ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТРИТОНА Х-100 И ЦЕТАВЛОНА

Тритон Х-100

Многие белки, например: рибосомальные и мембранные, пло-
хо растворимы в водных буферах. Добавление Тритона Х-100 за-
частую улучшает их растворимость и, .к тому же, в отличие от
мочевины, не влечет за собой их денатурации. Сохраняются
вторичная и третичная структура белков, а в ряде случаев и их
биологическая активность.

Авторы одной из работ [Hearing et al., 1976] растворяли бел-
ки до концентрации 1 мг/мл в течение нескольких часов в
1%-ном растворе Тритона Х-100. Затем этот раствор смешивали
с равным объемом 20%-ной сахарозы в верхнем электродном
буфере удвоенной концентрации и в таком виде наносили на
формирующий гель в трубке. Тритон Х-100, связавшись с бел-
ком, может мигрировать вместе с ним, сохраняя растворимость
белка, однако разделение полос оказывается более надежным,
если 0,1% Тритона Х-100 вводят в гель. Правда, при фиксиро-
вании белков ТХУ Тритон Х-100 дает опалесцирующий фон, ко-
торый приходится дольше отмывать.

Образование комплексов с Тритоном Х-100 можно использо-
вать не только для растворения, но и для фракционирования
белков. Характер комплекса и количество связавшегося с бел-
ком детергента зависят от протяженности гидрофобного участ-
ка на поверхности белковой глобулы. Некоторые белки могут
связывать по нескольку десятков молекул Тритона Х-100 на мо-
лекулу (родопсин—до 70). Это дает прирост эффективной мо-
лекулярной массы в тысячи, а иногда и в десятки тысяч дальтон
(молекулярная масса Тритона Х-100 равна 632). Такой прирост
легко обнаружить электрофорезом в мелкопористом геле.

В работе Фернандеса и соавторов [Fernandes et al., 1978] бел-
ки из бактериальной мембраны экстрагировали до концентра-
ции 4 мг/мл 5%-ной уксусной кислотой с 4 М мочевиной и 5%
(b-мсркаптоэтанолом. Иногда уже при экстракции добавляли
Тритон Х-100 до концентрации 2%, что улучшало выход белков
из мембраны, но приводило к появлению дополнительных полос
в верхней части геля при электрофорезе. Весьма существенно
вносить Тритон Х-100 и мочевину в сам гель, причем в опреде-
ленной пропорции. Мочевина препятствует связыванию Тритона
Х-100 с белком, тем самым повышая избирательность этого про-
цесса. Оптимальное соотношение концентраций детергента и
мочевины для данного типа белков подбирают эксперименталь-
но. В цитируемой работе использовали пластину 12%-ного
ПААГ (С = 0,8), полимеризованного в 5%-ном растворе уксус-
ной кислоты с 8 М мочевиной и 12 мМ (0,75%) Тритоном Х-100.
Следует иметь в виду, что детергент ухудшает сцепление ПААГ
со стеклом. Этим, по-видимому, и было обусловлено понижен-

 

83

ное против обычного содержание метиленбисакриламида. Иног-
да, во избежание выскальзывания мелкопористого геля, содер-
жащего Тритон Х-100, из трубки или пластины под ним прихо-
дится предварительно заполимеризовать «пробку» обычного
ПААГ. Тритон Х-100 усиливает опасность окисления белков за
счет остаточных свободных радикалов, поэтому особое внима-
ние следует уделить преэлектрофорезу. Авторы работы вели его
сначала в течение 3—4 ч при напряжении 240 В до постоянства
силы тока, подключив анод к нижнему электроду. Затем в элек-
тродные резервуары заливали свежую 5%-ную уксусную кисло-
ту, а в карманы пластины вносили 0,2 М цистамина и до 2 мг/мл
протамина, растворенных в 5%-ной уксусной кислоте с 8 М мо-
чевиной. Возобновляли преэлектрофорез еще на 45 мин, поме-
няв полярность напряжения, подаваемого на гель. Только после
этого вносили белковые препараты и вели электрофорез при по-
стоянном напряжении 100 В в течение суток при той же поляр-
ности напряжения (белки мигрируют к катоду).

В рассматриваемой работе удалось наблюдать значитель-
ные различия белкового состава мембран разных штаммов Е. со-
li и даже мутантов одного штамма. Было использовано и дву-
мерное разделение. Полоски геля после электрофореза в при-
сутствии Тритона Х-100 и мочевины вымачивали по 5 мин сна-
чала в 1,5 М Трис-НСl (рН 8,8) с 1% ДДС-Na, потом в 0,5 М
Трис-НСl (рН 6,8) с 1% ДДС-Na и, наконец, в воде. После это-
го их переносили на вторую пластину для ступенчатого электро-
фореза в комплексе с ДДС-Na. Такой двумерный электрофорез
позволяет разделять белки, не поддающиеся разделению одним
только электрофорезом в присутствии Тритона Х-100 и мочеви-
ны или ступенчатым электрофорезом по Лэммли.

Электрофорезом в 12,5%-ном ПААГ, полимеризованном в
5%-ной уксусной кислоте с 0,5% Тритона Х-100 и 6 М мочеви-
ной, удается также хорошо разделять разные формы а- и {b-це-
пей глобина [Rovera et al., 1978]. Предварительную денатура-
цию белков в этом случае проводили в присутствии 5% (b-мер-
каптоэтанола, так как окисление может существенно изменять
гидрофобные свойства белка.

Аналогичное фракционирование гистонов проводили в геле,
полимеризованном в 0,9 М уксусной кислоте с 0,38% Тритона
Х-100 и 8 М мочевиной [Newrock et al., 1978]. Здесь также пре-
электрофорез вели сначала с цистамином, затем с протамином.
В более поздней работе [Levy et al., 1979] для разделения гисто-
нов использовали другую пропорцию тех же компонентов буфе-
ра геля: 7%-ная уксусная кислота+0,22% Тритона Х-100 + 4 М
мочевины.

Электрофорез в кислой мочевине с добавкой Тритона Х-100
использовали и для очистки гистонов от примеси рибосомаль-
ных белков. Тритон Х-100 плохо связывается с последними, по-
этому при электрофорезе в первом направлении благодаря ком-
плексу с Тритоном Х-100 гистоны удается отделить от рибосо-

 

84

мальных белков с близкими молекулярными массами. Гистоны
мигрируют вместе с относительно более крупными белками ри-
босом. Во втором направлении электрофорез в пластине 1'5%-
ного ПААГ в присутствии 0,1% ДДС-Na позволяет выявить раз-
личие истинных молекулярных масс этих двух типов белков.
ДДС-Na вытесняет Тритон Х-100 из комплекса с белком, и от-
носительно более низкомолекулярные гистоны уходят вперед,.
отделяясь от рибосомальных белков [Savic, Poccia, 1978].

Вообще, двумерный электрофорез гистонов, включающий
комплексообразование с Тритоном Х-100 в одном из направле-
ний, использовался довольно -часто [Hamana, Iwai, 1976; Gar-
nird, 1976; Franklin, Zweidler, 1977; Blankstein et al., 1977].
В последние годы описано применение в тех же целях других,
сходных с Тритоном Х-100 неионных детергентов. Так, после
обычного электрофореза в кислой мочевине для второго направ-
ления был использован 15%-ный ПААГ, полимеризованный в
0,8 М уксусной кислоте, содержащей 0,4% Lubrol WX (фирмы
«Sigma») и 6 М мочевину [Bhatnagar, Bellve, 1978]. Гистон Н2А
печени и других органов мыши при этом удалось разделить на
два компонента, гистон НЗ—на три или четыре; в ряде случа-
ев расщеплялся и гистон HI. В другой работе [Allis et al., 1979]
был использован Тритон DF-16. В 12%-ном ПААГ, полимеризо-
ванном в 5%-ной уксусной кислоте с 0,4% Тритона DF-16 и 6 М
мочевиной, гистоны мигрируют в следующем порядке: Н4, Н1+
+Н2В, НЗ и Н2А. Электрофорез по размерам во втором направ-
лении (система Лэммли) разделяет их очень хорошо.

Цетавлон

Цетилтриметиламмонийбромид  (цетавлон) — положительно
заряженный ионный детергент. Как известно, ДДС-Na раство-
ряет не все щелочные белки, зато хорошо растворяет нуклеино-
вые кислоты, которые могут создавать помехи при электрофоре-
зе белков, входящих в состав нуклеопротеидов. Паним и соавто-
ры предложили заменить ДДС-Na на цетавлон [Panyim et al.,
1977]. Как и ДДС-Na, цетавлон способствует растворению бел-
ков за счет связывания с гидрофобными участками полипепти-
дов. Благодаря электростатическому отталкиванию положитель-
но заряженных аммониевых групп цетавлона белковые цепи рас-
прямляются и приобретают жесткость. Комплекс белка с цетав-
лоном, особенно в кислой среде, заряжен заведомо положитель-
но. Вместе с тем цетавлон взаимодействует с нуклеиновыми
кислотами как «жирный катион» и осаждает их из, раствора.

Использование цетавлона имеет и свои трудности. При взаи-
модействии с персульфатом аммония он довольно легко выпадает
в осадок, поэтому полимеризацию геля приходится вести при
слегка повышенной температуре (37°), в термостате. Кроме то-
го, цетавлон осаждает красители типа СВВ R-250, поэтому окра-
шивание геля ведут при температуре 80—100°.

 

85

Паним и соавторы для разделения смеси стандартных белков использова-
ли 10%-ный ПААГ (С=1,5), полимеризованный в 0,09 М Na-ацетатном буфе-
ре (рН 4,6) с 0,09% цетавлона. Примерно таким же буфером заполняли элек-
тродные резервуары. Исходный препарат готовили, растворяя белки до кон-
центрации 0,25—0,5 мг/мл в 0,0.1 М Na-ацетатном буфере (рН 4,6) с 0,5%
цетавлона и 1% р-меркаптоэтанола. Назначение последнего — такое же, как
при обработке белков ДДС-Na. Белковый раствор кипятили 5 мин или инку-
бировали 2 ч при 37°, а затем добавляли мочевину до концентрации 6 М. На
трубку (10x0,6 см) вносили 20 мкл раствора препарата (5—10 мкг белка).
Электрофорез вели при силе тока 8—10 мА на гель и напряженности поля
8—10 В/см. В качестве лидирующего красителя использовали 0,05%-ный рас-
твор Azure А. Белки окрашивали 0,25%-ным раствором СВВ R-250 в 10%-ной
уксусной кислоте, содержащей 45% метанола, в течение 30—60 мин при тем-
пературе 80—100°. Отмывали излишек красителя в 0,9 М уксусной кислоте
при той же температуре.

Как и при электрофорезе с ДДС-Na, в случае обработки це-
тавлоном также наблюдается линейная зависимость между ло-
гарифмом молекулярной массы белка и расстоянием его мигра-
ции в геле. Пользуясь этой зависимостью, удается оценивать
молекулярные массы белков в интервале 15—90 тыс. дальтон.

Эли и соавторы недавно предложили модификацию описан-
ной выше системы [Ely et al., 1979J. Они заменили персульфат
аммония на флавинмононуклеотид (ФМН) в качестве инициа-
тора полимеризации, которая идет при освещении (ФМН рас-
творим лучше, чем рибофлавин). Это снимает проблему осаж-
дения цетавлона при полимеризации геля.

В качестве рабочего буфера геля использовали U,l М Na-фосфат (рН'7)
с 0,l% цетавлона. Белковый препарат перед электрофорезом денатурировали
в течение 1 мин на кипящей водяной бане в том же буфере, но содержащем
0,5% цетавлона и 10—15% р-меркаптоэтанола. Лидирующий краситель-
малахитовый зеленый. Электрофорез в 10%-ном ПААГ при силе тока 8 мА на
трубку (10x0,6 см) занимал около 5 ч. Белки фиксировали в кипящей 10%-
ной ТХУ, затем окрашивали при комнатной температуре 0,5%-ным раствором
СВВ R-250 в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 4'5% этанола, в течение
10ч.

Обработку цетавлоном удобно использовать для диссоциа-
ции белков от ДНК в хроматине с одновременным осаждением
ДНК и последующим электрофорезом комплексов белков с це-
тавлоном. При низких значениях рН связывание цетавлона с ги-
стонами и негистоновыми белками хроматина носит избиратель-
ный характер, что способствует их электрофоретическому раз-
делению.

Фракционирование белков по степени их гидрофобности мож-
но преобразовать в разделение по заряду с помощью следующе-
го приема [Helenius, Simons, 1977]. Для исключения роли раз-
меров белков электрофорез ведут в 1%-ной агарозе, растворен-
ной в 0,05 М глициновом буфере с 0,1 М NaCI и 0,5% Тритона

 

86

Рис. 27. Обнаружение гидрофобных белков двумерным электрофорезом «со
сдвигом заряда» [Bhakdi et al., 1977]

А — без дополнительных детергентов; Б — с добавлением ДОХ; В—с добавлением це-
тавлона

Х-100 с добавлением в него либо цетавлона до 0,5%, либо дез-
оксихолата натрия (ДОХ) до 0,25%. Тритон Х-100 образует
мицеллы, которые связываются с гидрофобными участками бел-
ка в количестве, пропорциональному размеру этих участков.
Цетавлон или ДОХ объединяются с Тритоном Х-100 в смешан-
ные мицеллы, привнося тем самым в комплекс с белком соответ-
ственно положительный или отрицательный заряд, существенно
превышающий собственный заряд белка. При электрофорезе
белки мигрируют со скоростью, обусловленной знаком и вели-
чиной привнесенного заряда. Такой прием можно назвать «элек-
трофорезом со сдвигом заряда». Необычное введение в буфер
геля 0,1 М NaCl по-видимому, способствует как растворимости
белков, так и образованию, мицелл. Напряженность поля при
этом приходится снижать до 4,5 В/см.

Аналогичный подход был использован для обнаружения гид-
рофобных белков в двумерном варианте электрофореза [Bhakdi
et al., 1977]. Разделение белков в первом направлении (I) вели
в 1%-ной агарозе с 0,5% Тритона Х-100. Вырезали полоску, пе-
реносили ее в форму, куда заливали такой же раствор агарозы,
но с добавлением цетавлона или ДОХ. После электрофореза во
втором направлении (II) все гидрофильные белки ложились на
диагонально расположенную прямую, а гидрофобные выпадали
из нее (рис. 27).

Комбинация электрофореза в кислой мочевине с Тритоном
Х-100 в первом направлении и такой же системы, но с цетавло-
ном вместо Тритона, во втором позволила Боннеру и соавторам
выявить значительное число дополнительных фракций при раз-
делении гистонов двумерным электрофорезом. В обоих направ-
лениях использовалась система ступенчатого электрофореза
(3,3%-ный ПААГ—формирующий, 15 %-ный— рабочий). По-
лимеризацию вели с рибофлавином. После электрофореза в пер-
вом направлении белки фиксировали и окрашивали СВВ. При
этом отпадала необходимость вести электрофорез во втором на-

 

87

правлении немедленно по окончании первого разделения И обе-
спечивалась возможность оценить качество последнего. Цетав-
лон, который вносили в верхний электродный буфер (0,15%),
мигрируя под действием поля через полоску препарата, снова
растворял белки и освобождал их от красителя. Во избежание
образования дисульфидных мостиков в раствор красителя для
геля первого направления добавляли до 0,1% цистамина. Для
предупреждения фотоокисления гистонов гели держали вдали
от яркого света [Bonner et al., 1980].

В заключение отметим, что при электрофорезе мембранных
липопротеидов главная проблема связана с их растворением.
Даже в 1%-ном ДДС-Na при 100° не удается добиться надеж-
ного растворения. Между тем липопротеиды хорошо растворя-
ются в смеси 6 г глицина и 10 мл 98%-ной муравьиной кислоты.
Электрофорез можно вести в 13 М НСООН (50%). Для этого
полимеризуют гель в воде, потом его вынимают, вымачивают в
13 М НСООН и с каплей глицерина вставляют в трубку, диа-
метр которой на 0,1—0,2 мм больше, чем у той, которая исполь-
зовалась при полимеризации. В ней и ведут электрофорез [Mok-
rasch, 1978]. В другом варианте электрофореза водонераствори-
мых белков в качестве рабочего буфера геля использовали смесь
фенола, этиленгликоля и воды в соотношении 3:2:3 (масса/объ-
ем/объем). Мономерный акриламид реагирует с фенолом, по-
этому полимеризацию ПААГ в пластинах проводили опять-таки
в водной среде, которую затем путем вымачивания геля заменя-
ли описанной выше смесью [Pusztai, Watt, 1973].