ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ. Том III Контроль качества фармацевтических субстанций (2009 год) - часть 3

13

1. Общие сведения

 1.  

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

 ОБЩИЕ СТАТЬИ

В 3-м томе Государственной фармакопеи 

Республики Беларусь в новой редакции приведе-
ны общие и частные статьи:

2.2.32. Потеря в массе при высушивании;
2.4.8. Тяжелые металлы;
# Лекарственное растительное сырье; 
Валерианы корневища с корнями.
Введены новые общие статьи, тексты и 

разделы:

2.2.55. Пептидное картирование;
2.2.56. Анализ аминокислот; 
2.4.30. Этиленгликоль и диэтиленгликоль 

в этоксилированных субстанциях;

2.5.36. Анизидиновое число;
2.6.27. Микробиологический контроль кле-

точных продуктов;

5.9. Полиморфизм;
5.10. Контроль примесей в субстанциях 

для фармацевтического использования;

5.11. Раздел «Описание (свойства)» в 

частных статьях;

5.12. Стандартные образцы;
# 6. Экстемпоральные лекарственные 

средства.

Дополнения к общим статьям и разделам:
2.9.3. Тест «растворение» для твердых 

дозированных форм;

4. Реактивы.

 1.1.   ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Положения раздела «

Общие сведения

» рас-

пространяются на все общие статьи, частные 
статьи и другие материалы Государственной 
фармакопеи Республики Беларусь.

В материалах Государственной фарма-

копеи Республики Беларусь слово «Фармако-
пея» без уточнений подразумевает Государ-
ственную фармакопею Республики Беларусь. 
Наряду с этим для обозначения Государствен-
ной фармакопеи Республики Беларусь может 
быть использовано официальное сокращение 
ГФ РБ.

Термин «

компетентный уполномоченный 

орган

» означает Министерство здравоохране-

ния Республики Беларусь и Республиканское 
унитарное предприятие «Центр экспертиз и ис-
пытаний в здравоохранении» в соответствии с 
его компетенцией.

# Все общие фармакопейные статьи и моно-

графии гармонизированы с Европейской Фарма-
копеей и построены в следующем формате:

 

– адаптированный перевод соответствую-

щего материала Европейской Фармакопеи;

 

– национальные дополнительные испыта-

ния, информационные и иные материалы отме-
чены значком «#».

Ссылка в материалах Фармакопеи на какую-

либо статью и/или ее раздел означает, что про-
дукт соответствует требованиям этой статьи. На-
звание статьи, на которую дается ссылка, и/или 
ее номер обычно выделены курсивом.

Лекарственное средство должно соответ-

ствовать требованиям Фармакопеи на протяже-
нии срока годности. Срок годности и дата, с кото-
рой он должен отсчитываться, согласовывают-
ся компетентным уполномоченным органом на 
основании экспериментальных исследований по 
стабильности данного готового лекарственного 
средства. Любой другой продукт (фармацевти-
ческая субстанция, вспомогательное вещество 
и др.) должен соответствовать требованиям кон-
кретной фармакопейной статьи на всем протя-
жении периода его использования.

Требования частной статьи являются обя-

зательными, если нет специальных указаний в 
статье 

«Общие сведения»

 или в данной част-

ной статье. Общие статьи становятся обяза-
тельными, когда на них приводится ссылка в 
той или иной частной или общей статье, если 
только специально не указано, что ссылка при-
водится исключительно как информация или 
рекомендация.

# Субстанции для фармацевтического ис-

пользования подразделяются на фармацевтиче-
ские субстанции и вспомогательные вещества.

Фармацевтические субстанции, вспомога-

тельные вещества, лекарственное растительное 
сырье, лекарственные средства и другие про-
дукты, описываемые в частных статьях Фарма-
копеи, предназначены для использования в ме-
дицине.

Нормативный документ по контролю каче-

ства производителя лекарственного средства 
может не содержать все тесты (испытания), при-
веденные в Фармакопее. Для подтверждения 
соответствия лекарственного средства требо-
ваниям Фармакопеи производитель при выпуске 
должен представить доказательства того, что 
лекарственное средство соответствует фарма-
копейному качеству исходя из результатов вали-
дационных испытаний в сочетании с результата-
ми контроля процесса производства данного ле-
карственного средства. Такой подход, если ком-
петентные уполномоченные органы считают его 
обоснованным, не противоречит необходимости 
соответствия требованиям Фармакопеи.

Испытания и методики количественного 

определения, приведенные в Фармакопее, явля-
ются официальными методиками, однако по со-
гласованию с компетентными уполномоченны-
ми органами могут использоваться и другие ме-
тодики при условии, что они дают результаты, 
соответствующие фармакопейным методикам. 
В случае сомнений или разногласий решающей 
является фармакопейная методика.

Фармацевтические субстанции, вспомога-

тельные вещества и другие продукты, на кото-
рые распространяются требования Фармако-

14

пеи, могут использоваться в разных целях (на-
пример, для получения парентеральных ле-
карственных средств или таблетированных ле-
карственных форм и т.п.). Если на этот счет нет 
указаний в соответствующей частной статье, 
ее требования распространяются на продукт 
независимо от целей его применения. В неко-
торых случаях, к примеру, в случае вспомога-
тельных веществ, частная статья может быть 
дополнена списком характеристик, которые 
являются важными для использования данно-
го вещества; этот список прилагается в каче-
стве информации и рекомендаций. В инфор-
мационных целях также могут быть приведе-
ны методики контроля одной или нескольких 
таких характеристик.

Общая фармакопейная статья на ту или 

иную лекарственную форму распространяется 
на все лекарственные средства, изготовленные 
в виде этой лекарственной формы. Для конкрет-
ного лекарственного средства требования соот-
ветствующей общей фармакопейной статьи не 

обязательно являются исчерпывающими и могут 
быть дополнены компетентным уполномочен-
ным органом в частной статье.

Словосочетание «

если нет других указаний 

в частной статье

» (под частной статьей под-

разумевается частная статья ГФ РБ на субстан-
цию или нормативный документ по контролю ка-
чества (НД), утвержденный уполномоченным ор-
ганом) означает, что требования общей статьи 
должны быть выполнены, если только компе-
тентный уполномоченный орган не внес в эти 
требования изменения, что указывается в част-
ной статье.

В некоторых общих и частных статьях Фар-

макопеи при описании реактива, микроорганиз-
ма, методики и т.д. используется термин «

под-

ходящий

». Если при этом критерии их пригод-

ности не сформулированы, то пригодность кон-
кретных реактивов, методик и т.д., используе-
мых в нормативной документации, должна быть 
обоснована перед компетентным уполномочен-
ным органом.

15

2. Методы анализа

 2.  

МЕТОДЫ АНАЛИЗА

 2.2.   ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-

ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

 2.2.32.  ПОТЕРЯ В МАССЕ ПРИ 

ВЫСУШИВАНИИ

Определение потери в массе при высуши-

вании проводят одним из приведенных спосо-
бов и выражают в процентах (

м/м

). 

Методика.

 Указанное в частной статье ко-

личество испытуемого вещества помещают 
во взвешенный бюкс, предварительно высу-
шенный в условиях, описанных для испытуе-
мого вещества. Вещество сушат до постоян-
ной массы или в течение времени, указанного 
в частной статье, одним из приведенных ниже 
способов. Если температурный интервал не 
указан, то высушивание проводят при указан-
ной температуре ±2°С.

а) «в эксикаторе»: высушивание над 

фос-

фора (V) оксидом Р 

при

 

атмосферном давлении 

и комнатной температуре;

б) «в вакууме»:

 

высушивание над 

фос-

фора (V) оксидом Р 

при давлении от 1,5 кПа до 

2,5 кПа и комнатной температуре;

в) «в вакууме в пределах указанного темпе-

ратурного интервала»: высушивание над 

фос-

фора (V) оксидом Р 

при давлении от 1,5 кПа до 

2,5 кПа и температуре, указанной в частной 
статье;

с) «в пределах указанного температурного 

интервала»: высушивание в сушильном шкафу 
при температурном интервале, указанном в 
частной статье;

д) «в глубоком вакууме»: высушивание 

над 

фосфора  (V) оксидом Р 

при давлении не 

более 0,1 кПа и температуре, указанной в част-
ной статье.

Если указаны иные условия, используе-

мая методика полностью описывается в част-
ной статье.

 2.2.55.  ПЕПТИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ

Пептидное картирование (или составление 

пептидных карт) является методом идентифи-
кации белков, в особенности получаемых мето-
дом рекомбинантных ДНК. Метод включает в себя 
этапы химического или энзиматического расще-
пления белков до образования пептидных фраг-
ментов с последующим разделением и иденти-
фикацией этих фрагментов в воспроизводимых 
условиях. Это надежный метод испытания, позво-
ляющий произвести идентификацию изменения 
практически каждой отдельной аминокислоты, 

произошедшего в результате таких явлений, как 
ошибка в считывании последовательности ком-
плементарной ДНК (кДНК), либо являющегося ре-
зультатом мутации. Составление пептидных карт 
является сравнительным испытанием, поскольку 
получаемая информация сравнивается со стан-
дартным образцом, подвергающимся аналогич-
ному воздействию. Данное испытание позволя-
ет подтвердить первичную структуру белка, опре-
делить возможные изменения первичной структу-
ры в случае наличия таковых, подтвердить соот-
ветствие процесса и генетическую стабильность. 
Для каждого из белков характерна совокупность 
уникальных характеристик, которые должны быть 
описаны. Научные и аналитические методики по-
зволяют осуществлять развитие метода пептид-
ного картирования, который, в свою очередь, ха-
рактеризуется достаточной специфичностью.

Данная статья содержит детальное опи-

сание аспектов использования и валидации 
метода пептидного картирования с целью по-
лучения характеристики анализируемого белка, 
оценки стабильности клеточных систем экспрес-
сии, используемых для получения продуктов ре-
комбинантных ДНК и оценки согласованности 
процесса в целом — в отношении как оценки 
стабильности продукта, так и обеспечения иден-
тичности белка, либо определения содержания 
протеинов с изменениями в структуре.

Пептидное картирование не является 

общим методом, а заключается в составлении 
индивидуальных карт для каждого отдельно-
го белка. Хотя технологии продолжают стреми-
тельно развиваться, существует ряд методов, 
которые являются общепризнанными. При нали-
чии определенных расхождений с данными ме-
тодами они будут описываться в соответствую-
щих частных статьях.

Составление пептидных карт может рас-

сматриваться как метод получения «отпечат-
ков пальцев» белка и представляет собой по-
лучаемую в результате ряда химических про-
цессов полную расшифровку анализируемого 
белка. Метод включает четыре принципиальные 
стадии: выделение и очистка белка — в случае 
если белок входит в состав какой-либо смеси; 
избирательное расщепление пептидных связей; 
хроматографическое разделение образующихся 
пептидных фрагментов; анализ и идентифика-
ция пептидов. Анализируемый образец подвер-
гается расщеплению и анализу параллельно со 
стандартным образцом. Полное расщепление 
пептидных связей более вероятно, когда вместо 
химических гидролизующих реагентов использу-
ются такие ферменты, как эндопептидазы (на-
пример, трипсин). Для того чтобы карта была ин-
формативной, она должна содержать достаточ-
ное количество пептидов. С другой стороны, в 
случае если пептидных фрагментов будет слиш-
ком много, карта может утратить свою специ-
фичность, поскольку у многих белков может ока-
заться аналогичный профиль.

16

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА

Выделение и очистка являются обязатель-

ным этапом при проведении анализа нерасфа-
сованных или дозированных форм лекарствен-
ных средств, содержащих мешающие анализу 
вспомогательные вещества или белковые носи-
тели и, если это требуется, указываются в част-
ной статье. Количественное извлечение пепти-
да из дозированной формы должно быть вали-
дировано. 

ИЗБИРАТЕЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ 
ПЕПТИДНЫХ СВЯЗЕЙ

Выбор метода расщепления пептидных 

связей зависит от анализируемого белка. Про-
цедура выбора включает определение требу-
ющегося типа расщепления (химического или 
ферментативного), а также типа протеолитиче-
ского реагента в рамках выбранной категории. 
В таблице 2.2.55.-1. приводится ряд протеоли-
тических ферментов и параметры их специфич-
ности. Данный список не является исчерпываю-
щим и будет дополняться по мере определения 
других реагентов, способных расщеплять пеп-
тидные связи.

Подготовка образца

. В зависимости от 

размера или конфигурации белка используют-
ся различные подходы к подготовке образца. В 
случае если используется трипсин для расще-
пления пептидных связей белка с молекулярной 
массой более 100 000 Да, лизиновые остатки 
должны быть защищены путем получения про-
изводных с лимонной или малеиновой кислотой, 

так как в противном случае может образоваться 
слишком много пептидных фрагментов.

Подготовка реагента для расщепления 

пептидных связей

. Подготовка реагента для 

расщепления пептидных связей, в особенности 
ферментов, может быть необходимым этапом 
для обеспечения требуемой чистоты и воспро-
изводимости карты. Например, трипсин, исполь-
зуемый в качестве реагента для расщепления 
пептидных связей, следует обработать тозил-L-
фенилаланинхлорметилкетоном с целью инак-
тивации химотрипсина. Хорошо зарекомендова-
ли себя, в особенности при ограниченном коли-
честве имеющегося белка, другие методы очист-
ки, такие как высокоэффективная жидкостная 
хроматография (ВЭЖХ) при очистке трипсина 
или иммобилизация фермента на гелевом носи-
теле. 

Подготовка белка

. При определенных 

условиях может быть необходимо концентриро-
вание образца либо отделение белка от исполь-
зуемых в готовой лекарственной форме сопут-
ствующих веществ и стабилизаторов, которые 
могут искажать результаты картирования. Физи-
ческие методы подготовки могут включать уль-
трафильтрацию, колоночную хроматографию 
и лиофилизацию. С целью проведения денату-
рации белка до процедуры пептидного карти-
рования возможно использование других мето-
дов подготовки, таких как добавление хаотроп-
ных агентов (например, мочевины). Для обеспе-
чения полного доступа фермента к местам раз-
рыва связей и частичной денатурации белка во 

Тип

Реагент

Специфичность

Ферментативные

Трипсин (ЕС 3.4.21.4)

С

-концевые аргинин и лизин

Химотрипсин (ЕС 3.4.21.1)

С

-концевые гидрофильные остатки (на-

пример, лейцин, метионин, аланин, аро-
матические аминокислоты)

Пепсин (ЕС 3.4.23.1 и 2)

Неспецифический реагент

Лизил эндопептидаза (Lys-С эн-
допептидаза) (ЕС 3.4.21.50)

С

-концевой лизин

Глутамил эндопептидаза 
(из S. aureus штамм V8) (ЕС 
3.4.21.19)

С

-концевые глутаминовая кислота и аспа-

рагиновая кислота

Пептидил-Asp металло-
эндопептидаза (эндопротеаза 
Asp-N)

N

-концевая аспарагиновая кислота

Клострипаин (ЕС 3.4.22.8)

С

-концевой аргинин

Химические

Цианобромид

С

-концевой метионин

2-Нитро-5-тио-цианобензойная 
кислота

N

-концевой цистеин

О

-Йодозобензойная кислота

С

-концевые триптофан и тирозин

Разведенная кислота

Аспарагиновая кислота и пролин

BNPS-скатол

Триптофан 

Таблица 2.2.55.-1. 

Примеры реагентов для расщепления пептидных связей

17

2.2.55. Пептидное картирование

многих случаях до этапа протеолитического рас-
щепления необходимым представляется сокра-
щение числа дисульфидных связей путем их 
восстановления и алкилирования. Расщепле-
ние пептидных связей с использованием трип-
сина может сопровождаться появлением в пеп-
тидной карте ряда неточностей ввиду протека-
ющих параллельно с реакцией протеолитиче-
ского расщепления побочных реакций, таких 
как неспецифическое расщепление, дезамини-
рование, дисульфидная изомеризация, окисле-
ние остатков метионина, образование пироглу-
таминовых групп при дезаминировании глутами-
на и 

N

-концевых участков пептида. Более того, 

при автогидролизе трипсина также могут появ-
ляться дополнительные пики. Интенсивность их 
образования зависит от соотношения содержа-
ния трипсина к белку. Для предотвращения ги-
дролиза растворы протеаз могут быть приготов-
лены при рН, отличном от оптимального (напри-
мер, при рН 5 для трипсина), благодаря чему 
фермент не перейдет в активное состояние до 
момента разведения с буферным раствором при 
проведении расщепления.

Установление оптимальных условий для 

расщепления пептидных связей

. Факторы, ко-

торые влияют на полноту и эффективность рас-
щепления протеинов, являются факторами, ока-
зывающими влияние на химические и фермен-
тативные реакции.

рН реакционной среды

. Значение рН смеси, 

в которой осуществляется расщепление пепти-
да, определяется эмпирически и направлено на 
оптимизацию состояния расщепляющего реа-
гента. Например, при использовании цианобро-
мида в качестве расщепляющего реагента не-
обходимым является создание сильнокислой 
среды (например, рН 2, муравьиная кислота); 
однако при использовании трипсина в качестве 
расщепляющего агента оптимальной является 
слабощелочная среда (рН 8). В целом значение 
рН реакционной среды не должно изменять хи-
мическую структуру белка в ходе реакции рас-
щепления и не должно изменяться в ходе прове-
дения реакции фрагментации. 

Температура

. Для большинства реакций 

расщепления наиболее подходящей являет-
ся температура в интервале от 25°С до 37°С. 
Создаваемая температура должна способство-
вать минимизации побочных химических ре-
акций. Тип тестируемого протеина определя-
ет выбор температуры реакционной среды, по-
скольку некоторые белки с повышением темпе-
ратуры склонны к денатурации. Например, рас-
щепление рекомбинантного бычьего соматропи-
на проводится при температуре 4°С, поскольку 
при более высокой температуре он осаждается 
в ходе проведения реакции расщепления.

Время. 

В случае если имеется достаточное 

количество тестируемого образца, следует про-
вести испытание по определению времени, яв-
ляющегося оптимальным для получения воспро-

изводимой карты и достаточным для проведе-
ния полного расщепления. Время расщепления 
варьируется от 2 ч до 30 ч. Реакция прекращает-
ся либо прибавлением кислоты, которая не ока-
зывает влияния на полученную пептидную карту, 
либо замораживанием.

Количество используемого расщепляюще-

го реагента

. Для обеспечения достаточного бы-

строго расщепления (от 6 ч до 20 ч) использует-
ся избыточное количество расщепляющего реа-
гента; тем не менее, его количество должно быть 
минимизировано, чтобы предотвратить вклад 
реагента в структуру пептидной карты. Обычно 
анализируемый протеин и реагент берут в соот-
ношении 20:1 или 200:1. Для оптимизации про-
цедуры расщепления рекомендуется добавлять 
расщепляющий агент в два или более этапов. 
При этом конечный объем реагирующей смеси 
должен оставаться достаточно небольшим для 
обеспечения следующего этапа пептидного кар-
тирования — разделения. Для того чтобы исклю-
чить возможное влияние искажающих продуктов 
расщепления (артефактов) на результаты по-
следующего анализа, проводится контрольное 
определение со всеми реагентами за исключе-
нием анализируемого белка.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ

Для разделения пептидных фрагментов ис-

пользуются различные методы. Выбор метода 
зависит от белка, для которого составляется 
пептидная карта. В таблице 2.2.55.-2 перечис-
лены методы, которые на данном этапе успеш-
но используются для разделения пептидных 
фрагментов при составлении пептидных карт. В 
данном разделе описывается один из методов 
хроматографического разделения — наиболее 
часто используемый метод обращенно-фазовой 
ВЭЖХ. 

Критическими факторами при ВЭЖХ раз-

делении являются чистота растворителей и 
подвижной фазы. Для проведения обращенно-
фазовой ВЭЖХ рекомендуется использование 
растворителей и воды степени чистоты «для 
ВЭЖХ». Растворенные газы являются пробле-
мой для градиентных систем в тех случаях, 
когда растворимость газа в растворителе может 
быть меньше в смеси, чем в самом растворите-
ле. В качестве эффективного способа дегаза-
ции может быть использована вакуумная дегаза-
ция и воздействие ультразвуком. В случае если 
твердые частицы в растворителе попадут в хро-
матографическую систему, они могут повредить 
герметичность клапанов насоса или засорить 
верхнюю часть хроматографической колонки. В 
связи с этим рекомендуется проведение филь-
трации до и после насоса. 

Хроматографическая колонка

. Для каж-

дого белка выбор колонки осуществляется эм-
пирически. Колонки с размером пор от 10 нм до 
30 нм, заполненные сорбентом на основе сили-
кагеля, могут обеспечить оптимальное разделе-

18

ние. Для более мелких пептидных фрагментов 

силикагель октилсилильный для хроматогра-
фии Р

 (3—10 мкм) и 

силикагель октадецилси-

лильный для хроматографии Р

 (3—10 мкм) в 

качестве наполнителей колонки являются более 
эффективными, чем 

силикагель бутилсилиль-

ный для хроматографии Р

 (5—10 мкм).

Растворитель

. Наиболее часто в качестве 

растворителя используется вода и ацетонитрил 
в качестве органического модификатора с до-
бавлением не более 0,1 % кислоты трифторук-
сусной. При необходимости для повышения рас-
творимости компонентов смеси прибавляют про-
панол или 2-пропанол. Прибавление спиртов не 
должно приводить к чрезмерному повышению 
вязкости компонентов. 

Подвижная фаза

. Подвижная фаза, содер-

жащая фосфатный буфер, используется для 
обеспечения возможности выбора рН, посколь-
ку изменение рН в интервале от 3,0 до 5,0 улуч-
шает разделение пептидов, содержащих кислот-
ные остатки (например, глутаминовая и аспара-
гиновая кислоты). Натрия или калия фосфаты, 
ацетат аммония, фосфорная кислота при зна-
чении рН между 2 и 7 (или выше при использо-
вании полимерного наполнителя) используют-
ся с ацетонитрильным градиентом. Достаточно 
часто используется ацетонитрил с трифторуксу-
ной кислотой.

Градиент

. Градиент может быть линейным, 

нелинейным или включать ступенчатое измене-
ние состава. Для разделения сложных смесей 
рекомендуется низкая скорость изменения со-
става. Градиент оптимизируют, добиваясь четко-
го разрешения с одним или двумя пиками, кото-
рые становятся «маркерными» пиками для теста. 

Изократическое элюирование

. Изокра-

тическая ВЭЖХ с подвижной фазой постоян-
ного состава используется ввиду ее удобства и 
улучшенного отклика детектора. В ряде случа-
ев сложно подобрать оптимальный состав под-
вижной фазы, позволяющий добиться хороше-
го разрешения для каждого пика. Для проведе-
ния изократической ВЭЖХ не должны использо-
ваться подвижные фазы, для которых незначи-
тельное изменение в соотношении компонентов 
или в значении рН существенно влияет на время 
удерживания пиков на пептидной карте.

Другие параметры

. Для достижения хо-

рошей воспроизводимости, как правило, требу-

ется контроль температуры колонки. Скорость 
подвижной фазы варьируется от 0,1 мл/мин до 
2,0 мл/мин, детектирование пептидов осущест-
вляется спектрофотометрически детектором при 
длине волны от 200 нм до 230 нм. Используют-
ся и другие методы детектирования (например, 
постколоночная дериватизация), но они не столь 
надежны и универсальны, как детектирование в 
ультрафиолетовой области.

Валидация

. В данном разделе приводят-

ся экспериментальные средства для оценки 
общих характеристик используемого метода. 
Критерии оценки пригодности системы зависят 
от определения критических параметров испы-
тания, влияющих на интерпретацию данных и 
их приемлемость. Критические параметры яв-
ляются также критериями, по которым произво-
дится контроль расщепления и анализа пепти-
дов. Для контроля полноты требуемого расще-
пления используется сравнение со стандарт-
ным образцом, который был подвергнут такому 
же воздействию, как и испытуемый белок. Ис-
пользование стандартного образца парал-
лельно с испытуемым белком является необ-
ходимым для разработки и установления зна-
чений критериев оценки пригодности системы. 
Кроме этого, с целью дополнительного сравне-
ния включается образец хроматограммы стан-
дартного образца. Другие показатели могут 
включать визуальный контроль растворимо-
сти белка или пептидов, отсутствие интактного 
белка, измерение откликов труднорасщепляе-
мых пептидов. Критические параметры оценки 
пригодности системы для пептидного анализа 
будут зависеть от конкретного используемого 
метода разделения и детектирования, а также 
требований к получаемым в результате анали-
за данным.

В случае, когда пептидное картирование ис-

пользуется в качестве испытания по идентифи-
кации, требования к пригодности системы для 
идентифицируемых пептидов включают избира-
тельность и воспроизводимость. В этом случае, 
как и в случае идентификации отличающихся по 
составу белков, определение первичной струк-
туры пептидных фрагментов при картировании 
обеспечивает как верификацию известной пер-
вичной структуры, так и идентификацию струк-
туры отличающихся белков путем сравнения с 
пептидной картой стандартного образца для 

Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
Ионообменная хроматография
Хроматография гидрофобного взаимодействия
Полиакриламидный гель-электрофорез, неденатурирующий
Гель-электрофорез в полиакриламидных слоях с использованием мицеллярных систем (натрия до-
децилсульфат)
Капиллярный электрофорез
Бумажная электрохроматография
Электрофорез на бумаге при высокой разности потенциалов

Таблица 2.2.55.-2. 

Методы, используемые для разделения пептидных фрагментов

19

2.2.55. Пептидное картирование

белка установленной структуры. Использование 
подвергнутого расщеплению стандартного об-
разца при определении разделения пептидов и 
аминокислот является референтным методом. 
Для анализа отличающихся по составу белков 
может быть использована охарактеризованная 
по составу смесь отличающегося белка и стан-
дартного образца, в особенности если отличные 
по составу белки находятся в зоне худшего раз-
решения на пептидной карте. Критерием выбора 
системы определения структуры белка может 
являться число основных определяемых пепти-
дов. Критерии выбора системы для определе-
ния структуры белка лучшим образом опреде-
ляются разрешением пиков пептидов. Хромато-
графические параметры, такие как разрешение 
между пиками, ширина пика у основания, пло-
щадь пика, степень размывания заднего фронта 
пика и эффективность колонки, могут быть ис-
пользованы для определения разрешения пеп-
тидов. В зависимости от испытуемого белка и 
используемого метода разделения могут уста-
навливаться требования к разрешению одного 
или нескольких пептидов.

Повторный анализ продуктов расщепления 

стандартного образца для испытуемого белка 
позволяет установить количественные характе-
ристики прецизионности и открываемости. От-
крываемость определяемых пептидов в целом 
устанавливается при помощи внутренних и 
внешних пептидных стандартов. Прецизион-
ность выражается как относительное стандарт-
ное отклонение. Следует ожидать различий в 
извлечении и воспроизводимости идентифици-
руемого протеина; следовательно, критерии до-
пуска для оценки пригодности системы должны 
быть установлены как для извлечения, так и для 
воспроизводимости идентифицируемых пепти-
дов. Установленные критерии допуска являются 
специфическими для данного протеина и указы-
ваются в частных статьях.

Визуальное сравнение относительных 

времен удерживания, параметров пиков (пло-
щади пика или высоты пика), числа пиков и в 
целом метода элюирования производится изна-
чально. Оно дополняется и подтверждается ма-
тематическим анализом соотношений анализи-
руемых параметров пиков и хроматографиче-
ского профиля смеси 1:1 (

об/об

) продуктов рас-

щепления испытуемого образца и образца срав-
нения. Идентичность анализируемого образца 
подтверждается, если все пики продуктов рас-
щепления анализируемого белка и стандартно-
го образца имеют аналогичные времена удер-
живания и соотношения оцениваемых параме-
тров пиков. 

Если пики, которые изначально характери-

зовались значительно различающимися време-
нами удерживания, затем в смеси 1:1 были оха-
рактеризованы как изначально выявленное раз-
личие является показателем нестабильности си-
стемы. Однако если отдельный пик наблюдается 

в смеси 1:1, это является доказательством на-
личия различных пептидов в каждом из пиков. 
Если пик в смеси 1:1 существенно шире, чем со-
ответствующий пик в анализируемом белке и 
стандартном образце, это может означать нали-
чие отличных пептидов. Было предложено ис-
пользование компьютерной программы распо-
знавания для анализа данных пептидного кар-
тирования, однако аспекты валидации компью-
терной программы исключают ее использование 
в качестве справочного теста в ближайшем бу-
дущем. Использовались также иные автомати-
зированные подходы с использованием матема-
тических формул, моделей и систем распозна-
вания. Одним из таких подходов, например, яв-
ляется автоматическое определение соедине-
ний методом ИК-спектроскопии и применение 
диодно-матричного УФ-спектрального анализа 
для идентификации пептидов. Данные методы 
имеют ограничения, обусловленные недоста-
точным разрешением, одновременным элюиро-
ванием фрагментов, различиями в абсолютных 
значениях параметров пиков между продукта-
ми расщепления анализируемого и стандартных 
образцов. 

Можно произвести множественное срав-

нение времен удерживания и площадей или 
высоты пиков для выбранной группы соответ-
ствующих пиков, которые правильно иденти-
фицируются на пептидной карте. Площади 
пиков могут быть рассчитаны с использованием 
одного пика, демонстрирующего относительно 
небольшую вариабельность в качестве внутрен-
него стандарта, с учетом того, что интегрирова-
ние площади пика является чувствительным к 
базовой вариабельности и может служить при-
чиной ошибки анализа. Как альтернативный ва-
риант для испытуемого образца может быть рас-
считан процент высоты пика каждого пептида от-
носительно суммы высоты всех пиков. Затем по-
лученный процент сравнивается со значением 
аналогичного параметра соответствующего пика 
стандартного образца. Возможность автогидро-
лиза трипсина контролируется при помощи соз-
дания пептидной карты-плацебо, получаемой 
при обработке трипсином раствора без опреде-
ляемого белка.

Минимальным требованием для оценки ка-

чества пептидного картирования является при-
нятая процедура тестирования, которая вклю-
чает пригодность системы в качестве контро-
ля. В целом на начальном этапе регуляторно-
го процесса качественный анализ пептидной 
карты анализируемого белка является доста-
точным. с усовершенствованием процесса ре-
гуляторного одобрения белков дополнительные 
испытания по оценке качества могут включать 
частичную валидацию аналитической процеду-
ры для обеспечения гарантии того, что метод 
будет произведен в соответствии с запланиро-
ванным при разработке пептидной карты опре-
деляемого белка.

20

АНАЛИЗ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПЕПТИДОВ

В данном разделе приводится руководство 

по использованию метода составления пеп-
тидных карт при разработке частных фарма-
копейных статей и нормативных документов 
по контролю качества (НД) при регистрации 
лекарственных средств

.

Использование метода составления пептид-

ных карт в качестве метода качественного опре-
деления не требует подробной характеристики 
индивидуальных пептидных пиков. Однако ва-
лидация метода составления пептидных карт 
при разработке частных фармакопейных статей 
и НД требует исчерпывающей характеристи-
ки каждого из индивидуальных пиков пептид-
ной карты. Для характеристики индивидуаль-
ных пиков могут быть использованы как метод 

N

-концевого секвенирования с последующим 

анализом аминокислот, так и метод с использо-
ванием масс-спектроскопии.

В случаях, когда для составления характе-

ристики используется метод 

N

-концевого сек-

венирования с последующим анализом амино-
кислот, аналитическое разделение масштабиру-
ют для целей препаративного разделения. Не-
обходимо убедиться на основании эмпириче-
ских данных, что ухудшения разрешения между 
пиками вследствие проведения масштабиро-
вания не происходит. Элюаты, соответствую-
щие специфическим пептидным пикам, собира-
ют, концентрируют в вакууме и, при необходимо-
сти, повторно хроматографируют. Аминокислот-
ный анализ фрагментов может быть ограничен 
размером пептидов. В случае если 

N

-концевая 

аминокислота заблокирована, может потре-
боваться ее высвобождение до секвенирова-
ния. с целью получения характеристики может 
также использоваться 

С

-концевое секвенирова-

ние белков в комбинации с карбоксипептидазой 
и методом матрично-активированной лазерной 
десорбции/ионизации с времяпролетным масс-
анализатором (

MALDI-TOF

).

Использование масс-спектроскопии для ха-

рактеристики пептидных фрагментов производит-
ся либо путем непосредственного введения выде-
ленных пептидов, либо с использованием 

on-line

 

системы ВЭЖХ с масс-спектрометром для струк-
турного анализа. В целом он включает электро-
распыление и 

MALDI-TOF

 масс-спектрометрию, 

а также бомбардировку быстрыми атомами. Тан-
демная масс-спектроскопия также используется 
для определения последовательности модифи-
цированных белков и для определения типа прои-
зошедшей аминокислотной модификации. Опре-
деление расположения дисульфидных связей 
в различных сульфгидрил-содержащих пепти-
дах может быть произведено методом сравнения 
масс-спектров продукта расщепления до и после 
восстановления. Если некоторые части первич-
ной структуры не могут быть достаточно четко от-
ражены пептидной картой, может потребоваться 
составление вторичной пептидной карты. Целью 

валидированного метода характеристики проте-
ина методом пептидного картирования является 
определение как минимум 95 % теоретического 
состава структуры белка.

 2.2.56.  АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ

Анализ аминокислот — это комплекс мето-

дов, используемых для определения аминокис-
лотного состава или количественного содержа-
ния аминокислот в белках, пептидах и лекар-
ственных средствах. Белки и пептиды являют-
ся макромолекулами, состоящими из ковалент-
но связанных остатков аминокислот, которые об-
разуют линейные полимеры. Последователь-
ность аминокислот в белках или пептидах опре-
деляет свойства молекулы. Белки представляют 
собой крупные молекулы, которые обычно суще-
ствуют в виде трехмерных структур со специфи-
ческой конформацией, в то время как пептиды 
имеют меньший размер и могут состоять только 
из нескольких аминокислот. Анализ аминокис-
лот может быть использован для количественно-
го определения белков и пептидов, определения 
подлинности белков или пептидов на основе их 
аминокислотного состава, структурного анали-
за белков и пептидов, для оценки стратегий рас-
щепления для пептидных остатков и для обна-
ружения атипичных аминокислот, которые могут 
присутствовать в белках или пептидах. Перед 
анализом аминокислот необходимо гидроли-
зовать белки/пептиды до получения отдельных 
аминокислотных составляющих. После гидро-
лиза белков/пептидов процесс анализа амино-
кислот может быть таким же, как и для свобод-
ных аминокислот в других лекарственных сред-
ствах. Аминокислотные составляющие испытуе-
мого образца обычно подвергаются химической 
модификации (или дериватизации) для анализа.

ОБОРУДОВАНИЕ

Методы, используемые для анализа амино-

кислот, обычно основаны на хроматографиче-
ском разделении аминокислот, присутствующих 
в испытуемом образце. Современные методики 
анализа основаны на использовании автомати-
зированных хроматографических приборов для 
решения аналитических задач. В качестве при-
бора для анализа аминокислот обычно исполь-
зуют жидкостный хроматограф низкого или вы-
сокого давления, способный создавать гради-
ентное элюирование подвижной фазой, что обе-
спечивает разделение анализируемых амино-
кислот на хроматографической колонке. Если 
анализ образца не осуществляется с использо-
ванием предколоночной дериватизации, прибор 
должен иметь устройство для постколоночной 
дериватизации. В качестве детектора обычно 
используется спектрофотометрический детектор 
в ультрафиолетовой/видимой области или флу-

21

2.2.56. Анализ аминокислот

оресцентный детектор в зависимости от исполь-
зуемого метода дериватизации. Регистрирую-
щее устройство (например, интегратор) исполь-
зуется для преобразования аналогового сигнала 
из детектора и для проведения количественных 
вычислений. Предпочтительно, чтобы прибор 
использовался исключительно для анализа ами-
нокислот.

ОСНОВНЫЕ МЕРЫ 
ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

При выполнении анализа аминокислот ана-

литик всегда должен учитывать возможность 
фонового загрязнения. Необходима высокая 
степень чистоты реактивов (например, низкая 
чистота кислоты хлористоводородной может 
способствовать загрязнению глицина). Анали-
тические реактивы должны меняться регулярно 
каждые несколько недель, при этом должны ис-
пользоваться только растворители класса «для 
высокоэффективной жидкостной хроматогра-
фии (ВЭЖХ)». Возможное загрязнение микроор-
ганизмами и посторонними частицами, которые 
могут присутствовать в растворителях, устраня-
ется путем фильтрования этих растворителей 
перед применением, хранением растворителей 
в закрытых емкостях и проведением анализа с 
защитой от прямого солнечного света.

Качество анализа аминокислот определя-

ется лабораторной практикой. Приборы раз-
мещают в местах наименьшего передвиже-
ния персонала. Лабораторию содержат в чи-
стоте. Очищают и калибруют пипетки соглас-
но графику. Наконечники пипеток хранят в за-
крытой коробке; аналитикам не позволяется 
трогать их руками. Аналитик должен исполь-
зовать неприпудренные латексные или ана-
логичные перчатки. Ограничивают число от-
крытий и закрытий виалы с испытуемым об-
разцом, так как пыль может приводить к завы-
шению результатов по содержанию глицина, 
серина и аланина.

Для получения удовлетворительных ре-

зультатов анализа аминокислот прибор необ-
ходимо обслуживать надлежащим образом. 
Если прибор используется по стандартной про-
грамме, он должен ежедневно проверяться на 
отсутствие течи, на стабильную работу детек-
тора и ламп и на способность колонки поддер-
живать необходимую степень разделения ин-
дивидуальных аминокислот. Согласно графи-
ку проводят очистку или замену всех фильтров 
прибора и другое техническое обслуживание.

СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ

Необходимые стандартные образцы ами-

нокислот для проведения анализа аминокис-
лот коммерчески доступны и обычно представ-
ляют собой водный раствор смеси аминокис-
лот. При определении аминокислотного соста-
ва наряду с испытуемым образцом анализи-
руются стандартные образцы белков или пеп-

тидов, которые используются в качестве кон-
троля для подтверждения полноты всего про-
цесса. Для этой цели в качестве стандартного 
образца белка используют высокоочищенный 
бычий сывороточный альбумин.

ГРАДУИРОВКА ОБОРУДОВАНИЯ

Градуировка оборудования для анализа 

аминокислот обычно включает анализ стан-
дартного образца аминокислот, который со-
стоит из смеси аминокислот, при разных кон-
центрациях для определения величины откли-
ка и рабочего диапазона концентраций для 
каждой аминокислоты. Концентрация каждой 
аминокислоты в стандартном образце извест-
на. В процессе градуировки при выполнении 
анализа аминокислот стандартный образец 
разводят до различных концентраций анали-
зируемого вещества в пределах ожидаемой 
области линейности согласно используемой 
аналитической методике. Затем анализируют 
растворы с различными концентрациями ана-
лизируемого вещества. По оси ординат нано-
сят площади пиков каждой аминокислоты, а 
по оси абсцисс — соответствующие извест-
ные концентрации каждой аминокислоты с 
учетом разведений. Эти результаты позволя-
ют определить область концентраций амино-
кислот, в которой зависимость площади пика 
данной аминокислоты от ее концентрации яв-
ляется линейной функцией. Важно, чтобы об-
разцы для анализа аминокислот были приго-
товлены таким образом, чтобы концентрации 
аминокислот в этих образцах находились в 
пределах аналитических границ (т.е. в рабо-
чей линейной области) используемой методи-
ки с целью получения точных и воспроизводи-
мых результатов.

Для определения коэффициента откли-

ка каждой аминокислоты анализируют от 4 до 
6 концентраций стандартного образца. Коэф-
фициент отклика рассчитывается как сред-
няя площадь или высота пика в расчете на на-
номоль (10

-9

 моль) аминокислоты, представ-

ленной в стандартном образце. Коэффициен-
ты отклика каждой аминокислоты используют 
для расчета концентрации каждой аминокис-
лоты, представленной в испытуемом образце. 
Количество вещества (наномоль) анализируе-
мой аминокислоты рассчитывают путем деле-
ния площади пика, соответствующего данной 
аминокислоте, на коэффициент отклика этой 
аминокислоты. Для рутинного анализа может 
быть достаточно градуировки по одной точке; 
при этом градуировка по коэффициентам от-
клика каждой аминокислоты должна часто об-
новляться и проверятся для контроля досто-
верности.

ПОВТОРЯЕМОСТЬ

Полный анализ аминокислот требует от 

аналитической лаборатории контроля повторя-

22

емости результатов количественного определе-
ния. Во время хроматографического разделе-
ния аминокислот или их производных на хрома-
тограмме наблюдается множество пиков, отно-
сящихся к аминокислотам. Большое количество 
пиков делает необходимым наличие программ-
ного обеспечения, способного неоднократно 
идентифицировать пики, основываясь на вре-
мени удерживания, и интегрировать площади 
пиков для количественных расчетов. Типичная 
оценка повторяемости включает приготовление 
стандартного раствора аминокислот и анализ 
многократных повторных вводов пробы (напри-
мер, 6 или более повторных вводов) одного и 
того же стандартного раствора. Относительное 
стандартное отклонение (

RSD

) определяют для 

времени удерживания и интегрированной пло-
щади пика каждой аминокислоты. Оценку повто-
ряемости дополняют включением многократных 
количественных определений, проводимых в те-
чение нескольких дней разными аналитиками. 
Многократные количественные определения 
включают приготовление стандартных разве-
дений из исходных материалов для определе-
ния различий результатов, возникающих из-за 
манипуляций с образцом. При оценке повторя-
емости часто проводят анализ аминокислотно-
го состава стандартного образца белка (напри-
мер, бычий сывороточный альбумин). На основе 
оценки относительных стандартных отклонений 
(

RSD

) лаборатория рассчитывает аналитиче-

ские пределы для подтверждения того, что ана-
лизы в данной лаборатории проведены надле-
жащим образом. Для гарантирования наилуч-
ших результатов желательно установить наи-
меньшие практические пределы отклонений. 
Факторы, на которые следует обратить внима-
ние для уменьшения отклонений в результатах 
анализа аминокислот, включают приготовле-
ние образца, высокие фоновые спектральные 
помехи из-за качества реактивов и/или из-за ла-
бораторных манипуляций, работу и обслужива-
ние приборов, анализ и интерпретацию данных, 
профессиональные качества аналитика и его 
состояние. Все параметры, о которых идет речь, 
должны всесторонне исследоваться в рамках 
проведение валидации.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦА

Точные результаты анализа аминокислот 

требуют использования очищенных образцов 
белков и пептидов. Компоненты буфера (на-
пример, соли, мочевина, детергенты) могут по-
влиять на анализ аминокислот и должны уда-
ляться из образца перед анализом. Методики, 
которые используют постколоночную дерива-
тизацию аминокислот, обычно зависят от вли-
яния компонентов буфера в меньшей степени, 
чем методики с предколоночной дериватизаци-
ей. Для уменьшения потенциально возможно-
го фонового загрязнения, улучшения открыва-
емости анализируемого вещества и уменьше-

ния трудоемкости число операций с образцом 
желательно ограничить. Общие технические 
приемы, которые используются для удаления 
компонентов буфера из образцов белка, вклю-
чают следующие методы: (1) введение образ-
ца белка в обращенно-фазовую систему ВЭЖХ, 
удаление белка с помощью летучего раствори-
теля, содержащего достаточное количество ор-
ганического компонента, и высушивание образ-
ца в вакуумной центрифуге; (2) диализ с лету-
чим буферным раствором или водой; (3) уль-
трафильтрационное центрифугирование для 
замены буфера летучим буферным раствором 
или водой; (4) осаждение белка из буферно-
го раствора с использованием органического 
растворителя (например, ацетона); (5) гель-
фильтрация.

ВНУТРЕННИЕ СТАНДАРТЫ

В ходе аминокислотного анализа рекомен-

дуется использовать внутренний стандарт для 
контроля физических и химических потерь и ко-
лебаний результатов. Перед гидролизом к рас-
твору белка может быть прибавлено точно из-
вестное количество внутреннего стандарта. 
Открываемость внутреннего стандарта указы-
вает на общую открываемость аминокислот 
белкового раствора. Однако свободные амино-
кислоты ведут себя иначе, чем аминокислоты 
белка во время гидролиза, скорость высвобож-
дения которых всегда разная. Поэтому исполь-
зование внутреннего стандарта для введения 
поправки на потери в ходе гидролиза может 
давать ненадежные результаты, что необхо-
димо учитывать при их интерпретации. Вну-
тренние стандарты также могут быть добавле-
ны к смеси аминокислот после гидролиза для 
введения поправки на различия во введени-
ях пробы образца, на изменяющуюся стабиль-
ность реактивов и на отклонения скорости под-
вижной фазы. В идеальном случае в качестве 
внутреннего стандарта используют коммерче-
ски доступную аминокислоту, которая отлича-
ется от природных аминокислот. Кроме того, 
внутренний стандарт должен быть стабиль-
ным в ходе гидролиза, его коэффициент откли-
ка должен иметь линейную зависимость от кон-
центрации и выходить из хроматографической 
колонки со свойственным только этому стан-
дарту временем удерживания без перекрыва-
ния пиков других аминокислот. Наиболее часто 
используемые стандартные образцы амино-
кислот включают норлейцин, нитротирозин и 
α-аминомасляную кислоту.

ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ

Для анализа аминокислот белков и пепти-

дов необходимо проводить гидролиз. Лабора-
торная посуда, используемая для проведения 
гидролиза, должна быть очень чистой. Опу-
дривающий порошок перчаток, а также отпе-
чатки пальцев на посуде, в которой проводит-

23

2.2.56. Анализ аминокислот

ся гидролиз, могут привести к загрязнению. Для 
очистки стеклянных пробирок для проведения 
гидролиза используют кипячение в течение 1 ч в 
1 М растворе кислоты хлористоводородной или 
замачивание в концентрированной азотной кис-
лоте или в смеси из равных объемов концентри-
рованных хлористоводородной и азотной кислот. 
Чистые пробирки, используемые для гидролиза, 
промывают водой высокоочищенной, затем опо-
ласкивают метанолом для хроматографии, вы-
сушивают в течение ночи в сушильном шкафу и 
хранят в закрытом состоянии вплоть до исполь-
зования. Для удаления загрязнения из проби-
рок, которые используются для гидролиза, также 
можно использовать прокаливание чистой сте-
клянной посуды при температуре 500°С в те-
чение 4 ч. Допускается использование соответ-
ствующих одноразовых лабораторных принад-
лежностей.

Кислотный гидролиз является наиболее 

часто используемым методом для расщепле-
ния белка в образце перед анализом амино-
кислот. Метод кислотного гидролиза может по-
влиять на отклонение результатов анализа 
из-за полного или частичного разрушения не-
которых аминокислот: триптофан разрушается, 
серин и треонин частично разрушаются, мети-
онин может подвергаться окислению, а цисте-
ин обычно определяется как цистин (но откры-
ваемость цистина обычно низкая вследствие 
частичного разрушения или восстановления 
до цистеина). Применение соответствующего 
вакуума (менее 200 мкм ртутного столба, или 
26,7 Па) или введение инертного газа (аргона) 
в пространство реакционного сосуда может 
уменьшить степень окислительной деструкции. 
Пептидные связи изолейцин-изолейцин, валин-
валин, изолейцин-валин и валин-изолейцин 
расщепляются частично; аспарагин и глута-
мин дезамидируются с образованием соответ-
ственно аспарагиновой и глутаминовой кислот. 
Потеря триптофана, аспарагина и глутамина в 
ходе кислотного гидролиза ограничивает коли-
чественное определение до 17 аминокислот. 
Некоторые из описанных ниже методов кислот-
ного гидролиза используются для решения этих 
задач. Некоторые методы гидролиза (напри-
мер, методы 4—11) могут приводить к превра-
щениям в другие аминокислоты. Поэтому преи-
мущества использования конкретной методики 
оцениваются относительно задач, решаемых с 
ее помощью, и всесторонне изучаются перед 
выбором методики, отличающейся от обычного 
кислотного гидролиза.

Для определения исходной концентрации 

аминокислот, которые частично разрушаются 
или медленно отщепляются, часто использу-
ют исследование гидролиза во времени (анализ 
аминокислот при кислотном гидролизе в тече-
ние 24 ч, 48 ч и 72 ч). Путем построения графи-
ка зависимости найденной концентрации ча-
стично разрушающихся (лабильных) аминокис-

лот (например, серина и треонина) от времени 
гидролиза и экстраполяции полученной кривой к 
началу координат определяют исходную концен-
трацию этих аминокислот. Концентрацию остат-
ков аминокислот, которые медленно отщепля-
ются (например, изолейцин и валин), принима-
ют равной высоте плато на полученном графике 
зависимости концентрации остатков от времени 
гидролиза. Если гидролиз будет протекать слиш-
ком долго, концентрация аминокислот в образце 
начнет уменьшаться, что укажет на их разруше-
ние при данных условиях гидролиза.

Приемлемая альтернатива исследованию 

гидролиза во времени — подвергнуть стандарт 
аминокислот с известными концентрациями 
таким же условиям гидролиза, как и в случае с 
испытуемым образцом. Однако аминокислоты в 
свободном состоянии могут не в полной мере от-
ражать превращения, происходящие в ходе ги-
дролиза: степень разрушения лабильных ами-
нокислот, находящихся в составе пептидов или 
белков, и, в особенности, степень расщепле-
ния медленно расщепляемых связей (например, 
связи изолейцин-валин). Эта методика позволя-
ет аналитику учесть лишь некоторую часть раз-
рушающихся аминокислот. Возможно примене-
ние кислотного гидролиза с использованием ми-
кроволнового излучения, который отличается 
быстротой, но требует специального оборудова-
ния, а также специальных мер предосторожно-
сти. Оптимальные условия гидролиза с исполь-
зованием микроволнового излучения должны 
быть установлены для каждого отдельного бел-
кового/протеинового образца. Микроволновый 
гидролиз обычно протекает в течение несколь-
ких минут, но отклонение даже в одну минуту 
может привести к неудовлетворительным ре-
зультатам (например, неполный гидролиз или 
разрушение лабильных аминокислот). Полный 
протеолиз с применением смеси протеаз может 
быть слишком сложным, он требует надлежаще-
го контроля и обычно более подходит для пепти-
дов, чем для белков.

Для определения оптимальных условий 

в ходе первоначального анализа белка неиз-
вестного состава проводятся эксперименты с 
различными временами гидролиза и при разных 
температурных режимах.

МЕТОД 1

Для гидролиза используется кислота хлори-

стоводородная, содержащая фенол, — это наи-
более общая процедура, используемая для ги-
дролиза белка/пептида при анализе аминокис-
лот. Добавление фенола предупреждает реак-
цию галогенирования тирозина.

Гидролизный раствор

. 6 М кислота хлористо-

водородная, содержащая от 0,1 % до 1,0 % фенола.

Методика.

Жидкофазный гидролиз

. Образец белка 

или пептида помещают в гидролизную ампулу 

24

и высушивают (образец высушивают для того, 
чтобы вода в образце не разводила кислоту, ис-
пользуемую для гидролиза). Прибавляют гидро-
лизный раствор из расчета 200 мкл на 500 мкг 
лиофилизированного белка. Образец в ампуле 
замораживают в бане с сухим льдом и ацетоном 
и запаивают в вакууме при помощи пламени. 
Образцы обычно гидролизуют при температу-
ре 110°С в течение 24 ч в вакууме или в атмос-
фере инертного газа для предотвращения окис-
ления. Если есть подозрения, что испытуемый 
белок полностью не гидролизуется, рассматри-
вают возможность проведения гидролиза в те-
чение более длительного времени (например, 
48 ч и 72 ч).

Парофазный гидролиз.

 Это один из наибо-

лее общих методов кислотного гидролиза. Он 
предпочтителен для микроанализа, когда до-
ступны лишь небольшие количества образ-
ца. При использовании парофазного гидроли-
за контаминация образца кислотными реакти-
вами минимальна. Контейнеры с сухими образ-
цами помещают в сосуд, содержащий подходя-
щее количество гидролизного раствора. Гидро-
лизный раствор не должен контактировать с ис-
пытуемым образцом. В свободном пространстве 
сосуда используют атмосферу инертного газа 
или вакуум (менее 200 мкм ртутного столба, или 
26,7 Па) и для проведения гидролиза нагрева-
ют при температуре около 110°С в течение 24 ч. 
Пары кислоты гидролизуют сухой образец. Воз-
можность конденсации кислоты в контейнере с 
образцом должна быть сведена к минимуму. 
После гидролиза испытуемый образец высуши-
вают в вакууме до удаления остатков кислоты.

МЕТОД 2

Использование меркаптоэтансульфоновой 

кислоты в качестве восстанавливающей кисло-
ты уменьшает окисление триптофана в процес-
се гидролиза.

Гидролизный раствор

. 2,5 М раствор мер-

каптоэтансульфоновой кислоты.

Парофазный гидролиз

. От 1 мкг до 100 мкг 

испытуемого белка/пептида высушивают в ги-
дролизной ампуле. Гидролизную ампулу поме-
щают в большую ампулу, содержащую около 
200 мкл гидролизного раствора. Герметично 
запаивают большую ампулу в вакууме (около 
50 мкм ртутного столба, или 6,7 Па). Нагревают 
гидролизную ампулу до температуры от 170°С 
до 185°С в течение 12,5 мин. После гидролиза 
гидролизную ампулу высушивают в вакууме в те-
чение 15 мин до удаления остатков кислоты.

МЕТОД 3

Использование тиогликолевой кислоты 

(ТГК) в качестве восстанавливающей кислоты 
предотвращает окисление триптофана при ги-
дролизе.

Гидролизный раствор

. 7 М раствор кис-

лоты хлористоводородной, содержащий 1 

% 

фенола, 10 % кислоты трифторуксусной и 20 % 
кислоты тиогликолевой.

Парофазный гидролиз

. От 10 мкг до 

50 мкг испытуемого белка/пептида высушива-
ют в гидролизной ампуле. Гидролизную ампулу 
помещают в большую ампулу, содержащую 
около 200 мкл гидролизного раствора. Герме-
тично запаивают большую ампулу в вакууме 
(около 50 мкм ртутного столба, или 6,7 Па). На-
гревают гидролизную ампулу до температуры 
166°С в течение 15—30 мин. После гидролиза 
гидролизную ампулу высушивают в вакууме в 
течение 5 мин до удаления остатков кислоты. 
Окрываемость триптофана в этом методе за-
висит от количества испытуемого образца.

МЕТОД 4

Перед гидролизом белка проводят окисле-

ние цистеина/цистина и метионина кислотой 
надмуравьиной.

Окисляющий раствор

. Смешивают 1 

объем раствора пероксида водорода (30 %) и 9 
объемов кислоты муравьиной безводной и вы-
держивают при комнатной температуре в тече-
ние 1 ч. Полученную кислоту надмуравьиную 
используют свежеприготовленной.

Методика

. Образец белка/пептида раст-

воряют в 20 мкл кислоты муравьиной безво-
дной, нагревают при температуре 50°С в те-
чение 5 мин и прибавляют 100 мкл окисляю-
щего раствора. Процесс окисления проводят 
в течение 10—30 мин. В этой реакции цисте-
ин превращается в цистеиновую кислоту, а ме-
тионин — в метионин-сульфон. Избыток реак-
тива удаляют из образца при помощи вакуум-
ного центрифугирования. Окисленный белок 
может быть затем гидролизован по методу 1 
или методу 2. При наличии галогенидов эта 
методика может приводить к модификации 
остатков тирозина.

МЕТОД 5

Окисление цистеина/цистина происходит во 

время жидкофазного гидролиза с натрия азидом.

Гидролизный раствор

. К 6 М раство-

ру кислоты хлористоводородной, содержащей 
0,2 % фенола, прибавляют натрия азид до по-
лучения конечной концентрации 2 г/л. Прибав-
ление фенола предотвращает галогенирование 
тирозина.

Жидкофазный гидролиз

. Гидролиз белка/

пептида проводят при температуре около 110°С 
в течение 24 ч. Во время гидролиза присутству-
ющий в образце цистеин/цистин превращается в 
кислоту цистеиновую под воздействием натрия 
азида, содержащегося в гидролизном растворе. 
Эта методика приводит к лучшей открываемости 
тирозина, чем метод 4, но она не подходит для 
количественного определения метионина. Мети-
онин превращается в смесь из метионина и двух 
продуктов его окисления — метионинсульфокси-
да и метионин-сульфона.

25

2.2.56. Анализ аминокислот

МЕТОД 6

Окисление цистеина/цистина происходит 

под воздействием диметилсульфоксида (ДМСО).

Гидролизный раствор

. К раствору 6 М 

кислоты хлористоводородной, содержащей от 
0,1 % до 1,0 % фенола, прибавляют ДМСО до 
получения раствора с конечной концентрацией 
2 %  (

об/об

).

Парофазный гидролиз

. Гидролиз белка/

пептида проводят при температуре около 110°С 
в течение 24 ч. Во время гидролиза присутству-
ющий в образце цистеин/цистин превращает-
ся в кислоту цистеиновую под воздействием 
ДМСО, содержащегося в гидролизном растворе. 
С целью ограничения разброса данных и ком-
пенсации частичного разрушения рекомендует-
ся оценивать открываемость цистеиновой кис-
лоты при окислительном гидролизе стандарт-
ного образца белка, содержащего 1—8 остат-
ков цистеина. Коэффициент отклика гидролиза-
та белка/пептида обычно на 30 % ниже, чем для 
негидролизованного стандартного образца ци-
стеиновой кислоты. Так как гистидин, метионин, 
тирозин и триптофан также модифицируются, 
полный анализ состава при использовании этой 
методики невозможен.

МЕТОД 7

Восстановление и алкилирование цистеина/

цистина происходит при пиридилэтилировании в 
паровой фазе.

Восстанавливающий раствор

. 83,3 мкл 

пиридина, 16,7 мкл 4-винилпиридина, 16,7 мкл 
трибутилфосфина и 83,3 мкл воды помещают в 
подходящий контейнер и перемешивают.

Методика

. Гидролизную ампулу с образ-

цом белка/пептида (от 1 мкг до 100 мкг) поме-
щают в большую ампулу. Переносят восстанав-
ливающий раствор в большую ампулу, герметич-
но запаивают в вакууме (около 50 мкм ртутного 
столба, или 6,7 Па) и нагревают при температуре 
около 100°С в течение 5 мин. Затем внутреннюю 
гидролизную ампулу помещают в вакуумный 
эксикатор и высушивают в течение 15 мин для 
удаления остатков реактивов. Пиридилэтили-
рованный образец затем гидролизуют согласно 
описанной ранее методике. Для оценки открыва-
емости пиридилэтилцистеина параллельно про-
водят реакцию пиридилэтилирования стандарт-
ного образца белка, содержащего 1—8 остатков 
цистеина. Длительное время инкубации при ре-
акции пиридилэтилирования может быть при-
чиной модификации конечных α-аминогрупп и 
ε-аминогрупп лизина в белке.

МЕТОД 8

Восстановление и алкилирование цистеина/

цистина происходит при пиридилэтилировании в 
жидкой фазе.

Исходные растворы

. Готовят и фильтру-

ют 3 раствора: 1 М раствор трис-гидрохлорида с 
рН 8,5, содержащий 0,004 М динатрия эдетата 

(исходный раствор А); 8 М раствор гуанидина ги-
дрохлорида (исходный раствор В); и 10 % раст-
вор 2-меркаптоэтанола (исходный раствор С).

Восстанавливающий раствор

. Для полу-

чения буферного раствора 6 М раствора гуа-
нидина гидрохлорида в 0,25 М растворе трис-
гидрохлорида смешивают 1 объем исходного 
раствора А и 3 объема исходного раствора В.

Методика

. Около 10 мкг испытуемого об-

разца растворяют в 50 мкл восстанавливающего 
раствора и прибавляют около 2,5 мкл исходно-
го раствора С. Выдерживают при комнатной тем-
пературе в защищенном от света месте в атмос-
фере азота или аргона в течение 2 ч. Для про-
ведения реакции пиридинэтилирования к рас-
твору белка прибавляют около 2 мкл 4-винилпи-
ридина и выдерживают дополнительно 2 ч при 
комнатной температуре в защищенном от света 
месте. Обессоливают белок/пептид методом 
обращенно-фазовой ВЭЖХ, собирая белковую/
пептидную фракцию. Перед кислотным гидро-
лизом собранный образец может быть высушен 
при помощи вакуумного центрифугирования.

МЕТОД 9

Восстановление и алкилирование цистеина/

цистина происходит при карбоксиметилирова-
нии в жидкой фазе.

Исходные растворы

. Готовят как указано в 

Методе 8.

Карбоксиметилирующий раствор

. Готовят 

раствор 100 г/л йодацетамида в 96 % спирте.

Буферный раствор

. Используют восста-

навливающий раствор, приготовленный как ука-
зано в Методе 8.

Методика

. Испытуемый образец раство-

ряют в 50 мкл буферного раствора и прибав-
ляют около 2,5 мкл исходного раствора С. Вы-
держивают при комнатной температуре в защи-
щенном от света месте в атмосфере азота или 
аргона в течение 2 ч. Прибавляют карбоксиме-
тилирующий раствор в 1,5-кратном количестве 
от общего теоретического содержания тиолов, 
и выдерживают дополнительно в течение 
30 мин при комнатной температуре в защищен-
ном от света месте. Если содержание тиолов 
в белке неизвестно, прибавляют 5 мкл 0,1 М 
раствора йодацетамида на каждые 20 нано-
моль испытуемого образца белка. Для прекра-
щения реакции прибавляют избыток 2-меркап-
тоэтанола. Обессоливают белок/пептид мето-
дом обращенно-фазовой ВЭЖХ, собирая бел-
ковую/пептидную фракцию. Перед кислотным 
гидролизом собранный образец может быть вы-
сушен при помощи вакуумного центрифугиро-
вания. В процессе кислотного гидролиза полу-
ченный 

S

-карбоксиамидометилцистеин будет 

превращаться в 

S

-карбоксиметилцистеин.

МЕТОД 10

Цистеин/цистин, прореагировавший с ди-

тиогликолевой кислотой или дитиодипропионо-

26

вой кислотой, образует смешанный дисульфид. 
Выбор дитиогликолевой кислоты или дитио-
дипропионовой кислоты зависит от требуемого 
разделения при анализе аминокислот.

Восстанавливающий раствор

. Раствор 

10 г/л дитиогликолевой кислоты (или дитиоди-
пропионовой кислоты) в 0,2 М растворе натрия 
гидроксида.

Методика

. Около 20 мкг испытуемого образ-

ца помещают в гидролизную ампулу и прибав-
ляют 5 мкл восстанавливающего раствора. При-
бавляют 10 мкл изопропилового спирта и удаля-
ют всю жидкость из образца при помощи ваку-
умного центрифугирования. Образец гидроли-
зуют, используя метод 1. Преимущество данно-
го метода заключается в том, что другие остат-
ки аминокислот не участвуют в побочных реак-
циях, а образец не нуждается в обессоливании 
перед гидролизом.

МЕТОД 11

Аспарагин и глутамин в процессе кислот-

ного гидролиза превращаются в аспарагино-
вую кислоту и глутаминовую кислоту соответ-
ственно. Остатки аспарагина и аспарагиновой 
кислоты обозначают как 

Asx

, а остатки глута-

мина и глутаминовой кислоты обозначают как 

Glx

. Белки/пептиды могут реагировать с бис(1,1-

трифторацетокси)йодбензолом (

BTI

), превра-

щая при гидролизе остатки аспарагина и глута-
мина в остатки диаминопропионовой кислоты и 
диаминомасляной кислоты соответственно. Эти 
превращения позволяют определять в белке/
пептиде содержание аспарагина и глутамина в 
присутствии остатков аспарагиновой кислоты и 
глутаминовой кислоты.

Восстанавливающие растворы

. Готовят и 

фильтруют 3 раствора: 0,01 М раствор трифтор-
уксусной кислоты (раствор А); 5 М раствор гуа-
нидина гидрохлорида, содержащий 0,01 М три-
фторуксусной кислоты (раствор В); свежеприго-
товленный раствор диметилформамида, содер-
жащий 36 мг/мл 

BTI

 (раствор С).

Методика

. Около 200 мкг испытуемого об-

разца помещают в чистую гидролизную ампулу 
и прибавляют 2 мл раствора А или раствора В 
и 2 мл раствора С. Герметично запаивают ги-
дролизную ампулу в вакууме. Испытуемый об-
разец нагревают при температуре 60°С в тече-
ние 4 ч в защищенном от света месте. Затем об-
разец диализируют водой для удаления избытка 
реактивов. Диализированный образец трижды 
экстрагируют равными объемами бутилацетата 
и лиофилизируют. Белок может быть затем ги-
дролизован согласно описанной ранее методи-
ке. Остатки α,β-диаминопропионовой кислоты и 
α,γ-диаминомасляной кислоты обычно не отде-
ляются от остатков лизина ионообменной хро-
матографией, используемой при анализе ами-
нокислот. Таким образом, при использовании 
ионного обмена в качестве метода разделения 
при анализе аминокислот содержание аспара-

гина и глутамина представляет собой разницу 
между количественным содержанием аспара-
гиновой кислоты и глутаминовой кислоты, по-
лученным при кислотном гидролизе без дери-
ватизации и полученным при кислотном гидро-
лизе с 

BTI

-дериватизацией. Количественное со-

держание треонина, метионина, цистеина, ти-
розина и гистидина может быть изменено при 

BTI

-дериватизации; при необходимости опре-

деления этих аминокислотных остатков белка/
пептида следует проводить гидролиз без 

BTI

-

дериватизации.

МЕТОДОЛОГИЯ АНАЛИЗА 
АМИНОКИСЛОТ: ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

Существует множество способов анали-

за аминокислот. Выбор конкретного спосо-
ба часто определяется требуемой чувстви-
тельностью количественного определения. В 
целом около половины применяемых спосо-
бов анализа аминокислот основаны на разде-
лении свободных аминокислот посредством 
ионообменной хроматографии с последую-
щей постколоночной дериватизацией (напри-
мер, с нингидрином или 

о

-фталевым альдеги-

дом). Метод постколоночной дериватизации 
может быть использован для образцов, со-
держащих небольшое количество буферных 
компонентов (таких как соли и мочевина) и 
обычно требует от 5 мкг до 10 мкг испытуемого 
образца белка для проведения одного анали-
за. Остальные способы анализа аминокислот 
обычно включают предколоночную деривати-
зацию свободных аминокислот (например, с 
фенилизотиоцианатом; с 6-аминохинолил-

N

-гидроксисукцинимидилкарбаматом или 

о-

фталевым альдегидом; с (диметиламино)-

азобензолсульфонилхлоридом; с 9-фтор-
енилметилхлорформиатом; с 7-фтор-4-нитро-
бензо-2-окса-1,3-диазолом) с последующим 
обращенно-фазовым ВЭЖХ анализом. Метод 
предколоночной дериватизации отличается 
высокой чувствительностью (обычно требу-
ется от 0,5 мкг до 1,0 мкг испытуемого образ-
ца белка для проведения одного анализа), 
однако на него могут оказывать влияние ком-
поненты солевого буфера, содержащиеся в 
испытуемом образце. В результате предколо-
ночной дериватизации могут образовываться 
множественные производные одной амино-
кислоты, что приводит к усложнению интер-
претации результатов.

Для количественного анализа аминокис-

лот могут быть использованы приведенные 
ниже методы. Приборы и реактивы для прове-
дения этих испытаний коммерчески доступны. 
Кроме того, многие из этих методов имеют мо-
дификации с различным приготовлением ре-
активов, проведением химических реакций, 
различными хроматографическими система-
ми и так далее. Специфические параметры 
могут отличаться в зависимости от конкретно-

27

2.2.56. Анализ аминокислот

го оборудования и методики выполнения ана-
лиза. Многие лаборатории используют более 
одной методики анализа аминокислот, так как 
каждая из них имеет свои преимущества. В 
каждой из этих методик аналоговый сигнал 
обнаруживается с помощью детектора, а пло-
щади пиков используются для количественно-
го определения.

МЕТОД 1. ПОСТКОЛОНОЧНАЯ 
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С НИНГИДРИНОМ

Ионообменная хроматография с постколо-

ночной дериватизацией с нингидрином является 
одним из наиболее распространенных методов, 
предназначенных для количественного анали-
за аминокислот. Как правило, для анализа боль-
шинства сложных физиологических образцов 
пригодной является катионообменная система 
на основе ионов лития, а катионообменная си-
стема на основе ионов натрия используется для 
более простых смесей аминокислот, получен-
ных при гидролизе белков (обычно 17 аминокис-
лот). Разделение аминокислот на ионообмен-
ной колонке достигается подбором рН и ионной 
силы. Для улучшения разделения часто исполь-
зуют температурный градиент.

При взаимодействии аминокислоты с 

нингидрином образуется продукт с характер-
ным фиолетовым или желтым цветом. Ами-
нокислоты, за исключением иминокислот, об-
разуют продукт фиолетового цвета, имеющий 
максимум поглощения при 570 нм. Имино-
кислоты, такие как пролин, образуют продукт 
желтого цвета, имеющий максимум поглоще-
ния при 440 нм.

Продукты постколоночной реакции между 

нингидрином и элюируемыми из колонки ами-
нокислотами детектируются при длинах волн 
440 нм и 570 нм, а полученная хроматограм-
ма используется для определения аминокис-
лотного состава.

Предел обнаружения для большинства 

производных аминокислот обычно составля-
ет 10 пикомоль, а для производных пролина — 
50 пикомоль. Линейность отклика наблюдает-
ся в области 20—500 пикомоль с коэффици-
ентом корреляции более 0,999. Для получе-
ния удовлетворительных данных рекоменду-
ется перед гидролизом использовать образцы 
массой более 1 мкг.

МЕТОД 2. ПОСТКОЛОНОЧНАЯ 
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С О-ФТАЛЕВЫМ 
АЛЬДЕГИДОМ

о

-Фталевый альдегид (ОФА) реагирует с 

первичными аминами в присутствии тиольных 
соединений, образуя производные изоиндола с 
сильной флуоресценцией. Эта реакция исполь-
зуется для постколоночной дериватизации при 
анализе аминокислот методом ионообменной 
хроматографии. Условия разделения такие же, 
как указано в методе 1.

Для образования флуоресцирующих произ-

водных с ОФА вторичные амины (иминокисло-
ты, такие как пролин) предварительно окисляют 
натрия гипохлоритом или хлорамином Т.  В мето-
дике используются сильнокислотные катионооб-
менные колонки для разделения свободных ами-
нокислот с последующим постколоночным окис-
лением натрия гипохлоритом или хлорамином Т 
и постколоночной дериватизацией с использо-
ванием ОФА и тиольных соединений, таких как 

N

-ацетил-L-цистеин или 2-меркаптоэтанол. Дли-

тельное воздействие натрия гипохлорита или хло-
рамина Т не оказывает заметного влияния на де-
риватизацию первичных аминокислот.

Разделение аминокислот на ионооб-

менной колонке достигается подбором рН и 
ионной силы. После постколоночной дерива-
тизации элюируемых аминокислот с ОФА про-
дукты реакции проходят через флуориметри-
ческий детектор. Интенсивность флуоресцен-
ции ОФА-производных аминокислот измеряет-
ся при длине волны возбуждающего света 348 
нм и длине волны излучаемого света 450 нм.

Предел обнаружения для большинства 

ОФА-производных аминокислот обычно со-
ставляет несколько десятков пикомоль. Ли-
нейность отклика наблюдается в области от 
нескольких пикомоль до нескольких десятков 
наномоль. Для получения удовлетворитель-
ных данных рекомендуется перед гидролизом 
использовать образцы массой более 500 нг.

МЕТОД 3. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ 
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С 
ФЕНИЛИЗОТИОЦИАНАТОМ

Фенилизотиоцианат (ФИТЦ) реагиру-

ет с аминокислотами с образованием фе-
нилтиокарбамильных производных (ФТК-
производных), которые могут быть обна-
ружены с высокой чувствительностью при 
длине волны 254 нм. Предколоночная дери-
ватизация аминокислот с ФИТЦ проводит-
ся перед разделением смеси аминокислот 
методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ-
спектрофотометрическим детектированием.

После удаления реактива под вакуумом 

сухие замороженные производные аминокис-
лот могут храниться без заметной деструк-
ции в течение нескольких недель. Раствор 
пробы для введения может храниться в хо-
лодном месте в течение 3 дней без заметных 
изменений хроматографического отклика.

Разделение ФТК-производных аминокис-

лот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на 
колонках, заполненных октадецилсилилси-
ликагелем (С

18

) достигается путем подбора 

концентрации ацетонитрила и ионной силы 
буферного раствора. Элюируемые из колон-
ки ФТК-производные аминокислот определя-
ют при длине волны 254 нм.

Предел обнаружения для большинства ФТК-

производных аминокислот обычно составляет 1 

28

пикомоль. Линейность отклика наблюдается в об-
ласти 20—500 пикомоль с коэффициентом корре-
ляции более 0,999. Для получения удовлетвори-
тельных данных рекомендуется перед гидроли-
зом использовать образцы массой более 500 нг.

МЕТОД 4. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ 
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С 6-АМИНОХИНОЛИЛ-
N-ГИДРОКСИСУКЦИНИ-
МИДИЛКАРБАМАТОМ

Предколоночная дериватизация амино-

кислот с 6-аминохинолил-

N

-гидроксисукцини-

мидилкарбаматом (АХК) проводится перед 
разделением смеси аминокислот методом 
обращенно-фазовой ВЭЖХ. АХК реагирует с ами-
нокислотами с образованием стабильных флуо-
ресцирующих несимметричных производных мо-
чевины (АХК-аминокислот), которые легко под-
даются анализу методом обращенно-фазовой 
ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.

Разделение АХК-производных аминокис-

лот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на ко-
лонке С

18

 достигается подбором концентрации 

ацетонитрила и ионной силы буферного раст-
вора. Селективное флуоресцентное детекти-
рование производных при длине волны воз-
буждающего света 250 нм и при длине волны 
излучаемого света 395 нм допускает прямой 
ввод реакционной смеси без каких-либо су-
щественных поправок на основной флуорес-
цирующий побочный продукт — 6-аминохино-
лин. Избыток реактива быстро гидролизуется 
(t

1/2

 < 15 с) с образованием 6-аминохинолина, 

N

-гидроксисукцинимида и диоксида углерода, 

а через 1 мин дальнейшее образование про-
изводных не происходит. 

Раствор пробы АХК-аминокислот для вве-

дения может храниться при комнатной тем-
пературе в течение одной недели без замет-
ных изменений хроматографического отклика. 
Следовательно, АХК-аминокислоты облада-
ют более чем достаточной стабильностью для 
проведения круглосуточного автоматического 
хроматографического анализа.

Предел обнаружения для каждой амино-

кислоты, кроме цистеина, находится в области 
от 40 фемтомоль до 320 фемтомоль. Предел 
обнаружения для цистеина составляет около 
800 фемтомоль. Линейность отклика наблю-
дается в области 2,5—500 микромоль с коэф-
фициентом корреляции более 0,999. Для по-
лучения удовлетворительных данных реко-
мендуется перед гидролизом использовать 
образцы массой более 30 нг.

МЕТОД 5. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ 
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С О-ФТАЛЕВЫМ 
АЛЬДЕГИДОМ

Предколоночная дериватизация амино-

кислот с 

о-

фталевым альдегидом (ОФА) про-

водится перед разделением смеси аминокис-
лот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с 

флуориметрическим детектированием. Метод 
не позволяет определять аминокислоты, яв-
ляющиеся вторичными аминами (например, 
пролин).

ОФА в присутствии тиольных соединений 

реагирует с первичной аминогруппой, обра-
зуя производные изоиндола с сильной флуо-
ресценцией. В качестве тиольных соединений 
могут быть использованы 2-меркаптоэтанол и 
3-меркаптопропионовая кислота. ОФА не об-
ладает флуоресценцией и, следовательно, не 
образует мешающих пиков. Кроме того, его 
растворимость и стабильность в водном рас-
творе, наряду с высокой скоростью реакции, 
позволяет проводить автоматическую дерива-
тизацию с использованием автодозатора для 
смешивания испытуемого образца и реаген-
та. Основным недостатком ОФА является от-
сутствие у него способности реагировать со 
вторичными аминокислотами (например, про-
лином). Компенсировать данный недостаток 
можно сочетанием с методиками, описанными 
в методах 7 или 8.

Предколоночная дериватизация амино-

кислот с ОФА используется для пробоподго-
товки перед обращенно-фазовой ВЭЖХ. Так 
как ОФА-производные аминокислот неустой-
чивы, анализ и разделение методом ВЭЖХ 
проводят немедленно после дериватизации. 
Хроматограф для жидкостной хроматографии 
должен быть оборудован флуометрическим 
детектором для обнаружения производных 
аминокислот. Интенсивность флуоресценции 
ОФА-производных аминокислот измеряют при 
длине волны возбуждающего света 348 нм и 
длине волны излучаемого света 450 нм.

Заявленный предел обнаружения при 

флуориметрическом детектировании не ниже 
50 фемтомоль, однако на практике предел об-
наружения составляет 1 пикомоль.

МЕТОД 6. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ 
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С (ДИМЕТИЛАМИНО)-
АЗОБЕНЗОЛСУЛЬФОНИЛХЛОРИДОМ

Предколоночная дериватизация ами-

нокислот с (диметиламино)азобензолсуль-
фонилхлоридом (ДАБС) проводится перед 
разделением смеси аминокислот методом 
обращенно-фазовой ВЭЖХ со спектрофото-
метрическим детектированием в видимой об-
ласти спектра.

ДАБС является хромофорным реактивом 

и используется для маркировки аминокислот. 
Аминокислоты, маркированные ДАБС (ДАБС-
аминокислоты), обладают высокой стабиль-
ностью и проявляют максимум поглощения 
при 436 нм.

ДАБС-аминокислоты всех встречаю-

щихся в природе производных аминокислот 
могут быть разделены на колонке С

18

 мето-

дом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использова-
нием градиентного элюирования и подвижной