилсульфоксид.

 

111

При этом гель не будет съеживаться и терять прозрачности как
это происходит при вымачивании его в этаноле.

Во всех случаях, когда обработке геля предшествует его раз-
резание, следует стремиться к тому, чтобы в одном кусочке геля
была вырезана целая полоса или все белковое пятно. Широко
распространенная практика разрезания цилиндрика геля на оди-
наковые диски толщиной 1—1,5 мм неудачна, так как разрез
«вслепую» может попасть на середину полосы. В результате это-
го радиоактивность, содержащаяся в полосе, будет просчитана в
двойном объеме геля, что даст ложную картину вдвое более ши-
рокого и низкого пика радиоактивности на электрофореграмме.

Разумеется, для того чтобы правильно вырезать белковую
полосу, ее надо окрасить, а это трудно сделать при малой кон-
центрации белка в полосе, что нередко имеет место при фрак-
ционировании радиоактивно меченных белков. Однако разработ-
ка новых высокочувствительных методов окрашивания белков,
например серебром, поможет решить эту проблему.

Авторадиография

Регистрацию полос радиоактивных белков в пластине геля
можно осуществить методом авторадиографии. На гель наклады-
вают рентгеновскую пленку и экспонируют ее в течение длитель-
ного времени в темноте, обычно при комнатной температуре.
Экспозицию ведут в кассете, где пленка прижимается к гелю
пружинами через резиновую прокладку. В зависимости от уров-
ня радиоактивности белков экспозиция может длиться от не-
скольких часов до многих дней. Затем пленку проявляют обыч-
ными проявителями, предназначенными для получения макси-
мально контрастного изображения. Под действием b-излучения
участки пленки, лежавшие над белковыми полосами и пятнами,
чернеют. Авторадиографию имеет смысл проводить только в тех
случаях, когда белки мечены радиоактивным углеродом или
йодом. Энергия излучения трития слишком мала, чтобы испус-
каемые им b-частицы смогли преодолеть воздушный промежуток
между гелем и пленкой, да и просто вылететь из пластины, ввиду
их сильного поглощения в геле.

Потеря энергии b-частиц в геле достаточно велика и в слу-
чае использования радиоактивного углерода, поэтому перед
авторадиографией гель высушивают. Кстати, толщина высушен-
ного геля будет тем меньше, чем меньше содержание в нем ме-
тиленбисакриламида. Для высушивания гель переносят на
фильтровальную бумагу («Whatman 3MM»), под нее подклады-
вают пористую прокладку и перфорированную металлическую
пластинку. Все это помещают в полиэтиленовый мешок и при-
соединяют к вакуумному насосу. При подогревании в горячей
воде или под лампой гель высыхает за 1—2 ч, образуя тонкую
прочную пленку на поверхности фильтровальной бумаги. Есть
множество фирменных устройств для сушки гелей. В них пласти-

 

112

ну геля обычно кладут на подключенную к вакуум-насосу по-
ристую основу и накрывают листом тонкой резины, которую при-
сасывает вакуумом. Во избежание прилипания резины к гелю
под нее можно положить тонкую пленку. Несмотря на высуши-
вание, регистрация р-частиц углерода из глубинных слоев не-
возможна для гелей с исходной толщиной более 0,4 мм.

Для авторадиографии следует использовать неэкранирован-
ную рентгеновскую пленку типа «Kodak No Screen X-Ray Film»,
например: NS-5T (США) или РТ-1 и РТ-2 (СССР). Фирма
LKB (Швеция) рекламирует пленку, пригодную для авторадио-
графии препаратов, меченных тритием, под названием «LKB-
Ultrafilm». Суть дела здесь не в повышении чувствительности,
а в отсутствии защитного слоя над фотографической эмульсией.
Это облегчает проникновение в нее «слабых» b-электронов три-
тия, но затрудняет последующую обработку пленки. Чувстви-
тельность метода авторадиографии для регистрации ¹⁴С можно
оценить из следующих ориентировочных данных. Радиоактив-
ность порядка 25000 распадов в минуту, равномерно распреде-
ленная по площади 1 см², надежно регистрируется за 24 ч экспо-
зиции.

Для регистрации g-излучения ¹²⁵I удобно применять способ
«непрямой» авторадиографии. g-Излучение регистрируется рент-
геновской пленкой, но большая его часть пронизывает ее и те-
ряется, поэтому позади пленки устанавливают так называемый
«интенсифицирующий экран», покрытый твердым сцинтиллято-
ром (CaVO₄). Под действием g-излучения экран флюоресцирует,
а свет этой флюоресценции регистрируется пленкой. Разрешение
и резкость полос при этом несколько ухудшаются, поскольку
экран удален от геля на толщину пленки, а не все g-частицы вы-
летают из геля перпендикулярно его поверхности, зато выигрыш
в чувствительности получается значительный.

Для непрямой авторадиографии следует использовать экра-
нированные рентгеновские пленки, например: «Kodak X-Omat R»
и «Kodak RP-50» (США) или РМ-1 (СССР). Интенсифицирую-
щие экраны выпускают, в частности, фирма «Du Font» (США)
под названием «Lightning Plus Intensifying Screen» и химфарм-
завод им. Семашко под маркой ЭУ-ВЗ.

Для повышения чувствительности пленки ее иногда предва-
рительно засвечивают до плотности потемнения (после проявле-
ния), соответствующей A₅₄₀=0,2—0,3. Объяснение этого стран-
ного на первый взгляд феномена можно найти в работе [Laskey,
Mills, 1975].

Флюорография

Для регистрации положения в геле белков, меченных три-
тием, применяют метод флюорографии. Смысл его в том, чтобы
ввести сцинтиллятор внутрь геля таким образом, чтобы он нахо-
дился в непосредственном контакте с радиоактивными белками
в полосах. Свечение сцинтиллятора внутри геля легко выходит

 

113

из него наружу и регистрируется наложенной на гель рентгенов-
ской пленкой того же типа, который используют при непрямой
авторадиографии. По существу говоря, такой подход уже был
рассмотрен выше, но тогда не стояла задача сохранения геомет-
рических размеров целой пластины геля, чего трудно добиться
при импрегнировании в гель жидкого сцинтиллятора.

Повсеместное распространение для флюорографии гелей по-
лучила процедура, предложенная в 1974 г. Боннером и Ласки.
Сначала воду в геле замещают на диметилсульфоксид (ДМСО),
вымачивая пластину после фиксации в ней белков в течение 1 ч
в двух сменах по 20 объемов ДМСО (по отношению к объему
геля). Надо помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через
кожу, поэтому работать следует в перчатках. Затем гель перено-
сят на 3 ч в 4 объема 22%-ного (масса/объем) раствора ППО в
ДМСО; за это время ППО входит в гель. ДМСО не является
сцинтилляционным растворителем, поэтому его необходимо
убрать, но так, чтобы ППО остался в геле. Высушить ДМСО не
удается, и приходится прибегать к следующему приему. Гель
переносят в воду и вымачивают в ней около 1 ч. ППО в воде не-
растворим и немедленно выпадает в осадок. Гель становится
белым, непрозрачным и заметно твердеет, зато ДМСО снова за-
мещается на воду, которую затем нетрудно высушить, как было
описано выше. На фильтровальной бумаге после высушивания
остается жесткая белая пленка. Хотя она на вид и непрозрачна,
но вспышки сцинтилляций внутри нее (в местах контакта ППО
с радиоактивными белками) дают достаточно света, чтобы быть
зарегистрированными рентгеновской пленкой. В результате до-
статочно продолжительного экспонирования на пленке появляет-
ся картина расположения радиоактивных полос или пятен в геле
[Bonner, Laskey, 1974]. Засвечивание пленки для повышения ее
чувствительности производят и в этом случае. Экспонирование
пленки следует вести при температуре сухого льда, поскольку
при более высокой, пусть даже и отрицательной температуре
резко снижается чувствительность метода.

Гели с низким содержанием акриламида, например смешан-
ные гели из 2%-ного ПААГ и агарозы, могут растворяться в
ДМСО. Для них в аналогичной процедуре следует заменить
ДМСО на метанол (10%-ный раствор ППО в метаноле). Для
более концентрированных гелей метанол непригоден — гели в
нем сжимаются.

Концентрированные и сильно сшитые гели часто трескаются
при сушке обычным способом. Вакуум к гелю обычно подается
только с одной стороны через сетку и фильтровальную бумагу.
К противоположной стороне геля во время сушки плотно приле-
гает полиэтиленовая пленка или тонкая резина. Это приводит к
тому, что со стороны бумаги гель затвердевает раньше («стек-
ленеет»), а на противоположной его поверхности остается влага,
которая может быть отсосана только через трещинки в геле. Во
избежание этого дефекта было предложено между свободной по-

 

114

верхностью геля и пленкой или резиной прокладывать слой по-
ристого полиэтилена, через который вакуум подается и к этой
поверхности геля [Joshi, Haenni, 1980].

Недавно было указано на возможность замены ППО в каче-
стве сцинтиллятора на салицилат натрия [Chamberlain, 1979].
Для него максимум флюоресценции лежит вблизи 410 нм, что
вполне приемлемо для экранированной рентгеновской пленки.
Главное же преимущество этого реагента — в его водораствори-
мости. Автор работы предлагает просто вымачивать гель в
10 объемах 1 М водного раствора салицилата натрия в течение
30 мин при комнатной температуре, а затем сушить и флюоро-
графировать, как обычно. Нагревать гель во время высушивания
следует не выше, чем до 80°, во избежание возгонки салициловой
кислоты. Раствор салицилата можно хранить в течение 1—2 не-
дель. Потом он коричневеет (по-видимому, окисляется).

После флюорографии для количественных определений ра-
диоактивности полосы из высушенного геля можно вырезать,
дать им снова набухнуть в минимальном количестве воды и да-
лее растворять с помощью солюбилизаторов. При оценке эффек-
гивности счета в жидком сцинтилляторе можно пользоваться
только методом внутренней стандартизации.

Для правильного совмещения изображения на рентгеновской
пленке с гелем, без чего из него нельзя вырезать нужные для
счета участки, как и при авторадиографии, пользуются реперны-
ми отметками по углам пластины геля. Эти отметки делают ра-
диоактивными чернилами. С этой целью можно использовать
любые не диффундирующие в геле чернила с примесью плохо
растворимого, достаточно активного меченого препарата. Впро-
чем, забота об отсутствии диффузии чернил относится к случаю
авторадиографии влажных гелей, например при регистрации ра-
диоактивного фосфора. Для высушенных гелей это не так суще-
ственно.

Комбинацией авторадиографии и флюорографии можно ре-
гистрировать в геле двойную метку ³Н и ¹⁴С (например, сопо-
ставлять составы двух белковых смесей). В белки одной смеси
вводят радиоактивную метку по ³Н, в белки второй — по ¹⁴С. Обе
смеси объединяют и разделяют двумерным электрофорезом.
Пластину геля импрегнируют сцинтиллятором, высушивают и
регистрируют флюорографией на пленку «Kodak IR-5» сцинтил-
ляцию от обеих белковых смесей (³H+¹⁴С). С негатива делают
контактный отпечаток, так что все пятна радиоактивности ока-
зываются белыми. Затем с того же геля на неэкранированную
пленку «Kodak NS-5T» при комнатной температуре регистрируют
авторадиографией только ¹⁴С. К свету сцинтилляций эта пленка
нечувствительна. Накладывают вторую пленку на позитив с
первой. Не закрытые черным белые пятна указывают местона-
хождение белков, меченных только тритием, т. е. входящих в
состав только одной из двух смесей. Затем изотопные метки двух
белковых смесей можно поменять местами [McConkey, 1979].

 

115

Авторадиографией и флюорографией можно пользоваться не
только для пластин, но и для цилиндрических гелей. Для этой
цели из цилиндрика геля надо в продольном направлении выре-
зать плоский слой толщиной 0,5—1,5 мм. Описано простое приспо-
собление, облегчающее эту операцию [Watts et al., 1977].

Флюорографию нитроцеллюлозных фильтров с перенесенны-
ми на их «репликами» белков из геля осуществляют очень про-
сто. Фильтр погружают в 10%-ный раствор ППО в эфире, высу-
шивают и регистрируют сцинтилляцию на рентгеновскую плен-
ку, как это было описано для высушенного геля. Флюорография
и авторадиография нитроцеллюлозных фильтров осуществляется
лучше, чем в случае гелей, так как белки концентрируются на
поверхности фильтров.