ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год)

VIII. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец человеческий фактор свертывания крови VIII BRP

калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным

Стандартом.

Хромогенный метод количественного определения включает две

последовательные стадии: зависящая от фактора VIII активация фактора Х в

реагенте факторов свертывания, состоящем из очищенных компонентов, и

ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором Ха с

образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В

соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между

скоростью образования фактора Ха и концентрацией фактора VIII. Содержание

метода количественного определения описывается следующей схемой:

(активированный) фактор VIII

1-я стадия

Фактор Х

Фактор Ха

Фактор IХа, фосфолипид, Са

Фактор Ха

2-я стадия

хромогенный субстрат

пептид + хромофор

В обеих стадиях используются реагенты, доступные из ряда коммерческих

источников. Хотя в состав реагентов могут вноситься некоторые изменения, их

основные свойства должны соответствовать нижеприведенным спецификациям.

Отклонения от этого описания допустимы при условии, что с использованием в

качестве препарата сравнения Международного Стандарта концентрата

человеческого фактора свертывания крови VIII показано отсутствие существенных

различий в результатах.

Коммерчески доступные наборы для количественного определения следует

использовать в соответствии с инструкциями изготовителя; важно убедиться в том,

что используемый набор подходит для данного количественного определения.

РЕАГЕНТЫ

Реагент факторов коагуляции состоит из очищенных белков человеческого

или говяжьего происхождения, включающих фактор Х, фактор IXa и активатор

фактора VIII, обычно тромбин. Эти белки подвергнуты частичной очистке,

предпочтительно, не менее чем до

50%, и не должны содержать примесей,

мешающих активации фактора VIII или фактора Х. Фактор Х содержится в

количествах, приводящих к конечной концентрации на первой стадии определения,

находящейся в пределах 10-350 нмоль/л, предпочтительно 15-30 нмоль/л. Фактор

IXa готовят активацией очищенного фактора IX с использованием фактора XIa и

получением фактора IXab и дальнейшей очисткой фактора IXab из реакционной

смеси. Его окончательная концентрация в процессе образования фактора Ха должна

составлять менее

30% от концентрации фактора Х, обычно

1-100 нмоль/л,

предпочтительно

1-10 нмоль/л. Тромбин может присутствовать в форме его

предшественника

- протромбина, при условии, что его активация в реагенте

протекает с достаточной скоростью для практически мгновенной и полной активации

в эксперименте фактора VIII. Фосфолипиды могут быть получены из природных

источников, например, из головного или спинного мозга крупного рогатого скота,

соевого экстракта или синтетическим путем, и должны состоять в существенной

степени

(обычно от

15 до

35%) из фосфатидилсеринов. Окончательная

концентрация фосфолипида в процессе образования фактора Ха должна составлять

1-50 мкмоль/л, предпочтительно 10-35 мкмоль/л. Реагент содержит ионы кальция в

количестве, приводящем к окончательной концентрации 5-15 ммоль/л. Образование

конечного фактора Ха проводят в растворе, содержащем не менее

1 мг/мл

человеческого

или

бычьего

альбумина,

соответствующим

образом

буферизированного до рН 7,3-8,0. Компоненты реагента обычно разделяют не

менее чем на два отдельных реагента, каждый из которых не обладает

способностью самостоятельно генерировать фактор Ха. После восстановления

реагенты могут быть объединены при условии, что в отсутствии фактора VIII не

происходит образования существенных количеств фактора Ха. В окончательной

инкубационной смеси фактор VIII должен быть единственным компонентом,

лимитирующим скорость.

Вторая стадия включает количественное определение образовавшегося

фактора Ха с использованием специфичного в отношении фактора Ха хромогенного

субстрата. Обычно он представляет собой производное короткого пептида,

состоящего из 3-5 аминокислотных остатков, соединенное с хромофорной группой.

При отщеплении этой группы от пептидного субстрата ее хромофорные свойства

смещаются к длине волны, при которой становится возможным произвести

спектрофотометрическое определение. Субстрат обычно растворяют в воде и

используют в концентрациях

0,2-2 ммоль/л. Субстрат также может содержать

подходящие ингибиторы для прекращения дальнейшего образования фактора Ха и

супрессирования активности тромбина, что улучшает селективность метода в

отношении фактора Ха.

МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Восстанавливают полное содержимое одной ампулы препарата сравнения и

испытуемого препарата путем добавления подходящего количества воды R;

используют немедленно. К восстановленным препаратам добавляют

прерастворитель в количестве, достаточном для получения растворов с

содержанием от 0,5 до 2,0 МЕ/мл.

Прерастворитель представляет собой плазму, собранную у пациента,

страдающего острой гемофилией А, или искусственно приготовленный реагент,

который приводит к получению результатов, существенно не отличающихся от

результатов, получаемых при использовании гемофилической плазмы и

аналогичных испытуемых и стандартных образцов. Полученные материалы

предварительного растворения должны быть стабильны в течение времени,

необходимого для проведения определения, т.е. не менее 30 минут при 20⁰С. Их

следует использовать в течение 15 минут.

Готовят дальнейшие разведения испытуемого и стандартного препаратов с

использованием изотонического нехелатирующего буфера, содержащего

человеческого или бычьего альбумина и, например, трис-(гидроксиметил)-

аминометан или имидазол, предпочтительно буферизированного при рН от 7,3 до

8,0. Готовят не менее трех отдельных, независимых разведений каждого препарата.

Предпочтительно каждое из разведений готовить в двух повторностях. Разведения

готовят таким образом, чтобы окончательная концентрация фактора VIII на стадии

образования фактора Ха была ниже 0,03 МЕ/мл, предпочтительно ниже 0,01 МЕ/мл.

Готовят контрольный раствор, включающий все компоненты, кроме фактора

VIII.

Все разведения готовят в пластиковых пробирках и используют

незамедлительно.

1-я стадия. Предварительно нагретые разведения образца сравнения

фактора VIII и испытуемого препарата смешивают с соответствующим объемом

предварительно нагретого реагента факторов свертывания крови или со смесью

реагентов, его составляющих, и инкубируют смесь в пластиковых пробирках или

ячейках планшета при температуре 37⁰С. Концентрации компонентов в процессе

образования фактора Ха должны соответствовать спецификациям, приведенным

выше при описании реагентов. Активацию фактора Х проводят в течение

подходящего промежутка времени, предпочтительно прерывая реакцию до

достижения концентрацией фактора Ха ее максимального уровня с целью получения

удовлетворительной линейной зависимости отклика от дозы. Время активации

выбирается также таким образом, чтобы достичь линейного во времени образования

фактора Ха. Подходящие периоды активации обычно находятся в пределах от 2 до 5

минут, но допускаются и другие значения, при условии получения таким образом

лучшей линейности зависимости отклика от дозы.

2-я стадия. Активацию прерывают добавлением предварительно нагретого

реагента, содержащего хромогенный субстрат. Проводят количественную оценку

скорости расщепления субстрата, которая должна находиться в линейной

зависимости от концентрации образовавшегося фактора Ха, измеряя изменение

оптической плотности при соответствующей длине волны с помощью

спектрофотометра. Оптическую плотность отслеживают постоянно, получая таким

образом возможность вычислить начальную скорость расщепления субстрата, либо

прерывают реакцию гидролиза по окончании подходящего промежутка времени

путем понижения рН добавлением подходящего реагента, например, уксусной

кислоты (50 объемных процентов С₂Н₄О₂) или раствора цитрата (1 моль/л) с рН 3.

Время гидролиза регулируют с целью достижения линейного характера образования

хромофора во времени. Подходящими обычно являются периоды гидролиза от 3 до

15 минут, но допускаются и другие значения при условии получения таким образом

лучшей линейности зависимости отклика от дозы.

Проверяют достоверность определения и вычисляют активность испытуемого

препарата с использованием обычных статистических методов

(например,

5.3.

Статистический анализ результатов биологических испытаний и

количественных определений).

2.7.5. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕПАРИНА

Антикоагулянтную активность гепарина определяют in vitro путем сравнения

его способности в заданных условиях замедлять свертывание обогащенной

кальцием и цитратом овечьей плазмы с аналогичной способностью препарата

сравнения гепарина, калиброванного в Международных Единицах.

Международная Единица (МЕ) - активность, проявляемая установленным

количеством Международного стандарта, состоящего из высушенной из

замороженного состояния натриевой соли гепарина, полученной из свиных

кишечных слизистых оболочек. Эквивалент Международного стандарта в МЕ

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец гепарина натриевой соли BRP калибруют в МЕ по

сравнению с Международным стандартом с использованием изложенной ниже

методики количественного определения.

Количественное определение выполняют одним из следующих методов

установления начала свертывания с использованием пробирок и другого

оборудования, соответствующего выбранному методу:

а) прямое визуальное наблюдение, предпочтительно, в отраженном свете на черном

матовом фоне;

b) спектрофотометрическая регистрация изменения оптической плотности при длине

волны около 600 нм;

с) визуальная фиксация изменения текучести путем производимого вручную

опрокидывания пробирок;

d) механическая запись изменения текучести, определяемого по перемешиванию, с

соблюдением мер предосторожности, направленных на минимизацию возмущений

раствора в начальной стадии свертывания.

МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Приведенные в тексте объемы являются примерными и могут быть

адаптированы к используемой аппаратуре при условии соблюдения соотношений

между различными объемами.

Стандартный образец гепарина натриевой соли BRP разбавляют раствором

натрия хлорида R концентрацией 9 г/л до получения точно известного количества

МЕ в миллилитре, и готовят аналогичный раствор испытуемого препарата, для

которого ожидается такая же активность. Используя раствор натрия хлорида R

концентрацией 9 г/л, из каждого раствора готовят ряд разведений в геометрической

прогрессии так, чтобы время свертывания, получаемое для низшей концентрации,

не менее чем в

1,5 раза превышало время в контрольном опыте, а время

свертывания, получаемое для высшей концентрации, давало значение, приводящее

к построению удовлетворительной логарифмической кривой зависимости отклика от

дозы, что определяется в ходе предварительного испытания.

Помещают двенадцать пробирок в баню с ледяной водой. Помечают их

следующим образом: два ряда (Т₁, Т₂, Т₃) для разведений испытуемого препарата и

два ряда (S₁, S₂, S₃) для разведений препарата сравнения. В каждую из пробирок

помещают по

1,0 мл размороженного субстрата плазмы R1 и

1,0 мл

соответствующего разведения испытуемого препарата или препарата сравнения.

После каждого из добавлений производят перемешивание, не допуская

образования пузырьков. Для дальнейших манипуляций пробирки отбирают в

порядке: S₁, S₂, S₃, Т₁, Т₂, Т₃. Каждую из пробирок приблизительно на 15 минут

помещают в водяную баню, нагретую до температуры 37⁰С, и добавляют к каждой из

них 1 мл разведения цефалина R, к которому был добавлен соответствующий

активатор, например, каолин, таким образом, чтобы время контрольного опыта было

подходящим и не превышало

60 секунд. При использовании каолина

непосредственно перед проведением испытания готовят смесь равных объемов

цефалина R и суспензии легкого каолина R с его содержанием 4 г/л в растворе

натрия хлорида R концентрацией 9 г/л. Ровно через 2 минуты добавляют 1 мл

раствора кальция хлорида R концентрацией 3,7 г/л и регистрируют в качестве

времени свертывания интервал, в секундах, между последним добавлением и

началом свертывания, определяемым с помощью выбранного метода. В начале и в

конце процедуры аналогичным образом определяют время контрольного опыта,

используя вместо одного из разбавлений гепарина 1 мл раствора натрия хлорида R

концентрацией 9 г/л; два полученных контрольных значения не должны существенно

различаться. Времена свертывания переводят в логарифмы, используя средние

значения для дублирующихся пробирок. Процедуру повторяют со свежими

разведениями, проводя инкубации в порядке: Т₁, Т₂, Т₃, S₁, S₂, S₃. Результаты

вычисляют с использованием обычных статистических методов.

Проводят не менее трех независимых определений. Для каждого из таких

определений готовят свежие растворы препарата сравнения и испытуемого

препарата, и используют новую свежеразмороженную порцию субстрата плазмы.

Активность испытуемого препарата вычисляют путем комбинирования

результатов этих определений с использованием обычных статистических методов.

Если отклонение, вызванное различиями между результатами определений,

является значительным при Р = 0,01, комбинированная оценка активности может

быть получена путем вычисления простого среднего значения оценок активности.

# Количественное определение гепарина в субстанции и готовых

лекарственных формах может быть выполнено с использованием реакции

антикоагуляции в соответствии с нижеизложенным методом.

Антикоагулянтная активность. Определение активности гепарина проводят

биологическим методом по способности его задерживать свертывание нитратной

бараньей или бычьей плазмы, путем сопоставления активности испытуемого

препарата с активностью гепарина - стандартного образца.

В два ряда тщательно вымытых и высушенных пробирок вносят

возрастающее количество рабочих растворов стандартного образца гепарина,

испытуемого препарата гепарина и раствора натрия хлорида изотонического 0,9 % в

количествах, указанных в таблице. После этого в каждую пробирку прибавляют по 1

мл плазмы, затем по 0,2 мл рабочего раствора кальция хлорида (попеременно в

пробирки из ряда с раствором стандартного образца гепарина и испытуемого

препарата гепарина), смешивают содержимое осторожно, поворачиванием и легким

встряхиванием, не допуская образования пузырей, отмечают время и оставляют при

комнатной температуре

(или в термостате при температуре 37°С) на

1 ч. По

истечении указанного времени определяют состояние плазмы в каждой пробирке и

отмечают в каждом ряду крайнюю слева пробирку, в которой не произошло полное

свертывание плазмы.

Эти пробирки содержат наименьшие объемы растворов стандартного образца

гепарина и испытуемого препарата гепарина, которые задерживают свертывание

плазмы.

Порядок внесения раствора

Наименование

раствора

Раствор гепарина, мл

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

Раствор натрия хлорида

0,50

0,45

0,40

0,35

0,30

0,25

0,20

0,15

0,10

0,05

изотонический 0,9 %, мл

Антикоагулянтную активность (Х) препарата, в ЕД/мл, вычисляют по формуле:

X =

×A,

V₂

где

V₁

наименьший объем раствора стандартного образца гепарина,

задерживающий свертывание плазмы, в миллилитрах;

V₂

- наименьший объем испытуемого раствора гепарина, задерживающий

свертывание плазмы, в миллилитрах;

А - предполагаемая активность.

Определение проводят не менее трех раз и берут средний результат.

Примечания:

1. Приготовление 8 % раствора натрия цитрата. 8 г натрия цитрата помещают

в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 70 мл воды, доводят объем

раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют

свежеприготовленным.

2. Приготовление 10 % раствора кальция хлорида. 10 г кальция хлорида

безводного помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 70 мл

воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Срок годности

раствора 1 месяц при температуре от 0 до +4°С.

3. Приготовление плазмы. Кровь, вытекающую из сосудов убойного животного,

собирают в банки из полиэтилена вместимостью 1 л, содержащие от 25 до 30 мл 8 %

раствора натрия цитрата.

Кровь осторожно смешивают с 8 % раствором натрия цитрата, поворачивая

баню, и как можно быстрее центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 минут,

после чего плазму отсасывают.

Плазму хранят в замороженном состоянии при температуре от -10 до -20°С во

флаконах вместимостью от 50 до 150 мл, избегая ее оттаивания.

Перед употреблением плазму размораживают на водяной бане или

термостате при температуре 37 ± 0,5°С. Затем плазму фильтруют через марлю,

проверяют время ее свертывания и оценивают оптимальное количество кальция

хлорида, необходимое для определения активности: в 5 пробирок с 1 мл плазмы в

каждой прибавляют возрастающие количества 10 % раствора кальция хлорида (0,02

- 0,04 - 0,06 - 0,08 -0,10 мл) и осторожно смешивают. Для опыта используют плазму,

время свертывания которой не превышает 10 минут и то оптимальное количество

кальция хлорида, которое вызывает полное свертывание плазмы в указанное время.

Найденное оптимальное количество кальция хлорида должно содержаться в 0,2 мл

рабочего раствора (этот раствор готовят разведением 10

% раствора кальция

хлорида). Срок годности плазмы 1 год при температуре от - 10 до -20°С.

4. Приготовление раствора стандартного образца гепарина. Навеску гепарина

- стандартного образца растворяют в растворе натрия хлорида изотоническом 0,9 %

с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора содержалось 50 ЕД.

Срок годности раствора 6 месяцев при температуре от 0° С до +4 °С.

Предварительно из гепарина

- стандартного образца готовят растворы,

содержащие в 1 мл 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 ЕД. По 0,5 и 0,72 мл полученных растворов

помещают в пробирки, доводят объем раствора в пробирке до 0,8 мл раствором

натрия хлорида изотоническим 0,9 %. Затем прибавляют по 1 мл плазмы и 0,2 мл

кальция хлорида оптимальной концентрации и перемешивают.

Через

1 час определяют состояние плазмы в каждой пробирке и

устанавливают активность раствора гепарина - стандартного образца, при которой в

пробирке, содержащей 0,5 мл раствора гепарина, происходит полное свертывание

плазмы, а в другой пробирке, содержащей 0,72 мл этого раствора гепарина, плазма

не свернулась. Выбранная активность обеспечивает наблюдение за влиянием

испытуемого гепарина - стандартного образца на свертывание плазмы по истечении

часа. Обычно эта активность находится в пределах 1 - 1,5 ЕД для плазмы КРС и 1 -

3,5 ЕД для бараньей плазмы.

5. Приготовление раствора испытуемого препарата. Навеску препарата

растворяют в растворе натрия хлорида изотоническом

0,9%, исходя из его

предполагаемой активности с таким расчетом, чтобы 1 мл полученного раствора

содержал столько же единиц гепарина, сколько содержит 1 мл раствора гепарина -

стандартного образца. Раствор используют свежеприготовленным.

6. При необходимости разрешается сдвигать ряд пробирок, указанный в

таблице, в сторону уменьшения концентрации раствора гепарина.

2.7.6. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАКЦИНЫ ДИФТЕРИИ

(АДСОРБИРОВАННОЙ)

Количественное определение вакцины дифтерии

(адсорбированной)

производят путем сравнения дозы вакцины, необходимой для защиты морских

свинок от эффектов либо эритрогенной дозы вводимого интрадермально токсина

дифтерии, либо летальной дозы вводимого подкожно токсина дифтерии, с дозой

препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, требующейся

для получения такой же защиты.

За Международную Единицу принимают активность в установленном

количестве Международного Стандарта, состоящего из дифтерийного анатоксина,

адсорбированного на гидроксиде алюминия. Эквивалентность Международного

Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией

здравоохранения.

В нижеописанном методе количественного определения используется модель

параллельных линий с использованием трех разведений испытуемого и

стандартного препаратов. Если аналитик обладает достаточно большим опытом

работы с применением этого метода для данной вакцины, разрешается

использовать упрощенную модель, включающую одно разведение для испытуемого

и стандартного препаратов. Такая модель позволяет определять, обладает ли

вакцина активностью, существенно превышающей необходимый минимум, но не

дает информации о линейности и параллельности и кривой зависимости отклика от

дозы. Упрощенная модель приводит к существенному уменьшению требуемого

количества экспериментальных животных; она должна приниматься во внимание

каждым аналитиком в соответствии с положениями Европейской конвенции по

защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других

научных целях.

МЕТОД ИНТРАДЕРМАЛЬНОЙ ПРОВОКАЦИИ

Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют

здоровых белых морских свинок из одной партии размером, подходящим для

предписанного количества точек введения. Разница в массе между самым тяжелым

и самым легким животным не должна превышать 100 г. Морских свинок делят не

менее чем на шесть равных групп; количество животных в группах должно быть

достаточным для получения результатов, выдерживающих требования к

достоверности определения, приведенные ниже. Если не было показано, что

используемый токсин достаточно стабилен, или если он не был адекватным образом

стандартизирован, используют пять морских свинок в качестве невакцинированного

контроля. Используют морских свинок одного пола; в иных случаях самцы и самки

должны быть равномерно распределены по группам.

Выбор провокационного токсина. Препарат токсина дифтерии должен

содержать от 67 до 133 lr/100 в 1 Lf и от 25000 до 50000 минимальных реактивных

доз для кожи морских свинок в 1 Lf. Если было показано, что препарат токсина

обладает стабильностью, проверка его активности перед каждым определением не

является обязательной.

Приготовление раствора провокационного токсина. Непосредственно

перед использованием провокационный токсин разбавляют подходящим

растворителем с получением раствора провокационного токсина, содержащего

около 0,0512 Lf в 0,2 мл. Из него путем дальнейших четырехкратных разведений

получают ряд из пяти растворов, содержащих около 0,0128, 0,0032, 0,0008, 0,0002 и

0,00005 Lf в 0,2 мл.

Определение активности вакцины. Используя раствор натрия хлорида R

концентрацией

9 г/л, готовят разведения испытуемой вакцины и препарата

сравнения таким образом, чтобы для каждого из препаратов был получен ряд не

более чем с 2,5-кратным различием между последовательными разведениями, и в

котором промежуточные разведения при подкожном введении морской свинке в дозе

1,0 мл приводят в результате провокации к получению интрадермальной суммы,

составляющей около 3. Каждое разведение назначают одной из групп морских

свинок, каждой из которых вводят подкожно по 1,0 мл этого разведения. Через 28

дней каждой морской свинке обривают оба бока и вводят интрадермально по 0,2 мл

каждого из шести разведений токсина в шесть различных точек на коже каждой из

вакцинированных морских свинок таким образом, чтобы минимизировать помехи

между соседними локализациями.

Определение активности провокационного токсина. При необходимости,

невакцинированным контрольным животным вводят разведения, содержащие 80, 40,

20, 10 и 5 миллионных долей Lf провокационного токсина.

Получение и интерпретация результатов. Все точки провокации

контролируют через

48 часов после инъекции провокационного токсина и

записывают частоту возникновения специфической дифтерийной эритемы.

Записывают также количество точек, в которых такие реакции не возникли и

обозначают это количество как сумму интрадермальной провокации. Суммы

интрадермальной провокации для всех животных, получивших одно и то же

разведение вакцины, сводят в таблицу и используют эти данные после подходящего

преобразования, например,

(сумма)² или arcsin((сумма/6)²) для оценки

относительной активности для каждого из испытуемых препаратов методом

параллельных линий.

Требования к достоверности определения. Результаты испытания

являются достоверными, если:

- как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, средняя сумма,

полученная для нижнего уровня дозировки, менее 3, а средняя сумма, полученная

для верхнего уровня дозировки, более 3,

- в случае проведения соответствующего испытания, разведение токсина с

содержанием 40 миллионных долей Lf приводит к положительной эритеме не менее

чем у 80% морских свинок, а разведение с содержанием 20 миллионных долей Lf

приводит к положительной эритеме менее чем у 80% морских свинок (если эти

критерии не выполняются, следует выбрать другой токсин),

- границы доверительного интервала определения (Р = 0,95) составляют от 50

до 200% от оцененного значения активности,

- при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и

параллельности.

Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более

одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех

достоверных экспериментов.

МЕТОД ЛЕТАЛЬНОЙ ПРОВОКАЦИИ

Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют

здоровых морских свинок из одной партии с массой тела от 250 до 350 г. Морских

свинок делят не менее, чем на шесть равных групп; количество животных в группах

должно быть достаточным для получения результатов, выдерживающих требования

к достоверности определения, приведенные ниже. Если не было показано, что

используемый токсин достаточно стабилен, или если он не был адекватным образом

стандартизирован, дополнительно используют четыре группы по пять морских

свинок в качестве невакцинированного контроля. Используют морских свинок одного

пола; в иных случаях самцы и самки должны быть равномерно распределены по

группам.

Выбор провокационного токсина. Препарат токсина дифтерии должен

содержать не менее 100 LD₅₀ в миллилитре. Если было показано, что препарат

токсина обладает стабильностью, проверка его активности перед каждым

определением не является обязательной.

Приготовление раствора провокационного токсина. Непосредственно

перед использованием провокационный токсин разбавляют подходящим

растворителем с получением раствора провокационного токсина, содержащего

около 100 LD₅₀ в миллилитре. При необходимости порции раствора провокационного

токсина разбавляют тем же растворителем в соотношениях 1:32, 1:100 и 1:320.

Определение активности вакцины. Используя раствор натрия хлорида R

концентрацией

9 г/л, готовят разведения испытуемой вакцины и препарата

сравнения таким образом, чтобы для каждого из препаратов был получен ряд с не

более чем 2,5-кратным различием между последовательными разведениями и в

котором промежуточные разведения при подкожном введении морской свинке в дозе

1,0 мл защищают около

50% животных от летальных эффектов, вызываемых

подкожным введением количества дифтерийного токсина, предписанного для этого

испытания. Растворы каждого разведения назначают одной из групп морских свинок,

каждой из которых вводят подкожно по 1,0 мл этого разведения. Через 28 дней

каждому животному вводят подкожно по 1,0 мл раствора провокационного токсина

(100 LD₅₀).

Определение активности провокационного токсина. При необходимости,

раствор провокационного токсина и три приготовленных из него разведения

назначают по одному каждой из 4 групп по 5 морских свинок и вводят подкожно по

1,0 мл каждого разведения каждой из морских свинок группы, которой это

разведение было назначено.

Получение и интерпретация результатов. Через 4 дня после инъекции

провокационного токсина подсчитывают число выживших морских свинок.

Активность испытуемой вакцины вычисляют относительно активности препарата

сравнения с использованием обычных статистических методов на основе пропорции

выживших животных в каждой из групп вакцинированных морских свинок.

Требования к достоверности определения. Результаты испытания

являются достоверными, если:

- как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, 50% защитная

доза заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата,

введенными морским свинкам,

- в случае проведения соответствующего испытания, количество погибших

животных в

4 группах по

5 морских свинок, которым был введен раствор

провокационного токсина и его разведения, указывает на то, что провокационная

доза приблизительно соответствует 100 LD₅₀,

- границы доверительного интервала определения (Р = 0,95) составляют от 50

до 200% от оцененного значения активности,

- при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и

параллельности.

Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более

одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех

достоверных экспериментов.

2.7.7. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАКЦИНЫ КОКЛЮША

Активность вакцины коклюша определяют путем сравнения дозы вакцины,

необходимой для защиты мышей от эффектов летальной дозы Bordetella pertussis,

вводимой интрацеребрально, с количеством препарата сравнения, калиброванного в

Международных Единицах, требующимся для получения такой же защиты.

За Международную Единицу принимают активность в установленном

количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенной вакцины

коклюша. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах

устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют

здоровых мышей подходящей линии из одной партии, возрастом менее 5 недель.

Разница в массе между самым тяжелым и самым легким животным не должна

превышать 5 г. Мышей делят на шесть групп не менее чем по 16 особей и 4 группы

по 10 особей. Используют мышей одного пола; в иных случаях самцы и самки

должны быть равномерно распределены по группам.

Выбор провокационного штамма и приготовление суспензии для

провокации. Выбирают подходящий штамм B. pertussis, способный привести к

гибели мышей в течение 14 дней после интрацеребральной инъекции. Если в

течение 48 часов после инъекции погибает более 20% мышей, штамм является

неподходящим. Выполняют один пересев штамма и суспендируют собранные B.

pertussis в растворе, содержащем 10 г/л гидролизата казеина R и 6 г/л натрия

хлорида R, и имеющем показатель рН от 7,0 до 7,2, либо в другом подходящем

растворе. Определяют степень мутности суспензии. Готовят ряд разведений с

использованием того же раствора и назначают их по одному каждой из групп по

десять мышей. Каждой мыши вводят интрацеребрально дозу (0,02 или 0,03 мл)

разведения, назначенного группе, к которой она принадлежит. Через

14 дней

подсчитывают в каждой группе количество выживших мышей. Из этих результатов

вычисляют ожидаемую степень мутности суспензии, содержащей 100 LD₅₀ в каждой

провокационной дозе. Для оценки активности испытуемой вакцины производят

свежий пересев того же штамма B. pertussis и готовят из собранных организмов

суспензию со степенью мутности, соответствующей приблизительно 100 LD₅₀ в

каждой провокационной дозе. Готовят 3 разведения провокационной суспензии.

Определение активности. Готовят

3 серийных разведения испытуемой

вакцины и 3 аналогичных разведения препарата сравнения так, чтобы для каждого

из промежуточных разведений ожидаемая степень защиты мышей от летальных

эффектов провокационной дозы B. pertussis составляла 50%. Предлагаемые дозы

составляют 1/8, 1/40 и 1/200 доли человеческой дозы испытуемой вакцины и 0,5 МЕ,

0,1 МЕ и 0,02 МЕ препарата сравнения. Каждая из доз содержится в объеме, не

превышающем 0,5 мл. 6 разведений назначают по одному каждой из групп,

состоящих не менее, чем из 16 мышей, и вводят каждой из мышей внутрибрюшинно

одну дозу разведения, назначенного группе, к которой относится данное животное.

Через 14-17 дней каждому животному из этих групп вводят интрацеребрально одну

дозу суспензии для провокации. Суспензию для провокации и три ее разведения

назначают по одному каждой из групп по 10 мышей и вводят каждой из мышей

интрацеребрально одну дозу каждой суспензии, назначенной группе, к которой

относится данное животное. Мышей, погибших в течение

48 часов после

провокации, не учитывают при оценке результатов. В каждой из групп подсчитывают

количество мышей, выживающих после 14 дней. Активность испытуемой вакцины

вычисляют относительно активности препарата сравнения на основе количества

животных, выживших в каждой из групп из не менее 16 особей.

Результаты испытания являются достоверными, если:

- как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, 50% защитная

доза заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата,

введенными морским свинкам,

- количество погибших животных в 4 группах по 10 мышей, которым была

введена провокационная суспензия и ее разведения, указывает на то, что

провокационная доза приблизительно соответствует 100 LD₅₀,

- при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и

параллельности.

Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более

одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех

достоверных экспериментов.

2.7.8. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАКЦИНЫ СТОЛБНЯКА

(АДСОРБИРОВАННОЙ)

Количественное определение вакцины столбняка

(адсорбированной)

производят путем сравнения дозы вакцины, необходимой для защиты морских

свинок или мышей от эффектов паралитической дозы вводимого подкожно токсина

столбняка, с дозой препарата сравнения, калиброванного в Международных

Единицах, требующейся для получения такой же защиты. В странах, где метод

паралича не является обязательным, может использоваться метод LD₅₀. В этом

случае количества животных и методики идентичны описываемым для метода

паралича, но за конечную точку принимают вместо паралича гибель животных.

За Международную Единицу принимают активность в установленном

количестве Международного Стандарта, состоящего из столбнячного анатоксина,