ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год)

концентрации комплекса гепарина с АТ. Фактор Ха нейтрализуется комплексом

гепарина с АТ, а его избыток гидролизует специфический хромофорный пептидный

субстрат с высвобождением хромофора. Количество хромофора обратно

пропорционально активности гепарина.

Хромогенный субстрат фактора Ха. Специфический хромогенный

субстрат для фактора Ха, например N-бензоил-L-изолейцил-L-глутамил-глицил-L-

аргинина 4-нитроанилида гидрохлорид. Субстрат восстанавливают в соответствии с

указаниями изготовителя.

Буфер для разведений. Раствор трис-(гидроксиметил)-аминометана R

концентрацией

6,05 г/л. При необходимости доводят значение рН до

8,4

добавлением хлористоводородной кислоты R.

Испытуемый раствор. Испытуемый препарат разбавляют буфером для

разведений, получая раствор с ожидаемым содержанием 0,1 МЕ/мл.

Стандартный раствор. Препарат сравнения разбавляют буфером для

разведений, получая раствор с ожидаемым содержанием 0,1 МЕ/мл.

Нижеописанные условия определения относятся к титрационным

микропланшетам. Если определение производят в пробирках, объемы могут

изменяться при условии неизменности соотношений компонентов в смесях.

Перед началом испытания все растворы быстро нагревают на водяной бане

до 37⁰С.

В ряд ячеек распределяют по 20 мкл нормальной человеческой плазмы и по

20 мкл раствора антитромбина III R1. Добавляют в ячейки ряда 20, 60, 100 и 140

мкл испытуемого или стандартного раствора и доводят объемы в каждой из ячеек до

200 мкл с использованием буфера для разведений (содержание гепарина в конечной

смеси 0,02-0,08 МЕ/мл).

Метод конечной точки. По 40 мл содержимого каждой из ячеек переносят во

второй ряд ячеек, добавляют по 20 мкл раствора бычьего фактора Ха R и

инкубируют при

37⁰С в течение

30 секунд. Добавляют по

40 мкл раствора

хромогенного субстрата фактора Ха концентрацией 1 ммоль/л и инкубируют при

37⁰С в течение

3 минут. Реакцию прерывают путем снижения показателя рН

добавлением походящего реагента, например, раствора ледяной уксусной кислоты

R концентрацией 20 объемных процентов, и определяют оптическую плотность при

длине волны 405 нм (2.2.25). Обычно подходящей является продолжительность

реакции от 3 до 15 минут, но допускаются отклонения от этого интервала при

условии получения лучшей линейности зависимости отклика от дозы.

Кинетический метод. По 40 мл содержимого каждой из ячеек переносят во

второй ряд ячеек, добавляют по 20 мкл раствора бычьего фактора Ха R и

инкубируют при

37⁰С в течение

30 секунд. Добавляют по

40 мкл раствора

хромогенного субстрата фактора Ха концентрацией 2 ммоль/л, инкубируют при 37⁰С

и регистрируют скорость расщепления субстрата путем постоянного измерения

оптической плотности при длине волны 405 нм (2.2.25), определяя таким образом

начальную скорость расщепления субстрата. Это значение должно находиться в

линейной зависимости от остаточной концентрации фактора Ха.

Проверяют достоверность определения и вычисляют активность гепарина в

испытуемом препарате с использованием обычных статистических методов,

подходящих для анализа результатов измерения углов наклона (например, 5.3.

Статистический анализ результатов биологических испытаний и

количественных определений).

2.7.13. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АНТИ-D-

ИММУНОГЛОБУЛИНА

МЕТОД А

Активность человеческого анти-D-иммуноглобулина определяют путем

сравнения количества препарата, необходимого для агглютинации D-положительных

эритроцитов с количеством препарата сравнения, калиброванного в Международных

Единицах, необходимым для получения того же эффекта.

За Международную Единицу принимают активность установленного

количества

Международного

Стандартного

Образца.

Эквивалентность

Международного Стандартного Образца в Международных Единицах

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец человеческого анти-D-иммуноглобулина BRP

калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом

и предназначен для использования в количественных определениях человеческого

анти-D-иммуноглобулина.

Используют пул D-положительных эритроцитов, собранных не более чем за 7

дней до испытания, хранившихся соответствующим образом и полученных не менее

чем от четырех групп доноров с группой 0 R₁R₁. К подходящему объему клеток,

предварительно трижды промытых раствором натрия хлорида R концентрацией 9

г/л, добавляют равный объем раствора бромелайна R, выдерживают при 37⁰С в

течение 10 минут, центрифугируют, отделяют супернатант и промывают трижды

раствором натрия хлорида R концентрацией

9 г/л.

20 объемов эритроцитов

суспендируют в смеси 15 объемов инертной сыворотки, 20 объемов раствора

бычьего альбумина R концентрацией 300 г/л и 45 объемов раствора натрия

хлорида R концентрацией 9 г/л. Полученную суспензию охлаждают ледяной водой

при постоянном перемешивании.

С использованием калиброванного автоматического прибора для разведения

и раствора для разведений, содержащего 5 г/л бычьего альбумина R и 9 г/л натрия

хлорида R, готовят подходящие разведения испытуемого препарата и препарата

сравнения.

Определение обычно проводят по изложенной ниже методике, используя

соответствующий прибор для непрерывного автоматического гемолитического

анализа. Температуру в трубопроводе, кроме инкубационных ячеек, поддерживают

на уровне 15,0⁰С. Вводят с помощью насоса в трубопровод аппарата суспензию

эритроцитов со скоростью

0,1 мл/мин и раствор метилцеллюлозы

450 R

концентрацией 3 г/л со скоростью 0,05 мл/мин. В течение 2 минут со скоростью 0,1

мл/мин вводят разведения испытуемого препарата и препарата сравнения. Перед

введением очередного разведения вводят в течение 4 минут со скоростью 0,1

мл/мин раствор для разведений.

Вводят воздух со скоростью 0,6 мл/мин. Инкубируют при 37⁰С в течение 18

минут, после чего рассеивают столбики эритроцитов путем введения со скоростью

1,6 мл/мин раствора натрия хлорида R концентрацией

9 г/л, содержащего

подходящий увлажняющий агент (например, полисорбат 20 R в окончательной

концентрации 0,2 г/л) для предотвращения разрушения аппликаций. После оседания

агглютинатов дважды декантируют: вначале со скоростью 0,4 мл/мин, затем - со

скоростью

0,6 мл/мин. Эритроциты, не подвергшиеся агглютинации, лизируют

раствором, содержащим 5 г/л октоксинола 10 R, 0,2 г/л калия феррицианида R, 1

г/л натрия гидрокарбоната R и 0,05 г/л калия цианида R и подаваемым со

скоростью 2,5 мл/мин. Система включает петлю для получения десятиминутной

задержки, необходимой для конверсии гемоглобина. Оптическую плотность (2.2.25)

гемолизата регистрируют непрерывно при длине волны, выбранной в интервале от

540 до

550 нм. Определяют диапазон концентраций антител, на протяжении

которого существует линейная зависимость между концентрацией и полученным

изменением оптической плотности (DА). Исходя из полученных результатов, строят

градуировочную кривую, участок линейности которой используют для определения

активности испытуемого препарата.

Активность испытуемого препарата вычисляют с использованием обычных

статистических методов (5.3).

МЕТОД В

Активность человеческого анти-D-иммуноглобулина определяют методом

конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа, производимого на

титрационных микропланшетах, покрытых эритроцитами. Метод основан на

конкурентном связывании между поликлональным препаратом анти-D-

иммуноглобулина и биотинированными моноклональными анти-D-антителами,

направленными против специфического эпитопа D-антигена. Активность

испытуемого препарата сравнивают с препаратом сравнения, калиброванным в

Международных Единицах.

За Международную Единицу принимают активность установленного

количества

Международного

Стандартного

Образца.

Эквивалентность

Международного Стандартного Образца в Международных Единицах

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец человеческого анти-D-иммуноглобулина BRP

калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом

и предназначен для использования в количественных определениях человеческого

анти-D-иммуноглобулина.

МАТЕРИАЛЫ

Реагенты, для которых нет особых указаний, должны быть аналитической

степени чистоты.

СФБ (раствор хлорида натрия в фосфатном буфере). 8,0 г натрия хлорида

R, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата R, 0,2 г калия хлорида R, 0,2 г калия

дигидрофосфата R и 0,2 г натрия азида R растворяют в воде R и разбавляют до

1000 мл тем же растворителем.

СТБ (раствор хлорида натрия в трис-буфере). 8,0 г натрия хлорида R и 0,6 г

трис-(гидроксиметил)-аминометана R растворяют в воде R. Доводят значение рН

до 7,2 (2.2.3) с помощью 1 М хлористоводородной кислоты и разбавляют до 1000

мл тем же растворителем.

Раствор папаина. Раствор готовят перемешиванием при 37⁰С в течение 30

минут 1 г папаина R в 10 мл 0,067 М фосфатного буферного раствора рН 5,4 R,

центрифугированием при 10000 g в течение 5 минут и фильтрованием через

мембрану с размером пор 0,22 мкм. Для активации смешивают 1 мл фильтрата, 1 мл

раствора L-цистеина R концентрацией 48,44 г/л и 1 мл раствора натрия эдетата R

концентрацией 3,72 г/л и разбавляют до 10 мл 0,067 М фосфатным буферным

раствором рН 5,4 R. Аликвоты замораживают при температуре -20⁰С и ниже.

Эритроциты. Используют пул D-положительных эритроцитов, полученных не

менее чем из трех групп доноров с группой 0 R₁R₁. Клетки промывают четырежды

СФБ. Центрифугируют при 1800 g в течение 5 минут, смешивают подходящий объем

предварительно нагретых упакованных клеток с подходящим объемом

предварительно нагретого раствора папаина

(объемное соотношение 2:1 было

найдено подходящим) и инкубируют при 37⁰С в течение 10 минут. Клетки промывают

четырежды СФБ. Хранят при 4⁰С с подходящим стабилизатором не более недели.

Биотинированный Brad-5. Используют в соответствии с инструкциями.

Щелочной авидин-стрептавидиновый реагент, связанный с фосфатазой.

Предпочтительно использовать модифицированный реагент, сочетающий высокую

специфическую активность с низким уровнем неспецифического связывания.

Используют в соответствии с инструкциями.

Раствор субстрата. Используют в соответствии с инструкциями пара-

нитрофенилфосфат.

Буфер для фиксации клеток. 18,02 г глюкозы R, 4,09 г натрия хлорида R,

1,24 г борной кислоты R, 10,29 г натрия цитрата R и 0,74 г натрия эдетата R

растворяют в воде R. Доводят показатель рН (2.2.3) до 7,2-7,3 добавлением 1 М

раствора натрия гидроксида или 1 М хлористоводородной кислоты и разбавляют

водой R до 1000 мл. Хранят при температуре 4⁰С. Используют непосредственно из

места хранения.

Раствор глутарового альдегида. Непосредственно перед применением 90

мкл раствора глутарового альдегида R концентрацией 250 г/л добавляют к 24 мл

холодного СФБ.

Титрационные микропланшеты. Планшеты, предназначенные для покрытия

эритроцитами, представляют собой плоскодонные планшеты из полистирола со

свойствами поверхности, оптимизированными для иммуноферментного анализа и с

большой емкостью в отношении связывания с белками. Планшеты, используемые

для приготовления разведений иммуноглобулина, представляют собой планшеты из

полистирола или поливинилхлорида с U- или V-образными формами ячеек.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Готовят 0,1% (по объему) суспензию обработанных папаином эритроцитов в

холодном буфере для фиксации клеток. В каждую ячейку плоскодонного

титрационного микропланшета помешают по 50 мкл суспензии.

Планшет центрифугируют при 350 g в течение 3 минут, предпочтительно, при

4⁰С. Не удаляя супернатант, к содержимому каждой из ячеек осторожно добавляют

по 100 мкл раствора глутарового альдегида и выдерживают в течение 10 минут.

Содержимое ячеек сливают путем быстрого переворачивания планшета и трижды

промывают каждую ячейку 250-300 мкл СФБ. Эта операция может производиться

либо вручную, либо с использованием автоматического устройства для промывания

планшетов. Планшет либо используют в нижеописанном испытании, либо после

сливания СФБ, добавления в каждую ячейку 100 мкл буфера для фиксации клеток и

запечатывания пластиковой пленкой хранят при 4⁰С не более 1 месяца.

Испытуемые растворы. В случае лиофильно высушенных препаратов их

восстанавливают в соответствии с указаниями на этикетке. Готовят в четырех

независимых повторностях

5 серийных двукратных разведений, начиная с

концентрации

30 МЕ/мл с использованием СФБ, содержащего 10 г/л бычьего

альбумина R. При необходимости, исходное разведение корректируют с целью

получения откликов, попадающих в область линейности графика зависимости

отклика от дозы.

Растворы сравнения. Восстанавливают препарат сравнения в соответствии с

указаниями на этикетке. Готовят в четырех независимых повторностях 5 серийных

двукратных разведений, начиная с концентрации 30 МЕ/мл с использованием СФБ,

содержащего 10 г/л бычьего альбумина R.

В ячейки каждого из рядов титрационного микропланшета с U- или V-

образными формами ячеек вносят по 35 мкл каждого из разведений испытуемого

раствора или раствора сравнения. К содержимому каждой из ячеек добавляют по 35

мкл биотинированного Brad-5 с содержанием 250 нг/мл.

Освобождают ячейки планшета, покрытого эритроцитами, путем

переворачивания и высушивания бумажным полотенцем. Добавляют по 250 мкл

СФБ, содержащего

20 г/л бычьего альбумина R и оставляют при комнатной

температуре на 30 минут.

Освобождают ячейки планшета, покрытого эритроцитами, путем

переворачивания и высушивания бумажным полотенцем и помещают в каждую из

ячеек по 50 мкл каждого из разведений испытуемого раствора и раствора сравнения,

содержащих биотинированный Brad-5. 50 мкл СФБ, содержащего 10 г/л бычьего

альбумина R, используют в качестве отрицательного контроля. Планшет

запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при комнатной температуре в

течение 1 часа.

Удаляют жидкость из ячеек планшета, покрытого эритроцитами, и трижды

промывают каждую ячейку 250-300 мкл СТБ.

Щелочной авидин-стрептавидиновый реагент, связанный с фосфатазой,

разбавляют СТБ, содержащим

10 г/л бычьего альбумина R и добавляют в

количестве по 50 мкл в каждую из ячеек. Инкубируют в течение 30 минут при

комнатной температуре.

Удаляют жидкость из ячеек планшета, покрытого эритроцитами, и трижды

промывают каждую ячейку 250-300 мкл СТБ.

В каждую из ячеек добавляют по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в

темноте при комнатной температуре в течение 10 минут. Для остановки реакции в

каждую из ячеек добавляют по 50 мкл 3 М раствора натрия гидроксида.

Измеряют значения оптической плотности при длине волны

405 нм и

вычитают значение, полученное для отрицательного контроля. Значения оптической

плотности в области линейности кривой титрования используют для оценки

активности испытуемого препарата с использованием обычных статистических

методов (5.3).

МЕТОД С

Активность человеческого анти-D-иммуноглобулина определяют методом

поточной цитометрии в формате титрационного микропланшета. Метод основан на

специфическом связывании между анти-D-иммуноглобулином и В-положительными

эритроцитами. Активность испытуемого препарата сравнивают с препаратом

сравнения, калиброванным в Международных Единицах.

За Международную Единицу принимают активность установленного

количества

Международного

Стандартного

Образца.

Эквивалентность

Международного Стандартного Образца в Международных Единицах

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец человеческого анти-D-иммуноглобулина BRP

калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом

и предназначен для использования в количественных определениях человеческого

анти-D-иммуноглобулина.

МАТЕРИАЛЫ

Реагенты, для которых нет особых указаний, должны быть аналитической

степени чистоты.

СФБ. 8,0 г натрия хлорида R, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата R, 0,2

г калия хлорида R,

0,2 г калия дигидрофосфата R и 0,2 г натрия азида R

растворяют в воде R и разбавляют до 1000 мл тем же растворителем.

Раствор СФБ-БСА. СФБ, содержащий 10,0 г/л бычьего альбумина R.

Эритроциты. Используют D-положительные эритроциты, полученные из

группы доноров с группой 0 R₁R₁ не более, чем за две недели до определения. При

необходимости хранят с соответствующим стабилизатором при

4⁰С. Клетки

промывают не менее двух раз раствором СФБ-БСА и готовят суспензию,

содержащую 1¥104, но не более

5¥104 клеток в микролитре с использованием

раствора СФБ-БСА.

Используют D-отрицательные эритроциты, полученные из группы доноров с

группой 0 rr и подготовленные аналогичным образом.

Вторичные антитела. Используют подходящий фрагмент анти-IgG-антитела,

связанный с флуоресцентным красителем, обладающий специфичностью в

отношении человеческого IgG или его частей. Хранят и используют в соответствии с

инструкциями изготовителя.

Титрационные микропланшеты. Используют плоскодонные планшеты без

поверхностной обработки для иммуноферментного анализа.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Испытуемые растворы. В случае лиофильно высушенных препаратов их

восстанавливают в соответствии с указаниями на этикетке. Готовят не менее чем в

трех независимых повторностях не менее трех серийных полутора- или двукратных

разведений, начиная с концентрации в диапазоне 1,2-0,15 МЕ/мл с использованием

раствора СФБ-БСА. При необходимости, исходное разведение корректируют с

целью получения откликов, попадающих в область линейности графика зависимости

отклика от дозы.

Растворы сравнения. Восстанавливают препарат сравнения в соответствии с

указаниями на этикетке. Готовят не менее чем в трех независимых повторностях не

менее трех серийных полутора- или двукратных разведений, начиная с

концентрации в диапазоне 1,2-0,15 МЕ/мл с использованием раствора СФБ-БСА.

При необходимости, исходное разведение корректируют с целью получения

откликов, попадающих в область линейности графика зависимости отклика от дозы.

В каждую ячейку титрационного микропланшета распределяют по 50 мкл D-

положительных эритроцитов. К содержимому ячеек каждого ряда добавляют по 50

мкл каждого из разведений испытуемого раствора или раствора сравнения.

Используют 50 мкл раствора СФБ-БСА в качестве отрицательного контроля. По 50

мкл D-отрицательных эритроцитов распределяют в четыре ячейки того же

микропланшета и добавляют по 50 мкл наименьшего разведения испытуемого

препарата. Для отслеживания ложных реакций распределяют по

50 мкл D-

положительных эритроцитов в четыре ячейки того же микропланшета и добавляют

по 50 мкл раствора СФБ-БСА. Запечатывают пластиковой пленкой и инкубируют при

37⁰С в течение 40 минут.

Планшеты центрифугируют при

50 g в течение

3 минут, отбрасывают

супернатант и промывают ячейки

200-250 мкл раствора СФБ-БСА. Повторяют

промывку еще не менее одного раза.

Планшеты центрифугируют при

50 g в течение

3 минут, отбрасывают

супернатант и добавляют по 50 мкл вторичного антитела, разбавленного раствором

СФБ-БСА до подходящей концентрации белка. Запечатывают пластиковой пленкой и

инкубируют при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 20

минут.

Планшеты центрифугируют при

50 g в течение

3 минут, отбрасывают

супернатант и промывают ячейки

200-250 мкл раствора СФБ-БСА. Повторяют

промывку еще не менее одного раза.

Планшеты центрифугируют при

50 g в течение

3 минут, клетки

ресуспендируют в 200-250 мкл раствора СФБ-БСА.

Суспензию клеток переносят в трубку, совместимую с имеющимся

оборудованием для поточной цитометрии, и проводят дальнейшее разбавление

добавлением СФБ для обеспечения подходящей скорости потока.

Немедленно приступают к измерению медианной интенсивности

флуоресценции в поточном цитометре. Регистрируют не менее 10000 событий без

гейтинга, но с исключением шумов.

С использованием медианной интенсивности флуоресценции в области

линейности кривой зависимости отклика от дозы оценивают активность испытуемого

препарата обычными статистическими методами (5.3).

2.7.14. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕННОЙ (ИММУНОГЕННОЙ)

АКТИВНОСТИ ВАКЦИНЫ ГЕПАТИТА А

Количественное определение вакцины гепатита А производят либо in vivo,

путем сравнения ее способности приводить в данных условиях к образованию

специфических антител у мышей с такой же способностью препарата сравнения,

либо in vitro, путем иммунохимического определения содержания антигена.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VIVO

Испытание на мышах, описанное ниже, приводится в качестве примера

подходящего для данной вакцины метода; могут использоваться и другие методы с

подтвержденной достоверностью.

Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют

здоровых мышей подходящей линии из одной партии, возрастом около 5 недель.

Используют животных одного пола. Животных делят не менее чем на семь равных

групп; количество мышей в группе должно быть подходящим для выполнения

требований испытания.

Определение антигенной активности испытуемой вакцины. Готовят не

менее трех серийных разведений испытуемой вакцины и соответствующие

разведения препарата сравнения с использованием раствора натрия хлорида R

концентрацией 9 г/л, содержащего алюминийсодержащий адъювант, используемый

в вакцине. Каждое разведение назначают одной из групп мышей, каждой из которых

вводят подкожно не более

1,0 мл этого разведения. Контрольной

невакцинированной группе вводят подкожно такой же объем раствора натрия

хлорида R концентрацией 9 г/л, содержащего адъювант, используемый в вакцине.

Через

28-32 дня всех животных анестезируют и производят забор крови.

Индивидуальные сыворотки хранят отдельно друг от друга. Выполняют

количественное определение специфических антител к вирусу гепатита А в

индивидуальных сыворотках, используя подходящий иммунохимический метод

(2.7.1).

Вычисления. Вычисления проводят обычными статистическими методами,

используемыми для количественных определений с конечным числом возможных

результатов (5.3).

Из распределения уровней реакции, измеренных для всех сывороток группы

невакцинированных животных определяют максимальный ожидаемый уровень

реакции невакцинированного животного в данном количественном определении. При

получении отклика, превышающего этот уровень, у вакцинированного животного, его

по определению считают результатом сероконверсии.

Производят подходящее преобразование (например, пробит-преобразование)

процентной численности животных с обнаруженной сероконверсией в каждой из

групп и анализируют данные в соответствии с моделью параллельных линий

логарифмической зависимости дозы от отклика. Активность препарата определяют

относительно препарата сравнения.

Условия достоверности. Результаты испытания являются достоверными,

если:

- как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, ED₅₀ заключена в

интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными

животным,

- при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и

параллельности,

- границы доверительного интервала относительной активности находятся между

33% и 300% от оцененного значения активности.

Требования к активности. Верхняя граница доверительного интервала (Р =

0,95) оцениваемой относительной активности должна быть не менее 1,0.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VITRO

Выполняют иммунохимическое определение (2.7.1) содержания антигена с

критериями приемлемости, валидированными в сравнении с испытанием in vivo.

Критерии приемлемости для данного препарата сравнения подлежат утверждению

компетентными органами с учетом данных валидации.

2.7.15. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАКЦИНЫ ГЕПАТИТА В (RDNA)

Количественное определение вакцины гепатита B (rDNA) производят либо in

vivo, путем сравнения ее способности приводить в данных условиях к образованию

специфических антител против поверхностного антигена гепатита В

(HbsAg) у

мышей или морских свинок с такой же способностью препарата сравнения, либо in

vitro, путем иммунохимического определения содержания антигена.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VIVO

Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют

здоровых мышей из одной партии, возрастом около 5 недель. Используемая в

данном испытании линия мышей должна обеспечивать получение существенного

уклона кривой зависимости отклика от дозы в отношении антигена; подходящими

являются мыши гаплотипов H-2^q и H-2^d. Также могут использоваться здоровые

морские свинки из одной партии с массой тела от 300 до 350 г и возрастом около 7

недель. Используют животных одного пола. Животных делят не менее чем на семь

равных групп; количество в группе должно быть подходящим для выполнения

требований испытания.

Определение активности испытуемой вакцины. Готовят не менее трех

серийных разведений испытуемой вакцины и соответствующие разведения

препарата сравнения с использованием раствора натрия хлорида R концентрацией

9 г/л с добавлением алюминийсодержащего адъюванта, используемого в вакцине,

или другого подходящего растворителя. Каждое из полученных разведений

назначают одной из групп животных, каждому из которых вводят внутрибрюшинно не

более 1,0 мл этого разведения. Одну группу животных не вакцинируют, а вводят

внутрибрюшинно такой же объем растворителя. Через подходящий промежуток

времени (например, от 4 до 6 недель) всех животных анестезируют и производят

забор крови. Индивидуальные сыворотки хранят отдельно друг от друга. Выполняют

количественное определение специфических антител против HBsAg в

индивидуальных сыворотках, используя подходящий иммунохимический метод

(2.7.1).

Вычисления. Вычисления проводят обычными статистическими методами,

используемыми для количественных определений с конечным числом возможных

результатов (5.3).

Из распределения уровней реакции, измеренных для всех сывороток группы

невакцинированных животных, определяют максимальный ожидаемый уровень

реакции невакцинированного животного в данном количественном определении. При

получении отклика, превышающего этот уровень, у вакцинированного животного, его

по определению считают результатом сероконверсии.

Производят подходящее преобразование (например, пробит-преобразование)

процентной численности животных с обнаруженной сероконверсией в каждой из

групп и анализируют данные в соответствии с моделью параллельных линий

логарифмической зависимости дозы от отклика. Активность препарата определяют

относительно активности препарата сравнения.

Условия достоверности. Результаты испытания являются достоверными,

если:

- как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, ED₅₀ заключена в

интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными

животным,

- при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и

параллельности,

- границы доверительного интервала относительной активности находятся между

33% и 300% от оцененного значения активности.

Требования к активности. Верхняя граница доверительного интервала (Р =

0,95) оцениваемой относительной активности должна быть не менее 1,0.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ IN VITRO

Выполняют иммунохимическое определение (2.7.1) содержания антигена с

критериями приемлемости, валидированными в сравнении с испытанием in vivo.

Показано, что методы твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и

радиоиммунологического анализа

(РИА) с использованием моноклональных

антител, специфичных к индуцирующим защитную реакцию эпитопам HBsAg

являются подходящими. Используют соответствующее число разведений

испытуемой вакцины и препарата сравнения. Полученные данные, которые могут

быть подвергнуты преобразованию, анализируют методом параллельных линий.

Наборы для оценки HBsAg in vitro являются коммерчески доступными, и возможна

адаптация методов их использования для определения активности in vitro.

Критерии приемлемости для данного препарата сравнения подлежат

утверждению компетентными органами с учетом данных валидации.

2.7.16. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАКЦИНЫ КОКЛЮША

(БЕСКЛЕТОЧНОЙ)

Способность вакцины вызывать образование специфических антител

сравнивают с аналогичным свойством параллельно испытываемого препарата

сравнения;

антитела

определяют

использованием

подходящего

иммунохимического метода (2.7.1), например, твердофазного иммуноферментного

анализа (ELISA). В приведенном ниже описании испытания на мышах используется

трехточечная модель, однако, после валидации, для рутинных испытаний может

быть использован метод однократного разведения.

Вакцина сравнения. В качестве вакцины сравнения используют партию

вакцины, эффективность которой показана клиническими испытаниями, или

репрезентативную партию этой вакцины. Для приготовления репрезентативной

партии необходимо строгое соблюдение технологического процесса при

производстве партии, подвергающейся клиническим испытаниям. Стабильность

вакцины сравнения должна быть документально подтверждена.

Требования. Способность вакцины вызывать образование антител не должна

быть существенно ниже

(Р

0,95) по сравнению с аналогичным свойством

препарата сравнения.

Следующая модель испытания приводится в качестве примера метода,

пригодность которого для данного испытания подтверждена.

Отбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют

здоровых мышей (например, линии CD1) из одной партии возрастом от 4 до 8

недель. Животных распределяют по шести группам, состоящим из количества

особей, достаточного для выполнения требований испытания. Используют три

разведения испытуемой вакцины и три разведения препарата сравнения и

назначают каждой из групп одно из разведений. Каждому животному

внутрибрюшинно или подкожно вводят по

0,5 мл разведения, которое было

назначено группе, к которой данное животное относится.

Отбор образцов сыворотки. Через 4-5 недель после вакцинации проводят

забор крови у мышей под анестезией. Сыворотки до определения содержания

антител хранят при -20⁰С.

Определение антител. Выполняют количественное определение содержания

специфических в отношении каждого из компонентов антител в сыворотках с

использованием метода с подтвержденной достоверностью, например, ELISA,

методика которого приведена ниже.

Испытание ELISA. Титрационные микропланшеты, выполненные из

поливинилхлорида или полистирола, в соответствии с требованиями

специфического антигена, покрывают очищенным антигеном в концентрации 100 нг

на одну ячейку. После промывки непрореагировавшие участки блокируют путем

инкубации с раствором бычьего сывороточного альбумина и последующей

промывки. Производят на планшетах двукратные разведения сывороток мышей,

иммунизированных испытуемой вакциной и вакциной сравнения. После инкубации

при 22-25⁰С в течение 1 часа планшеты промывают. После промывки добавляют

хромогенный субстрат, высвобождающий под воздействием присоединенного

ферментного конъюгата хромофор, который может быть количественно определен

путем измерения оптической плотности

(2.2.25). Выбирают такие условия

испытания, чтобы в рабочем диапазоне измерений имелась линейная зависимость

оптической плотности от содержания антител, а значения оптической плотности

находились в пределах от 0,1 до 2,0.

В испытании используется контрольная антисыворотка установленной

активности, служащая основанием для вычисления содержания антител в

испытуемой сыворотке. Также в испытании используется стандартизированная

контрольная сыворотка.

Результаты испытания являются недостоверными, если:

значение, определенное для контрольной сыворотки, отличается от приписанной

величины более чем на удвоенное значение стандартного отклонения,

доверительный интервал оценочного значения активности шире, чем от 50 до

200%.

Вычисления. Вычисляют титры антител в сыворотках мышей, иммунизированных

испытуемой вакциной и препаратом сравнения, и из полученных значений с

использованием обычных статистических методов определяют активность

испытуемой вакцины относительно вакцины сравнения.

2.7.17. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТРОМБИНА III ЧЕЛОВЕКА

Содержание антитромбина III в испытуемом препарате определяют путем

сравнения его способности к инактивации тромбина в присутствии избыточного

количества гепарина с такой же способностью препарата сравнения антитромбина III

человека, калиброванного в Международных Единицах. Различные количества

испытуемого препарата смешивают с определенным количеством тромбина и

определяют активность остаточного количества тромбина с использованием

подходящего хромогенного субстрата.

За Международную Единицу принимают активность установленного

количества Международного Стандарта концентрата антитромбина III человека.

Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Методика определения. Готовят два независимых ряда из трех или четырех

разведений испытуемого препарата и препарата сравнения в диапазоне от 1/75 до

1/200 исходя из концентрации 1 МЕ/мл с использованием буферного раствора tris-

EDTA BSA рН 8,4 R, содержащего 15 МЕ гепарина в миллилитре.

По 200 мкл каждого из разбавлений выдерживают при 37⁰С в течение 1-2

минут. К каждому разведению добавляют по 200 мкл раствора бычьего тромбина R

с содержанием

2 МЕ/мл в буферном растворе tris-EDTA BSA рН

8,4 R,

перемешивают и выдерживают при 37⁰С в течение в точности 1 минуты. Добавляют

500 мкл подходящего хромогенного субстрата

(например, D-фенилаланил-L-

пипеколил-L-аргинина

4-нитроанилида, растворенного в воде R с получением

раствора, содержащего 4 ммоль/л и дополнительно разбавленного до концентрации,

подходящей для проведения количественного определения с использованием

буферного раствора tris-EDTA BSA рН 8,4 R без добавления альбумина). Тотчас же

начинают фиксировать изменение оптической плотности при длине волны 405 нм

(2.2.25), и продолжают измерение в течение не менее

30 секунд. Вычисляют

скорость изменения оптической плотности (DА/мин). (Определение также может

производиться методом конечной точки путем прерывания реакции добавлением

уксусной кислоты и измерением оптической плотности при длине волны 405 нм.)

Скорость изменения оптической плотности (DА/мин) обратно пропорциональна

активности антитромбина III.

Проверяют достоверность определения и вычисляют активность испытуемого

препарата с использованием обычных статистических методов

(например,

5.3.

Статистический анализ результатов биологических испытаний и

количественных определений).

2.7.18. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ II

Количественное определение фактора свертывания крови II производят по его

специфической активации с образованием фактора IIa. Фактор IIa оценивают на

основании сопоставления его активности по расщеплению специфического

хромогенного пептидного субстрата с такой же активностью Международного

Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах.

За Международную Единицу принимают активность фактора II в

установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенного

из замороженного состояния концентрата человеческого фактора свертывания крови

II. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Хромогенный метод количественного определения включает две

последовательные стадии: индуцируемая змеиным ядом активация фактора II и

ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором IIа с

образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В

соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между

активностью фактора IIа и расщеплением хромогенного субстрата.

РЕАГЕНТЫ

Специфический активатор фактора II из яда эфы

(Экарин). Белок,

получаемый из яда эфы (Echis carinatus), специфически активирующий фактор II.

Восстанавливают в соответствии с инструкциями производителя. Восстановленный

препарат хранят при 4⁰С и используют в течение 1 месяца.

Хромогенный субстрат фактора IIa. Специфический хромогенный субстрат

для фактора IIa, например: Н-D-фенилаланил-L-пипеколил-L-аргинина

нитроанилида дигидрохлорид,

4-толуолсульфонил-глицил-пролил-L-аргинина

нитроанилид, Н-D-циклогексилглицил-a-аминобутирил-L-аргинина 4-нитроанилид, D-

циклогексилглицил-L-аланил-L-аргинина

4-нитроанилида

диацетат.

Восстанавливают в соответствии с инструкциями изготовителя.

Буфер для разведений. Раствор, содержащий 6,06 г/л трис-(гидроксиметил)-

аминометана R,

17,53 г/л натрия хлорида R,

2,79 г/л

(этилендинитрило)-

тетрауксусной кислоты R и 1 г/л бычьего альбумина R или человеческого

альбумина R. При необходимости доводят значение рН до 8,4 с использованием

хлористоводородной кислоты R.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Испытуемый раствор. Испытуемый препарат разбавляют буфером для

разведений, получая раствор с содержанием 0,015 МЕ фактора II в миллилитре.

Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.

Раствор сравнения. Препарат сравнения разбавляют буфером для

разведений, получая раствор с содержанием 0,015 МЕ фактора II в миллилитре.

Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.

Все растворы перед испытанием нагревают на водяной бане до 37⁰С.

Нижеописанные условия определения относятся к титрационным

микропланшетам. Если определение производят в пробирках, объемы могут

изменяться при условии неизменности соотношений компонентов в смесях.

Определение выполняют с использованием титрационного микропланшета,

поддерживаемого при 37⁰С. По 25 мкл каждого из разведений испытуемого раствора

или раствора сравнения вносят в каждый из рядов ячеек. К содержимому каждой

ячейки добавляют 125 мкл буфера для разведений, затем

25 мкл экарина и

инкубируют в точности 2 минуты. К содержимому каждой ячейки добавляют 25 мкл

хромогенного субстрата фактора IIa.

Регистрируют скорость изменения оптической плотности (2.2.25) при длине

волны 405 нм непрерывно в течение 3 минут и получают среднюю скорость

изменения оптической плотности

(DА/мин). При невозможности непрерывной

регистрации, оптическую плотность при

405 нм регистрируют с подходящими

последовательными интервалами, например, продолжительностью

40 секунд,

строят на миллиметровой бумаге график зависимости оптической плотности от

времени и вычисляют из уклона полученной прямой значение DА/мин. Из значений

DА/мин для каждого разведения испытуемого препарата и препарата сравнения

вычисляют активность испытуемого препарата и проверяют достоверность

определения с использованием обычных статистических методов (5.3).

2.7.19. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Х

Количественное определение фактора свертывания крови Х производят по

его специфической активации с образованием фактора Хa. Фактор Хa оценивают на

основании его активности по расщеплению специфического хромогенного

пептидного субстрата с такой же активностью Международного Стандарта или

препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах.

За Международную Единицу принимают активность фактора Х в

установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенного

из замороженного состояния концентрата человеческого фактора свертывания крови

Х. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Хромогенный метод количественного определения включает две

последовательные стадии: индуцируемая змеиным ядом активация фактора Х и

ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором Ха с

образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В

соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между

активностью фактора Ха и расщеплением хромогенного субстрата.

РЕАГЕНТЫ

Специфический активатор фактора Х из яда цепочной гадюки (RVV). Белок,

полученный из яда цепочной гадюки

(Vipera russelli), который специфически

активирует фактор Х. Восстанавливают в соответствии с инструкциями

производителя. Восстановленный препарат хранят при 4⁰С и используют в течение 1

месяца.

Хромогенный субстрат фактора Хa. Специфический хромогенный субстрат

для фактора Хa, например: N-a-бензилоксикарбонил-D-аргинил-L-глицил-L-аргинина

4-нитроанилида

дигидрохлорид,

N-бензоил-L-изолейцил-L-глутамил-глицил-L-

аргинина

4-нитроанилида гидрохлорид, метансульфонил-D-лейцил-глицил-L-

аргинина 4-нитроанилид, метоксикарбонил-D-циклогексилаланил-глицил-L-аргинина

4-нитроанилида ацетат. Восстанавливают в соответствии с инструкциями

изготовителя.

Буфер для разведений. Раствор, содержащий 3,7 г/л трис-(гидроксиметил)-

аминометана R, 2,1 г/л имидазола R, 0,02 г/л гексадиметрина бромида R и 1 г/л

бычьего альбумина R или человеческого альбумина R. При необходимости доводят

значение рН до 8,4 с использованием хлористоводородной кислоты R.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Испытуемый раствор. Испытуемый препарат разбавляют буфером для

разведений, получая раствор с содержанием 0,18 МЕ фактора Х в миллилитре.

Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.

Раствор сравнения. Препарат сравнения разбавляют буфером для

разведений, получая раствор с содержанием 0,18 МЕ фактора Х в миллилитре.

Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.

Все растворы перед испытанием быстро нагревают на водяной бане до 37⁰С.

Нижеописанные условия определения относятся к титрационным

микропланшетам. Если определение производят в пробирках, объемы могут

изменяться при условии неизменности соотношений компонентов в смесях.

Определение выполняют с использованием титрационного микропланшета,

поддерживаемого при

37⁰С. По

12,5 мкл каждого из разведений испытуемого

раствора или раствора сравнения вносят в каждый из рядов ячеек. К содержимому

каждой ячейки добавляют 25 мкл RVV и инкубируют в точности 90 секунд. К

содержимому каждой ячейки добавляют 150 мкл хромогенного субстрата фактора

Хa, разбавленного в соотношении 1:6 буфером для разведений.

Регистрируют скорость изменения оптической плотности (2.2.25) при длине

волны 405 нм непрерывно в течение 3 минут и получают среднюю скорость

изменения оптической плотности

(DА/мин). При невозможности непрерывной

регистрации, оптическую плотность при

405 нм регистрируют с подходящими

последовательными интервалами, например, продолжительностью

40 секунд,

строят на миллиметровой бумаге график зависимости оптической плотности от

времени и вычисляют из уклона полученной прямой значение DА/мин. Из значений

DА/мин для каждого разведения испытуемого препарата и препарата сравнения

вычисляют активность испытуемого препарата и проверяют достоверность

определения с использованием обычных статистических методов (5.3).

2.7.20. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ

ПОЛИОМИЕЛИТА IN VIVO

Способность вакцины вызывать образование нейтрализующих антител

определяют in vivo по одному из следующих методов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЦЫПЛЯТ ИЛИ МОРСКИХ СВИНОК

Готовят подходящий ряд, состоящий не менее чем из трех разведений

испытуемой вакцины с использованием подходящего буферизированного раствора

хлорида натрия. Морских свинок массой тела 250-350 г или цыплят возрастом 3

недели распределяют по группам, состоящим из 10 особей, и назначают каждой из

групп одно из разведений вакцины. Каждому животному внутримышечно вводят по

0,5 мл разведения, которое было назначено группе, к которой данное животное

относится. Через 5-6 дней проводят забор крови и отделяют сыворотки. Определяют

наличие в разведениях сывороток (1:4) нейтрализующих антител к каждому из

человеческих полиовирусов: 1, 2 и 3. 100 CCID₅₀ вируса смешивают с разведением

сыворотки и инкубируют при 37⁰С в течение 4,5-6 часов. Хранят при 5±3⁰С в течение

12-18 часов. Смеси прививают клеточным культурам для определения присутствия

вирусов, не подвергшихся нейтрализации, и ведут регистрацию результатов в

течение периода до

7 дней после инокуляции. Для каждой группы животных

отмечают количество сывороток, в которых обнаружено наличие нейтрализующих

антител, и вычисляют разведение вакцины, дающее такой отклик у 50% животных.

Параллельно выполняют контрольный опыт с использованием подходящего

препарата сравнения. Вакцина выдерживает испытание, если обнаруживается

наличие нейтрализующих антител к каждому из трех типов вируса у 50% животных в

разведении вакцины в соотношении 1:100 или более.

ИСПЫТАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КРЫС.

Метод количественного определения in vivo состоит из внутримышечного

введения в задние конечности не менее трех разведений испытуемой вакцины и

вакцины сравнения с использованием для каждого разведения группы из 10 крыс

подходящей линии, не содержащих патогенов. Для получения достоверных

результатов для всех серотипов часто бывает необходимо использовать четыре

разведения. Количество животных в группе должно быть достаточным для

получения результатов, отвечающих критериям достоверности; десяти крыс в группе

обычно достаточно, хотя достоверные результаты могут быть получены и с

меньшим числом животных в группе. Масса тела животного не должна отличаться

более, чем на 10% от средней по группе. Каждой крысе вводят по 0,5 мл материала.

Диапазон доз выбирают таким образом, чтобы получить дозовый отклик для всех

трех типов полиовируса. Забор крови у животных производят через 20-22 дня.

Определяют по отдельности нейтрализующие титры против всех трех типов

полиовируса с использованием в качестве провокационных вирусов 100 CCID₅₀

штаммов Sabin, в качестве индикаторных клеток - Vero или Hep2 в условиях

нейтрализации, состоящих в инкубации в течение трех часов при 35-37⁰С и 18 часов

при 2-8⁰С. Для получения результатов производят фиксацию и окрашивание после

семидневной инкубации при

35⁰С. Для признания определения достоверным

необходимо показать, что титр провокационных вирусов находится в пределах от 10

до 1000 CCID₅₀, а титр нейтрализующих антител в контрольной сыворотке должен

находиться в пределах двух двукратных разведений среднего геометрического титра

сыворотки. Активность вакцины вычисляют путем сопоставления количества

респондеров на испытуемую вакцину и вакцину сравнения. Анализ выполняют с

использованием пробит-метода или, после проверки достоверности, метода

параллельных линий. В случае пробит-метода для определения респондера

необходимо установить граничный титр нейтрализующих антител для каждого из

типов полиовируса. В связи с изменчивостью результатов в разных лабораториях,

определить общепринятые граничные значения не представляется возможным.

Вместо этого граничные значения определяют в каждой лаборатории, основываясь

не менее, чем на трех результатах испытаний вакцины сравнения. За граничное

значение принимают среднюю точку в шкале log2 минимального и максимального

значений среднего геометрического титров, вычисленных для ряда из трех или

более испытаний. Для каждого из трех типов полиовируса активность вакцины не

должна быть существенно ниже такой же активности препарата сравнения.

Результаты испытания являются достоверными, если:

- как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, ED₅₀ заключена в

интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными

животным,

- при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и

параллельности,

- границы доверительного интервала относительной активности находятся между

25% и 400% от оцененного значения активности.

2.7.22. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

ЧЕЛОВЕКА XI

Активность фактора свертывания крови человека XI определяют путем

сравнения количества испытуемого препарата, необходимого для уменьшения

времени свертывания испытуемой смеси, содержащей вещества, отличные от

фактора XI, принимающие участие в процессе коагуляции крови, и количества

нормальной человеческой плазмы, которое требуется для получения такого же

эффекта. 1 единица фактора XI равна активности 1 мл нормальной человеческой

плазмы.

Восстанавливают по отдельности испытуемый препарат и препарат сравнения

в соответствии с указаниями на этикетке и используют немедленно. В случае

необходимости, определяют количество присутствующего гепарина

(2.7.12) и

нейтрализуют гепарин добавлением протамина сульфата R (10 мкг протамина

сульфата нейтрализуют

1 МЕ гепарина). Испытуемый препарат и препарат

сравнения разбавляют количеством имидазольного буферного раствора рН 7,3 R,

содержащего 1% альбумина, достаточным для получения растворов с содержанием

от 0,5 до 2,0 единиц в миллилитре. Готовят двукратные разведения в диапазоне от

1:10 до 1:80 с использованием имидазольного буферного раствора рН 7,3 R.

Разведения производят с высокой точностью и используют немедленно.

В определении могут использоваться, например, инкубационные пробирки,

температура которых поддерживается с помощью водяной бани на уровне 37⁰С. В

каждую пробирку помещают по 0,1 мл субстрата плазмы R3 и по 0,1 мл одного из

разведений испытуемого препарата или препарата сравнения. К содержимому

каждой пробирки добавляют по 0,1 мл подходящего разведения цефалина R или

заменителя тромбоцитов R и 0,1 мл суспензии 0,5 г легкого каолина R в 100 мл

раствора натрия хлорида R концентрацией 3,7 г/л. Пробирки выдерживают около 10

минут, время от времени переворачивая. К содержимому каждой пробирки

добавляют по

0,1 мл раствора хлорида кальция R концентрацией

7,4 г/л. С

использованием таймера измеряют время коагуляции, т.е. интервал времени между

добавлением хлорида кальция и первыми признаками образования фибрина,

которые можно определять либо визуально, либо с применением соответствующей

аппаратуры. Вычисляют активность с использованием обычных статистических

методов

(например,

5.3. Статистический анализ результатов биологических

испытаний и количественных определений).

Для подтверждения отсутствия в субстрате плазмы R3 существенного

количества фактора XI выполняют контрольный опыт с использованием вместо

испытуемого препарата соответствующего объема имидазольного буферного

раствора рН 7,3 R. Результаты испытания считают достоверными, если время

коагуляции в контрольном опыте составляет от 100 до 200 секунд.

# 2.7.23 ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИНСУЛИНА

Активность испытуемого препарата инсулина определят путем сопоставления

его гипогликемического

(сахаропонижающего) действия с гипогликемическим

действием стандартного образца инсулина.

Стандартный образец и единица действия инсулина.

Стандартный образец инсулина представляет собой препарат высокоочищенного

инсулина, активность которого определена путем многократного сопоставления с

активностью Международного Стандарта и составляет не менее 25 ЕД в 1 мг. За

единицу действия (ЕД) принимают специфическую активность количества массы

стандартного образца, эквивалентного по биологическому действию

Международной Единице инсулина.

Примечание. Приготовление растворов стандартного образца и испытуемого

препарата инсулина. Точную навеску стандартного образца инсулина растворяют

в растворе хлористоводородной кислоты

(0,003 моль/л) с рН

2,7

3,0,

содержащем консервант в такой же концентрации, как испытуемый препарат.

Срок годности основного раствора стандартного образца инсулина 4 месяца при

температуре 4 ⁰С.

Перед опытом основной раствор стандартного образца инсулина разводят

раствором хлористоводородной кислоты (0,003 моль/л) до концентрации 1 ЕД в 1

мл. Испытуемый препарат инсулина разводят этим же раствором

хлористоводородной кислоты до концентрации 1 ЕД в 1 мл, исходя из его

предполагаемой активности.

Метод определения биологической активности.

Определение биологической активности инсулина проводят на здоровых

кроликах массой 2,5 - 3,5 кг. Животных массой 1,8 - 2,3 кг предварительно не менее

14 суток содержат в условиях вивария, где они получают овес, сено или свежую

траву, корнеплоды, комбинированный корм и воду. По истечении этого срока

определяют чувствительность кроликов к инсулину. Для этого кроликам дважды с

интервалом 7

8 суток после

18 часов голодания вводят подкожно раствор

стандартного образца инсулина из расчета 0,5 ЕД на 1 кг массы тела животного и

определяют величину снижения концентрации сахара в крови в процентах. Кровь

для исследования берут из краевой вены уха животных до введения инсулина и

через 1,5 и 2,5 часа после его введения (для расчета берут среднюю концентрацию

сахара в крови из двух определений после введения инсулина). Кровь берут в

условиях, не допускающих чрезмерного волнения кроликов. Из опытов исключают

животных с исходной концентрацией сахара в крови ниже и выше пределов,

установленных для используемого метода определения содержания сахара в крови

(ниже 75 мг % и выше 120 мг % для феррицианидного метода, ниже 52 мг % и выше

94 мг % для глюкозооксидазного метода), а также тех животных, которые реагируют

на введение инсулина судорогами или у которых снижение концентрации сахара в

крови составляет менее 15 % по отношению к исходной концентрации. Определение

биологической активности инсулина проводят не ранее чем через 7 - 8 суток после

испытания на чувствительность.

Отобранных для опытов кроликов лишают корма (но не воды) на 18 часов,

предшествующих введению инсулина. Животных распределяют на две группы

способом случайного выбора (в каждой группе должно быть не менее 9 кроликов).

Непосредственно перед введением инсулина кроликов взвешивают и определяют

исходную концентрацию сахара в крови. Кроликам одной группы вводят подкожно по

0,5 ЕД стандартного образца инсулина (S) на 1 кг массы тела, кроликам другой

группы

- такую же дозу испытуемого препарата инсулина (Т). Через 1,5 и 2,5 часа

после введения инсулина у животных снова определяют концентрацию сахара в

крови.

Для каждого кролика рассчитывают снижение концентрации сахара (X) в крови в

процентах по формуле:

= a b

¥100,

где

а - исходная концентрация сахара в крови в миллиграмм-процентах;

- средняя концентрация сахара в крови в миллиграмм-процентах из двух

определений, проведенных через 1,5 и 2,5 часа после введения инсулина.

Как и при испытании кроликов на чувствительность к инсулину, при расчетах

не учитывают животных с исходной концентрацией сахара в крови ниже и выше

пределов, установленных для используемого метода, а также реагирующих на

указанную дозу инсулина судорогами или дающих снижение концентрации сахара в

крови менее 15% по отношению к исходной концентрации.

Через 3 - 5 суток на этих же кроликах проводят повторное испытание с той

разницей, что животным из группы, получавшей стандартный образец инсулина (S),

вводят испытуемый препарат инсулина (Т), а животным группы, получавшей (Т),

вводят (S).

Рассчитывают среднюю величину снижения концентрации сахара в крови на

стандартный образец (% S) и на испытуемый препарат (% Т) по данным всего опыта.

Отношение

% Т / %S выражает относительную активность

(R) испытуемого

препарата

(Т). Для выражения активности испытуемого препарата (Т) в ЕД его

предполагаемую активность (А) умножают на R: Т = R • А.

Пример: при определении биологической активности инсулина для инъекций с

предполагаемой активностью 40 ЕД в 1 мл получили следующие величины снижения

концентрации сахара в крови в процентах (Y).

Первая часть испытания

Вторая часть испытания

48,5

22,5

∑ Y_S= 869; % S = 869/18 = 48,28.

R = % T / % S = 45,83 / 48,28= 0,949.

∑ Y_T= 825; % T = 825 / 18 = 45,83.

Активность Т в ЕД, по данным этого опыта, равна:

Т = 0,949 • 40 = 37,96 ЕД в 1 мл.

Определение проводят не менее 2 раз с каждым испытуемым образцом (Т).

Среднюю величину при этом получают, объединяя индивидуальные цифры

снижения концентрации сахара в крови в процентах в обоих опытах. При расчете

окончательного результата должны быть использованы данные, полученные не

менее чем на 30 кроликах. Если средняя величина R, по данным двух или большего

числа опытов, будет меньше 0,85 или больше 1,15, испытание проводят заново,

исходя из новой величины предполагаемой активности испытуемого препарата.

Кролики могут быть использованы повторно для определения биологической

активности не ранее чем через 2 недели после окончания предшествующего опыта.

Продолжительность использования кроликов в опытах по определению

биологической активности инсулина не должна превышать 5 месяцев.

ИСПЫТАНИЕ НА ПРОЛОНГИРОВАННОЕ (УДЛИНЕННОЕ) ДЕЙСТВИЕ

ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА

Испытание на пролонгированное действие препаратов инсулина основано на

сопоставлении длительности гипогликемического эффекта испытуемого препарата и

стандартного образца инсулина.

18 здоровых кроликов массой 3 - 4 кг распределяют на две группы по 9

животных способом случайного выбора. Животных содержат в отдельных клетках, за

18 часов до введения инсулина лишают корма (но не воды). В начале опыта у

кроликов определяют исходное содержание сахара в крови и рассчитывают

среднюю концентрацию сахара в крови для каждой группы. Животным первой

группы вводят стандартный образец инсулина, а животным второй группы

испытуемый препарат инсулина. Навеску стандартного образца инсулина

растворяют в растворе хлористоводородной кислоты (0,003 моль/л) рН 2,7 - 3,0,

содержащем консервант в такой же концентрации, как и препарат. Доза испытуемого

препарата и стандартного образца составляет 0,8 ЕД на 1 кг массы тела животного.

Испытуемый препарат вводят в неразведенном виде. Концентрация (количество ЕД

в 1 мл) стандартного образца должна быть равна концентрации неразведенного

испытуемого препарата. Через 1,5; 3,0; 4,5 и 6,0 часов после введения препарата

инсулина и стандартного образца определяют концентрацию сахара в крови у

кроликов и подсчитывают среднее содержание сахара для каждой группы.

Требования в отношении пролонгированного действия отдельных препаратов

инсулина изложены в соответствующих частных статьях.

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 22