ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ В ПААГ (ЭЛЕКТРОФОРЕЗ)

ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ В ПААГ (ЭЛЕКТРОФОРЕЗ)

Обнаружение и локализацию белковых зон после их разде-
ления электрофорезом в ПААГ в большинстве случаев осуще-
ствляют путем их прокраски в геле. Зоны проявляются как ок-
рашенные полоски или пятна различной интенсивности, в
зависимости от содержания в них белка. Для окраски гель вы-
мачивают в растворе красителя, который диффундирует внутрь
него и прочно связывается с белками. Процесс диффузии, как
правило, занимает несколько часов. Во избежание размывания
полос за это время белки иногда предварительно фиксируют
осаждением. Для этого гель сначала вымачивают в 10%- или
50%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ). Чаще фиксацию сов-
мещают с окрашиванием, используя раствор красителя в .смеси
уксусной кислоты и метанола или в ТХУ.

Одновременно с белками окрашенным оказывается и сам
гель. Это происходит как за счет простого замещения буфера ге-
ля на раствор красителя, так и в результате некоторой сорбции
его на геле. Однако связывание красителя с гелем значительно
менее прочно, чем с белками, поэтому от «фона» удается без
особого труда избавиться «отмывкой» геля, например вымачи-
ванием его в относительно большом объеме растворителя с не-

сколькими сменами. Если отмывка идет только за счет диффу-
зии красителя из геля, она занимает несколько часов, обычно ее
ведут в течение ночи. Во избежание растворения осажденных
белков краситель отмывают тоже уксусной кислотой, часто .в
смеси с метанолом, который улучшает растворимость красите-
ля. Отмывка ускоряется при повышенной температуре (37—
50°) и перемешивании растворителя, однако при этом есть опас-
ность ослабления окраски полос.

Все типы обычно используемых красителей для белков несут
на себе электрический заряд того или иного знака, поэтому от-

Рис. 28. Устройство для электрофоретической отмывки гелей [Shortess, 1974]

мывку геля можно еще ускорить, если в растворителе суспенди-
ровать немного ионообменной смолы, связывающей краситель
и тем самым сдвигающей равновесие диффузии. Часто исполь-
зуют для этой цели смолу смешанного типа AG 501х8.

Наконец, процесс отмывки можно сократить до десятков ми-
нут, если воспользоваться электрофорезом. Электрическое поле
накладывают на гель в поперечном направлении — перпенди-
кулярно оси трубки или поверхности пластины. Не связанные с
белками молекулы красителя благодаря своему заряду быстро
выходят из геля. Разумеется, для этой цели нужно иметь специ-
альный, хотя и очень простой, прибор для поперечного электро-
фореза. Такие приборы («дестейнеры») имеются в продаже, но
их легко изготовить и в лаборатории.

Простое устройство для этой цели описано и схематически
изображено на рис. 28 [Shortess, 1974]. На пластинку из нержа-
веющей стали с отогнутым концом кладут кусок поролона, смо-
ченного 10%-ным раствором уксусной кислоты. Его помещают в
ванночку и заливают таким же раствором до уровня чуть ниже
верхней поверхности поролона. Ряд трубок или пластину геля
кладут на поролон, накрывают фильтровальной бумагой, смочен-
ной уксусной кислотой, и прижимают перфорированной алюми-
ниевой пластинкой или сеткой, также с отогнутым концом.
К отогнутым концам обеих пластинок присоединяют провода от
источника тока; стальная пластинка служит анодом. Перфора-
ции в катодной пластинке нужны для выхода пузырей газа. Че-
рез пластину геля размером 12х7х0,3 см нужно пропускать
ток силой 0,6 А. Отмывка занимает 15—20 мин. Находящиеся в

осадке белки и прочно связанный с ними краситель при непро-
должительном поперечном электрофорезе остаются на своих ме-
стах в геле.

До сих пор речь шла о неспецифической окраске белков. Если
в ходе электрофореза ферменты не утрачивают своей биологи-
ческой активности, то их локализацию в геле можно осуществить
с помощью специфической ферментативной реакции или цепи
реакций, дающих окрашенные продукты. В этом случае гель вы-
мачивают в растворе соответствующих субстратов. Разумеется,
фиксировать белки осаждением в этом случае нельзя и прихо-
дится мириться с некоторым размыванием белковых полос.
Впрочем, низкомолекулярные субстраты зачастую диффунди-
руют в гель быстрее, чем довольно крупные молекулы красите-
лей, и продолжительность вымачивания бывает можно сократить.

Иногда возникает необходимость вести наблюдение за миг-
рацией белковых зон в ходе электрофореза. Для этого исходную
смесь белков можно окрасить красителем «Remazol» [Griffith,
1972], который ковалентно связывается с белком и мигрирует
вместе с ним. Реакцию между белком и красителем проводят в
присутствии ДДС-Na, в щелочной среде. Например, к 2 мг бел-
ка, растворенного в 0,2 мл 0,15 М NaCI с 0,2 М NazHPt^ и 10%
ДДС-Na, добавляют краситель до концентрации 0,16% и прогре-
вают при 56° в течение 20 мин. Для очистки от свободного кра-
сителя белок переосаждают ацетоном.

Чувствительность окрашивания белков многократно увеличи-
вается при использовании перечисленных ниже флюоресцентных
красителей. Многие из них связываются с белками или пептида-
ми, в основном по концевым аминогруппам. Их также можно
использовать для наблюдения за ходом электрофореза после
предварительной обработки исходного препарата.

Рассмотрим теперь подробнее наиболее распространенные
марки красителей и особенности их применения.

Кислые красители

Исторически для окраски белков в геле были прежде всего
использованы давно апробированные промышленные красители
для шерсти — сложные молекулы с несколькими ароматически-
ми кольцами и заряженными группами. Механизм их взаимодей-
ствия с белками еще далеко не ясен. По-видимому, первоначаль-
ное связывание идет за счет кулоновского взаимодействия суль-
фогрупп красителей с положительно заряженными аминокислот-
ными остатками в белке. Затем оно, вероятно, закрепляется
ван-дер-ваальсовскими, водородными, а возможно, и гидрофоб-
ными связями.

Как уже упоминалось, для фиксации белковых полос окра-
шивание ведут в кислой среде. Какой бы буфер ни использовал-
ся при электрофорезе, к моменту окрашивания он замещается
на довольно крепкий раствор (10% и более) уксусной кислоты

или ТХУ, поэтому преимущественный заряд любого белка оказы-
вается положительным за счет остатков лизина, аргинина и ги-
стидина, так что для белков используются преимущественно кис-
лые красители, несущие остатки сульфокислоты. Они сохраняют
свой отрицательный заряд и при низких значениях рН.

В прошлом десятилетии широко использовали «амидо-
шварц»—краситель с фирменным названием «Amido Black 10B»
(сейчас его выпускают под названием «Naphthalene Black 12B»).
Его растворяли до концентрации 1% в 7%-ном растворе уксус-
ной кислоты. В настоящее время его вытеснил другой краси-
тель—кумасси ярко-голубой («Coomassie brilliant blue», сокра-
щенно СВВ). Этот краситель дает лучшую чувствитель-
ность и линейную зависимость интенсивности окраски от концент-
рации белка в более широком ее диапазоне. Краситель выпус-
кают в двух модификациях: R-250 и G-250. Здесь для ориенти-
ровки приведена структурная формула второго из них. Структура
СВВ R-250 отличается только отсутствием двух метальных групп.
Фирма BDH сейчас выпускает эти красители под названиями
«PAGE blue 83» и «PAGE blue G-90» соответственно.

Кумасси G-250

Обилие ароматических колец в структуре красителей типа
СВВ делает их плохо растворимыми не только в воде, но и в раз-
бавленной уксусной кислоте. Для улучшения растворимости к
кислоте часто добавляют метанол. Обычно используют водные
растворы, содержащие 9—10% уксусной кислоты и 40—45% ме-
танола (по объему), однако рабочая концентрация СВВ R-250 в
этой смеси составляет 0,1—0,25%, реже 0,5%. Иногда СВВ R-250
растворяют в 25%-, 50%-ной ТХУ или в смеси, содержащей
10% ТХУ и 25% изопропанола (остальное—вода). Возможны
и другие варианты, не меняющие существа дела: краситель дол-
жен полностью раствориться в кислом растворителе, осаждаю-
щем белок. Не растворившиеся примеси следует отфильтровать.
Их наличие не. говорит о плохом выборе растворителя, так как

Препараты красителя, изготавливаемые для промышленных це-
лей, редко бывают чистыми.

Продолжительность окрашивания зависит от толщины и по-
ристости геля и может варьировать от 2—3 до 12 ч. Для ускоре-
ния процесса можно окрашивать гель при 37°, а ванночку с рас-
створом красителя покачивать. Отмывку от не связавшегося с
белком красителя ведут, как описано выше, например вымачи-
вая гель в 7%-ной уксусной кислоте или в смеси, содержащей
7,5% уксусной кислоты и 5% метанола. В этих условиях раство-
римость красителя достаточна для вымывания его свободных
молекул, а десорбция его с белка незначительна. Если электро-
форез вели в присутствии высокой концентрации мочевины, то лучше отмывать смесью, содержащей 7,5% уксусной кислоты и
20% метанола.

Гель из трубки отмывают в пробирке, пластину геля— в ван-
ночке. При окрашивании соотношение объемов жидкости и геля
должно составлять примерно 3:1, при отмывке — 5:1 или даже
10: 1 с двумя-тремя сменами растворителя. Если в растворитель
добавлена ионообменная смола, то его менять не нужно. Отмыв- ку можно вести поперечным электрофорезом, как подробно опи-
сано выше.

Окрашенный гель из трубки можно сканировать в специаль-
ном приборе или с помощью приставки, которой комплектуются
сейчас многие продажные спектрофотометры. Не следует, впро-
чем, слишком полагаться на соотношение размеров пиков такой
электрофореграммы при оценке количественного соотношения
белков в полосах, так как связывание красителя зависит не толь-
ко от концентрации, но и от химического состава и конформации
белка.

Если электрофорез проводили в кварцевых трубках, то гели
можно сканировать, не извлекая их из трубок, по ультрафиоле-
товому поглощению белков (или нуклеиновых кислот, что значи-
тельно легче).

В этом случае необходимо тщательно очищать или перекри-
сталлизовывать акриламид для уменьшения его собственного
поглощения в ультрафиолетовой области спектра.

Другая возможность количественной регистрации электрофо-
реграммы заключается в денситометрировании его фотографии.
В этом случае ошибка в оценке истинного соотношения коли-
честв белка в полосах может еще усугубиться за счет нелиней-
ности чувствительности фотопленки и других особенностей фото-
графического процесса.

Наиболее надежным способом количественных измерений яв-
ляется счет радиоактивности в белковых полосах при условии
однородности радиоактивной метки по всем компонентам смеси и обеспечения полноты выхода счета, о чем будет подробнее ска-
зано ниже.

После окрашивания СВВ R-250 можно качественно, но впол-
не надежно обнаружить полосу, содержащую 10 мкг белка. На

порядок более высокую чувствительность окраски можно полу-
чить с помощью красителя СВВ G-250. Для этого используют
относительно плохую его растворимость в хлорной кислоте. Го-
товят 0,04%-ный коллоидный раствор красителя в 3,5%-ном вод-
ном растворе НС104, фильтрованием освобождаются от крупных,
не растворившихся частиц. В полученном коричневом растворе
вымачивают гель в течение 1,5 ч при комнатной температуре.
Сорбция на белке сдвигает равновесие в сторону диссоциации
коллоидных частиц; краситель связывается с белком и окраши-
вает его в синий цвет (коричневая окраска была обусловлена
наличием коллоидных частиц). На геле при этом краситель не
сорбируется. Синеватые полосы белка проступают на бледно-ко-
ричневом фоне геля уже через 30 мин. По истечении 1,5 ч гель
переносят в 5%-ный раствор уксусной кислоты. Интенсивность
окраски полос при этом увеличивается, а фон становится проз-
рачным и светло-голубым — часто его можно не отмывать [Hoi-
brook, Leaver, 1976]. Описан и другой вариант использования
СВВ G-250: его растворяют сначала в 1 н. H₂S0₄, а затем в
12%-ной ТХУ [Blakesley, Boezi, 1977].

Для окрашивания гистонов после электрофореза иногда
используют краситель «Fast green FCF» [McMaster-Kaye, Kaye,
1974]. Его можно использовать и для других белков. Он менее
чувствителен, чем СВВ, но более надежен для количественных
оценок содержания белка в полосах путем денситометрирования,
так как при отмывке геля СВВ в большей степени, чем «Fast
green», вымывается из белковых полос, причем иной раз неоди-
наково для различных белков [Bertolini et al., 1976].

Следует отметить, что в случае плотных белковых полос при
недостаточной продолжительности окрашивания можно столк-
нуться с артефактом — возникновением «двойной полосы». На
самом же деле это одна полоса, интенсивно окрашенная с двух
своих торцевых поверхностей.

Во всех описанных способах белки перед окрашиванием или
в его процессе фиксируют осаждением кислотой и спиртом.
Однако некоторые основные белки (например, рибонуклеаза и
протамин), а также низкомолекулярные пептиды и гормоны при
такой обработке не осаждаются, а, наоборот, растворяются и
вымываются из геля. Недавно был предложен принципиально
иной подход к фиксации белков и пептидов в геле после электро-
фореза. Гель в течение 1 ч вымачивают в 5%-ном растворе фор-
мальдегида в 25%-ном этаноле с добавлением СВВ R-250 до
0,11%. В этих условиях формальдегид ковалентно сшивает пеп-
тиды с матрицей геля за счет образования метиленовых мости-
ков между аминогруппами аминокислот и первичными аминами
ПААГ. На приведенных в работе фотографиях можно видеть ра-
зительный эффект обнаружения щелочных и низкомолекулярных
белков: гели, кажущиеся пустыми при обычном окрашивании, на
самом деле содержат множество белковых полос. Гели с ДДС-Na
красят более продолжительное время (до 3 ч) в 3,5%-ном рас-

творе формальдегида, что обеспечивает вытеснение ДДС-Na
красителем. Отмывку гелей ведут в течение ночи в 3,5%-ном рас-
творе формальдегида в 25%-ном этаноле [Steck et al., 1980].

Другие красители и методы окрашивания

Определенные затруднения возникают при окраске кислых
фосфопротеидов, например фосфитина. Наличие отрицательно
заряженных остатков фосфорной кислоты мешает окрашиванию
анионными красителями. Конечно, можно использовать такие
положительно заряженные (катионные) красители, как толуи-
диновый синий или акридиновый оранжевый (см. ниже), но они
дают высокий уровень фона, так как матрица ПААГ всегда не-
сет на себе некоторое количество отрицательно заряженных ос-
татков акриловой кислоты.

Есть возможность пойти другим путем. Известна высокая
степень сродства фосфопротеидов к трехвалентным металлам,
поэтому можно использовать ионы А1³⁺ для блокирования заря-
дов фосфатов. Это позволит успешно вести окрашивание белков
кислым красителем. Так, для фосфопротеидов была рекомендо-
вана следующая смесь: 0,05% СВВ R-250+0,1 M A1(NO₃)₃+10%
уксусной кислоты + 25% изопропанола + 1% Тритона Х-100. От-
мывают гель, как обычно, в 7%-ной уксусной кислоте [Hege-.
nauer et al., 1977].

Гликопротеиды, белки, липиды и даже нуклеиновые кислоты
можно окрасить одновременно красителем с выразительным
фирменным названием «Stains-all», формула которого представ-
лена ниже.

0,1%-ный маточный раствор этого красителя в формамиде
можно хранить при 4° в темной бутыли в течение месяца. Его ра-
бочая концентрация—0,0012% в 0,01 М Трис-НСl (рН 8,5) с
5% формамида и 25% изопропанола. Окрашивать гель следует
в темноте, в течение ночи. Можно затем отмывать гель в воде, но
делать это не обязательно, так как на свету находящийся в геле
свободный краситель быстро выцветает, в то время как связан-
ный с белком оказывается значительно более стойким. Замеча-
тельно, что разные по своей природе биополимеры окрашивают-
ся при этом в различные цвета: гликопротеиды—в синий, бел-
ки — в красный, липиды — в желто-оранжевый, ДНК — в синий,
а РНК — в голубовато-пурпурный. Однако по чувствительности
этот универсальный краситель заметно уступает специализиро-
ванным. Кроме того, он обесцвечивается при контакте с ДДС-Na,

который из-за этого приходится отмывать после электрофореза,
вымачивая гель в течение 18—36 ч в 25%-ном растворе изопро-
панола [King, Morrison, 1976].

Если примириться с некоторой диффузией полос во время ок-
рашивания и не осаждать белки, то их можно красить в водных
буферах кислыми или щелочными красителями (в зависимости
от заряда белка). Связь между красителем и белком в этих слу-
чаях осуществляется в основном за счет сил кулоновского взаи-
модействия. В области нейтральных рН такие кислые красители,
как СВВ, бромфеноловый синий и «Fast green», заряжены отри-
цательно. Их изоэлектрическая точка лежит ниже рН 3,5. Ще-
лочные красители (метиленовый синий, толуидиновый синий и
пиронин) в нейтральных буферах несут положительный заряд
(рI>9,5). Таким образом, кислые белки в мягких условиях мож-
но красить щелочными красителями, а щелочные—кислыми.
Красители растворяют в воде до концентрации 0,02% и нейтра-
лизуют раствор добавлением 0,2 М фосфатного буфера (рН 7)
до концентрации 5 мМ. Гель после электрофореза для удаления
избытка рабочего буфера вымачивают в воде в течение 5 мин,
затем окрашивают 10 мин при комнатной температуре. Отмыть
фон можно в течение часа в деионизованной воде или смеси ме-
танол—вода (1 : 2), что стабилизирует окраску. Окрашенные ге-
ли хранят в разбавленных водных растворах красителей во избе-
жание их десорбции. В воду добавляют в качестве антисептика
азид натрия до концентрации 0,01% [Ruchel et al., 1978].

Недавно был предложен принципиально новый способ окрас-
ки белков после электрофореза в ПААГ, обеспечивающий, по
утверждению авторов, на два порядка более высокую чувстви-
тельность, чем СВВ R-250 [Merril et al., 1979]. Белки окраши-
вают ионами серебра в присутствии небольшой добавки ионов
меди. Эти ионы вносят в составе нитратов серебра и меди, рас-
творенных в воде с добавлением пиридина и этанола. Гель пред-
варительно обрабатывают формальдегидом. После первой обра-
ботки этими ионами гель еще раз споласкивают довольно кон-
центрированным (11%) щелочным раствором нитрата серебра и,
наконец, восстанавливают серебро обработкой смесью формаль-
дегида и лимонной кислоты в 10%-ном этаноле. Механизм окра-
шивания неясен. По-видимому, он сходен с восстановлением се-
ребра в фотографическом процессе, так как «передержанный»
гель можно ослабить обычным ослабителем для фотографии.

Несмотря на свою огромную чувствительность, предложен-
ный способ достаточно сложен и связан с расходом дорогостоя-
щего нитрата серебра, поэтому в середине 1980 г. другая группа
авторов опубликовала упрощенную методику высокочувстви-
тельной окраски белков серебром, дающую, по-видимому, такие
же результаты [Oakley et al., 1980]. Ввиду перспективности это-
го метода цитируем его подробно.

Все растворы готовят на бидистилляте, а работу ведут в перчатках. При-
веденный ниже режим обработки соответствует пластинам размером 140x
x140x0.8 мм; для более толстых гелей продолжительность обработки на
каждом этапе надо увеличить. При всех процедурах, кроме одной, используют
осторожное перемешивание растворов на ротационной мешалке («New Bruns-
wick gyrotory shaker», модель 2) со скоростью 40 об/мин. Ниже описаны со-
ответствующие процедуры.

Гель вымачивают в течение 30 мин в 10%-ном водном растворе глутаро-
вого альдегида, споласкивают в течение 10 мин в 0,5—1 л воды с двумя сме-
нами и оставляют для набухания в воде не менее чем на 2 ч. Затем воду сли-
вают и заливают гель свежеприготовленным раствором аммиачного серебра.
Для получения 100 мл этого раствора добавляют 1,4 мл свежего концентри-
рованного раствора аммиака к 21 мл 0,36%-ного раствора NaOH, а затем с
энергичным перемешиванием медленно прибавляют 4 мл 19,4%-ного раствора
азотнокислого серебра (20 г AgNO₃+100 мл воды). При этом может времен-
но образоваться коричневый осадок. После его растворения добавляют воду
до объема 100 мл. Для создания хорошей, ровной окраски и во избежание
прилипания геля ко дну надо, чтобы он свободно плавал в ванночке размером
20Х20 см со 150 мл раствора аммиачного серебра. Скорость перемешивания
в это время следует увеличить до 75 об/мии. Окрашивание должно длиться не
более 15 мин, чтобы серебро не успело осесть на поверхности геля. Так как
раствор аммиачного серебра при высыхании может взрываться, после его ис-
пользования серебро осаждают в виде AgCl подкислением НС1. Гель вынима-
ют из раствора и промывают водой в течение 2 мин. Чтобы он не прилип к
кювете, здесь и на следующем этапе следует не сливать жидкость, а перено-
сить его из кюветы в кювету. Затем гель переносят в свежеприготовленный
раствор, содержащий 0,005% лимонной кислоты и 0,019% формальдегида.
(разбавлен из продажного 3'8%-ного формальдегида в 10%-ном метаноле); при этом и проступают полосы белков. Гель вынимают, когда фон только на-
чинает темнеть, и промывают водой в течение часа с тремя сменами при пере-
мешивании. Если концентрация ПААГ превышает 10%, то фон может ока-
заться темным. Он уменьшается в случае предварительной фиксации белков в
10%-ной уксусной кислоте с 50% метанола в течение 30 мин и последующей
промывки геля в 7%-ной уксусной кислоте с 5% метанола в течение ночи.

Минимальная концентрация белка в полосе, которую можно
обнаружить, составляет примерно 10^-4 мкг/мм². По приведенным
в работе фотографиям создается впечатление, что чувствитель-
ность метода столь же высока, как и первоначальной методики
Меррила и соавторов, но четкость линий немного хуже. В этом
случае также возможно ослабление с помощью фотоослабите-
лей.

Хотя в рассмотренной работе об этом и не говорится, Меррил
и соавторы указывают, что после окрашивания серебром гели
становятся хрупкими. Для высушивания их рекомендуется пред-
варительно подвергнуть следующей обработке: вымочить в тече-
ние 15 мин в 30%-ном водном растворе тиосульфата натрия, про-
мыть 4 раза по 15 мин в воде и, наконец, вымочить в смеси ме-
танол — вода — глицерин (70 : 27 : 3) в течение 5 мин.

В начале 1981 г. Меррил и соавторы предложили еще одну
методику окрашивания белков в геле серебром. В отличие от их
первого метода, где был использован гистологический подход, в
данном случае восстановление серебра происходит фотохимиче-
ским путем.

После двумерного разделения белков в ПААГ по 0'Фарреллу их фиксиру-
ют и одновременно вымывают ДДС-Na сначала раствором, содержащим 12%
СН₃СООН и 50% метанола (10 мин), потом дважды по 5 мин—5%-ной
СН₃СООН с 10% этанола. Далее для улучшения равномерности окраски гель
вымачивают 5 мин в 0,5%-ном растворе железосинеродистого калия (красной
кровяной соли). После трехкратного ополаскивания в воде гель заливают рас-
твором, содержащим 0,2 г нитрата серебра, 0,2 г нитрата аммония, 0,5 мл
37%-ного формальдегида и 0,06 мг бензотриазола (антивуалирующего сред-
ства для фотографии) в 100 мл воды. Гель в растворе освещают вольфраме-.
вой лампой накаливания мощностью 1500 Вт в течение 20 мин. Затем раствор
сливают и гель, не споласкивая, заливают 200 мл 3%-ного раствора Na₂CO₃,
содержащего 0,1 мл формальдегида и 0,12 мг бензотриазола. Окраска появ-.
ляется уже через 1 мин. Не прекращая освещения, раствор сменяют 2—3 раза
до достижения желаемой интенсивности окраски белков. Процесс окрашива-
ния прерывают погружением геля на 5 мин в 1%-ный раствор СН₃СООН,
а затем промывают его водой.

Чувствительность метода столь же высока, как и у ранее опи-
санных методов окраски серебром, но процедура существенно
проще, дешевле и занимает всего 1 ч [Merril et al., 1981].

Флюоресцентные красители

Данзилхлорид выпускается в виде двух кристаллических
форм: кристаллы красного цвета плавятся при 70°, желтые—-
при 73°. Они хорошо растворяются в ацетоне. Максимум их пог-
лощения в растворе лежит в области 330—360 нм, флюоресцен-
ции — 510 нм. Молярная экстинкция E=4,3 · 10⁶.

В щелочной среде, отщепляя ион хлора, данзильный остаток
присоединяется к аминокислотам, пептидам и белкам, главным
образом, по их концевой аминогруппе. При этом его способность
флюоресцировать сохраняется.

Данзилирование белков и пептидов позволяет следить эа хо-
дом их миграции при электрофорезе путем освещения гелей
длинноволновым ультрафиолетовым светом, достаточно хорошо
проникающим через пирексовое стекло. Скорость миграции бел-
ков при данзилировании практически не изменяется, поэтому не-
большие примеси данзилированных препаратов можно исполь-
зовать в качестве маркеров при разделении неокрашенных бел-
ковых смесей.

Данзилирование не мешает протеолизу белка, что позволяет

проводить пептидный анализ данзилированных белков после их
разделения электрофорезом в ПААГ и элюции из геля. При этом
удается обнаруживать по флюоресценции не только концевые,
но и внутренние пептиды. Дело в том, что Данзилирование, хотя
и намного менее эффективно, чем по концевым аминогруппам,
происходит (в порядке ослабления) по SH- и ОН-группам цис-
теина и тирозина, e-NН₃-группам лизина и по гистидину. Цен-
ным является то обстоятельство, что автолиз неданзилирован-
ных протеаз не создает никаких помех при картировании пепти-
дов.

Недавно описано Данзилирование белков для последующего
разделения ступенчатым электрофорезом в комплексе с ДДС-Na
(в системе Лэммли) [Tijssen, Kurstak, 1979]. Белки растворяют
до концентрации 2 мг/мл в 0,1 М Трис-ацетатном буфере (рН
8,2) с 10% ДДС-Na, добавляют 1/15 объема 10%-ного. раствора
данзилхлорида в ацетоне и, закрыв пробирку парафильмом, ин-
кубируют в течение 15 мин на водяной бане при 50°. Свободный
данзилхлорид нерастворим в водном ацетоне и образует мутно-
желтую суспензию, тем не менее Данзилирование в ней происхо-
дит. Раствор просветляется после добавления 1/15 объема (b-мер-
каптоэтанола и дополнительной инкубации в течение 15 мин.
Меркаптоэтанол связывает и растворяет избыток данзилхло-
рида.

Инкубационную смесь можно без дальнейшей очистки под-
вергать электрофорезу. Ярко люминесцирующие побочные про-
дукты данзилирования быстро отделяются от белков и уходят
вперед. В работе описан и препаративный вариант разделения
белков под контролем данзилированных аликвот. При этом ис-
пользуется электрофоретическая элюция белковых полос из ге-
ля. Описан также пептидный анализ разделенных белков элек-
трофорезом в системе Лэммли с градиентом пористости рабоче-
го геля. Несколько ранее препаративный электрофорез белков
под контролем данзилированных аликвот был описан Стефенсом
[Stephens, 1975].

Флюоресцамин (иногда поставляется под фирменным наиме-
нованием «Fluram») — желтовато-белый порошок, хорошо раст-
воримый в ацетоне, диметильсульфоксиде и ацетонитриле. Хра-
нить раствор следует не более двух недель: он неустойчив, осо-
бенно при рН<4 и рН>10. При взаимодействии с первичными
аминами (концевыми аминогруппами, e-NH₂-группами лизина)

в водной среде флюоресцамин дает сильно флюоресцирующие
продукты в соответствии с представленной ниже схемой.

Реакция идет успешнее в щелочной среде. Продукт реакции
имеет два максимума поглощения (при 300 и 390 нм) и макси-
мум флюоресценции при 480 нм. Замечательно, что ни сам флюо-
ресцамин, ни продукты его распада в растворе не флюоресци-
руют. При окрашивании белков и пептидов флюоресцамином не
создается флюоресцирующего фона и окрашенный продукт мож-
но не отделять от красителя, что чрезвычайно удобно. При ис-
пользовании флюоресцамина для окраски белков или пептидов
перед электрофорезом следует иметь в виду, что он вносит до-
полнительный отрицательный заряд (за счет образующегося
карбоксила) и этим изменяет электрофоретическую подвижность
окрашенного белка. В случае разделения белков, обработанных
ДДС-Na, этот единичный заряд практической роли не играет.

В недавней работе [Jackowski, Liew, 1980] флюоресцамин использовали
для окраски белков после их двумерного фракционирования влектрофокуси-
ровкой и электрофорезом по методу 0'Фаррела. Белки фиксировали в пласти-
не геля, вымачивая ее в течение ночи в 10%-ной уксусной кислоте с 50% ме-
танола (одновременно вымывались амфолины, которые окрашиваются флюо-
ресцамином). Гель споласкивали в 7%-ной уксусной кислоте, помещали на
1 ч в диметилсульфоксид (ДМСО) и на 2ч — в 0,04 М раствор борной кисло-
ты в ДМСО, титрованный NaOH до рН 10. Затем добавляли равный объем
раствора флюоресцамина (0,5 мг/мл) в ДМСО и встряхивали смесь в течение
8 ч. Белковые пятна проявлялись уже через 2 ч. Их фотографировали при ос-
вещении длинноволновым ультрафиолетовым светом.

Хранить гель в ДМСО следует в темноте: на свету способ-
ность к флюоресценции за 24 ч падает до нуля. Чувствитель-
ность и разрешающая способность окраски флюоресцамином
примерно такие же, как и СВВ R-250, но линейный участок за-
висимости интенсивности окраски (флюоресценции) от количе-
ства белка больше — вплоть до 7 мкг белка на 1 см² в пятне или полосе. Для окраски СВВ R-250 линейность сохраняется не да-
лее, чем для 3 мг/см².

Окрашивание белка флюоресцамином перед электрофорезом
было использовано значительно раньше [Eng, Parkers, 1974].
Белок, обработанный ДДС-Na, растворяли до концентрации

0,5—1 мг/мл в 0,017 М Na-фосфатном буфере (рН 8,5) с 5%
ДДС-Na. К 100 мкл этого раствора добавляли 5 мкл раствора
флюоресцамина в ацетоне и встряхивали. Затем без дальнейшей
очистки 10 мкл этой смеси вносили в трубку для электрофореза.
Замечено, что ДДС-Na уменьшает эффективность окраски
флюоресцамином. По-видимому, он создает препятствия для
контакта красителя с аминогруппами белка. Аналогично исполь-
зовали флюоресцамин и для окраски пептидов перед электрофо-
резом [Rosemblatt et al., 1975]. В 1976 г. было описано исполь-
зование для окрашивания белков перед электрофорезом родст-
венного флюоресцамину препарата МДФФ (2-метокси-2,2-ди-
фенил-3-фуранона) [Barger et al., 1976]. Как и флюоресцамин,
этот препарат реагирует с первичными аминами, давая сильно
флюоресцирующие продукты, в то время как сам он в растворе
не флюоресцирует. Схема реакции представлена ниже.

В отличие от флюоресцамина МДФФ не привносит с собой
дополнительного заряда. Он хорошо растворим в ацетоне и
абсолютном метаноле. Максимум возбуждения флюоресцирую-
щего продукта — при 390 нм, флюоресценции — при 745 нм.
Реакция идет лучше в щелочной среде (рН 9,5.) Продукт устой-
чив в интервале рН 2—10. Интенсивность флюоресценции—в
2,5 раза выше, чем при окраске флюоресцамином. Она лишь не-
значительно уменьшается в случае предварительной обработки
белка ДДС-Na и b-меркаптоэтанолом при 100°. Чувствитель-
ность метода очень высока: по утверждению авторов, им удава-
лось обнаруживать до 0,001 мкг белка в полосе. В отличие от
флюоресцамина окраска не ослабевает в течение нескольких ме-
сяцев. Однако есть данные, что с длинными полипептидными
цепями МДФФ реагирует слабее, чем флюоресцамин. Окраши-
вание ведут в 0,01 М боратном буфере (рН 9,5), энергично пере-
мешивая раствор белка с избытком раствора МДФФ в ДМСО.

Недавно [Chen, Thomas, 1980] МДФФ был использован для
окраски бромциановых пептидов альдолазы перед их разделе-
нием электрофорезом в 15%-ном ПААГ с ДДС-Na. Пептиды,
обработанные ДДС-Na и р-меркаптоэтанолом, окрашивали в
0,1 М Li-боратном буфере (рН 9,5), добавляя к ним в пятикрат-
ном избытке МДФФ, растворенный в абсолютном метаноле.

100

Ортофталевый альдегид (ОФА) в присутствии b-меркапто-
этанола реагирует с первичными аминами белков и пептидов,
давая сильно флюоресцирующий продукт в соответствии с при-
веденной ниже схемой.

ОФА растворим в воде, но лучше—в метаноле, этаноле, аце-
тоне и диоксане. Реакция присоединения хорошо идет при
рН 8—9. При использовании ОФА его сначала растворяют в
одном из перечисленных органических растворителей, а потом
смешивают с избытком водного буфера нужной концентрации и
значения рН. Максимум возбуждения флюоресцирующего про-
дукта — при 340 нм, флюоресценции — при 445 нм. Раствор са-
мого ОФА не флюоресцирует. Чувствительность метода — выше,
чем в случае флюоресцамина, но и фон флюоресценции побочных
продуктов выражен сильнее.

Использование ОФА для окрашивания комплексов белок—
ДДС-Na перед их электрофорезом описано еще в 1973 г. [Wei-
dekamm et al., 1973]. Реакцию проводили в 0,025 М Na-фосфат-
ном буфере (рН 8,5) в присутствии 5% ДДС-Na и 2% b-меркап-
тоэтанола. Сначала белок растворяли в этой смеси и прогревали
при 100° для полной денатурации и восстановления, затем туда
добавляли 1/5 объема 1%-ного раствора ОФА в метаноле и вы-
держивали в темноте 2—3 ч.

Локализация ферментов после электрофореза

В ряде случаев электрофорез ферментов в мягких условиях
(без ДДС-Na или мочевины) не сказывается на их активности.
Положение полос ферментов в геле можно идентифицировать с
помощью специфических реакций, дающих окрашенные продук-
ты. Для этого гель вымачивают в растворе субстратов и кофак-
торов, необходимых для протекания определенной ферментатив-
ной реакции, иногда с добавлением реагентов, сообщающих
окраску продукту этой реакции. Эту операцию следует проводить
быстро во избежание диффузии нефиксированных белков из их
полос. Если субстрат реакции полимерен и плохо диффундирует,
его можно заполимеризовать прямо в гель и следить за продви-
жением фронта ферментативной реакции вместе с миграцией
фермента. Разумеется, при этом необходимо ясно представлять,
каково будет поведение субстрата в электрическом поле во вре-
мя электрофореза.

101

Можно заполимеризовать субстрат и кофакторы в другом
(«индикаторном») геле на основе агарозы или импрегнировать
ими фильтровальную бумагу. После окончания электрофореза
белков в пластине рабочего ПААГ на его поверхность наклады-
вают индикаторный гель или бумагу. Ферменты диффундируют
в них из рабочего геля и обнаруживают себя соответствующей
цветной реакцией. Габриель привел длинный список индикатор-
ных цветных реакций для ферментов [Gabriel, 1971]. Во многих
случаях в этих реакциях фигурирует восстановление НАД с
дальнейшей передачей электрона на краситель. Удобно в каче-
стве заключительного этапа реакции воспользоваться нефермен-
тативным восстановлением тетразолиевой соли до ее формазана,.
что дает сильно окрашенные и зачастую нерастворимые продук-
ты (схема реакции приведена ниже),

В качестве примера можно назвать часто употребляющийся
препарат «Methyl thiazolyl blue» (MTT) или еще более сложное
соединение «Nitro blue tetrazolium» (NBT). В окисленном виде

обе эти соли бесцветны. При восстановлении первая дает сине-
пурпурную, а вторая—иссиня-черную окраску. Реакция восста-
новления красителей ускоряется в присутствии промежуточного
переносчика электронов «Phenazine methosulfate» (PMS) или
нового, более стойкого реагента, выпускаемого для этой цели
фирмой «Boehringer» под названием «Meldolablue» [Turner,
Hopkinson, 1979].

102

Для обнаружения в геле протеолитических ферментов пред-
ложен ряд нетривиальных методов. Например, после электрофо-
реза гель вымачивают в течение 2 ч при 37° в 8%-ном растворе
цитохрома с в буфере с рН 8,5, содержащем 8 М мочевину и
1,7 мМ CaCl₂. Затем белок фиксируют в 12,5%-ной ТХУ. Диф-
фундируя в гель, цитохром с окрашивает его в коричневый цвет
по всему объему. Полосы протеаз, разрушающих цитохром с,
остаются прозрачными и хорошо видны на коричневом фоне
[Ward, 1976]. Суть другого подхода заключается в том, что на
гель накладывают обработанную закрепителем в темноте (для
удаления серебра) и вымоченную в буфере фотопленку. После
трехчасовой выдержки при 35° во влажной камере на фотоплен-
ке можно обнаружить следы диффузии в нее протеаз, разрушаю-
щих слой желатины [Burger, Schroeder, 1976].

Для обнаружения нуклеаз при полимеризации геля в него
вносят ДНК (10 мкг/мл) или РНК (25 мкг/мл). Если нуклеазы
для своего действия нуждаются в ионах Mg²⁺, Са²⁺ или Zn²⁺, то
в их растворе ПААГ вымачивают после окончания электрофоре-
за. Далее следует окрашивание геля красителем для нуклеино-
вых кислот—бромистым этидием (см. главу 4). Окрашивается
весь гель, за исключением полос, содержащих нуклеазы, где
нуклеиновая кислота разрушена. Можно вести разделение нук-
леаз и в присутствии ДДС-Na, блокирующего их действие во
время электрофореза. Перед обработкой бромистым этидием
ДДС-Na из геля вымывают.

Заполимеризовав в ПААГ денатурированную ДНК, можно
выявить нуклеазы, специфичные для однонитевых ДНК. Мож-
но также исследовать оптимизацию условий, необходимых для
активности нуклеаз, варьируя состав буфера геля, или опробо-
вать различные ингибиторы нуклеазной активности. С помощью
кольцевых ДНК удается отличить эндонуклеазы от экзонуклеаз.
Электрофорезу можно подвергнуть лизаты бактерий для выяс-
нения содержания в них нуклеаз [Rosenthal, Lacks, 1977]. Окра-
шивание бромистым этидием в описанных опытах можно заме-
нить авторадиографией (см. ниже), если в гель заполимеризо-
вать меченную ³²Р нуклеиновую кислоту или синтетический
полинуклеотид [Iborra et al., 1979].

Выше указывалось, что для локализации ферментов по их
активности электрофорез желательно проводить в условиях,
исключающих возможность денатурации. Однако в недавней ра-
боте [Lacks, Springhorn, 1980] было показано, что очистку цело-
го ряда ферментов (ДНКазы I, некоторых протеаз, амилазы,
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) можно производить электро-
форезом в ПААГ с ДДС-Na после соответствующей обработки
их детергентом при повышенной температуре. Денатурация ока-
зывается обратимой. По окончании электрофореза ДДС-Na от-
мывают и одновременно снимают с белка встряхиванием геля в
течение 1—2 ч в 0,04 М Трис-буфере, рН 7,6. Ферментативная
активность в ряде случаев восстанавливается.

103

По данным Хагера и Буржесс, при снятии ДДС-Na с фермен-
та имеет смысл денатурировать его кратковременной обработ-
кой 6 М гуанидинхлоридом с последующей ренатурацей при раз-
бавлении. Возможно, что при этом восстанавливается нативная
конфигурация белка, нарушенная при первоначальной обработке
ДДС-Na [Hager, Burgess, 1980]. Для ферментов, содержащих
несколько полипептидных цепей (химотрипсин), предваритель-
ную обработку (b-меркаптоэтанолом, разумеется, следует исклю-
чить. Впрочем, то же самое относится и к одноцепочечному трип-
сину. По-видимому, разрыв внутрицепочечных S—S-связей в
нем приводит к необратимой денатурации. Ферменты, состоящие
более чем из двух субъединиц, не ренатурируют.

В заключение отметим, что гликопротеиды после электрофо-
реза в ПААГ можно локализовать, вымачивая гель в растворе
конканавалина А, конъюгированного с флюоресцентной меткой,
например с флюоресцеинизотиоцианатом [Furlan et al., 1979],
или радиоактивно меченного введением ¹²⁵I [Horst et al., 1980].

Локализация белковых полос осаждением ДДС-Na

Не очень чувствительные, но быстрые и простые методы по-
зволяют обнаружить полосы белка после электрофореза в при-
сутствии ДДС-Na по осаждению этого детергента. Наиболее
простой способ состоит в охлаждении геля до температуры 0—4°.
При боковом освещении на фоне черного бархата непрозрачные
белковые полосы и пятна хорошо видны среди почти прозрачно-
го геля. По-видимому, комплексы белок—ДДС-Na служат ядра-
ми конденсации большого количества мицелл ДДС-Na, раство-
римость которого очень сильно зависит от температуры. При
отргревании геля полосы и пятна исчезают. Нижний порог чув-
ствительности этого метода — 0,2 мкг белка на 1 мм² площади
пятна [Wallace et al., 1974]. Попутно отметим недавно описан-
ный, аналогичный способ обнаружения белков в ПААГ, содержа-
щем 8 М мочевину. Гель выдерживают 5—10 мин при —70°.
В местах расположения белковых зон за счет связывания части
свободной воды белками мочевина кристаллизуется, давая не-
прозрачные полосы. Остальной гель при этом остается прозрач-
ным [Bachrach, 1981].

Недавно [Higgins, Dahmus, 1979] было предложено после
окончания электрофореза вымачивать гель в течение 1 ч при 25°
в 10—12 объемах 4 М раствора ацетата натрия. Свободный
ДДС-Na, который в концентрации 0,1% присутствует в геле, вы-
падает в осадок — гель становится белым и непрозрачным. Бел-
ки, связанные с ДДС-Na, при этом не осаждаются. Их прозрач-
ные полосы хорошо видны на темном фоне при освещении геля
сбоку и снизу. Чувствительность метода — 0,1 мкг белка на 1 мм²площади пятна или полосы.