содержание   ..  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  ..

МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ

ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ ГРУПП МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ КЛАССИФИКАЦИЯ

Схемы классификации. Изучение процессов, вызываемых молочнокислыми бактериями в вине, должно проводиться после предварительного таксономического исследования и определения видовой принадлежности бактерий-возбудителей. Без таксономической идентификации бактерий даже тщательные технологические и биохимические исследования не смогут установить закономерностей в жизнедеятельности бактерий и воспроизвести их. Поэтому все работы в этой области прежде всего начинаются с изолирования из вин чистых культур молочнокислых бактерий и определения их вида.

Первую научную систему классификации молочнокислых бактерий разработал Орла-Иенсен в 1919 г.

Швейцарские исследователи Г. Мюллер-Тургау и А. Остервальдер подробно изучили химические изменения в больных  винах, выделили возбудителей заболевания, изучили их морфологические, культуральные и биохимические свойства и присвоили им видовые названия Bact. mannitopoeum, Bact. gracile, Bact. intermedium, Micrococcus acidovorax, Micrococcus variococcus. Перечисленные названия были даны, однако, произвольно, без сопоставления с известными, уже описанными видами. В современных учебниках по технологии и микробиологии виноделия приводятся описания и названия этих микроорганизмов, которые при критическом рассмотрении являются в лучшем случае синонимами известных ранее.

Е. И. Квасников обосновывает необходимость сравнительного подхода к изучению молочнокислых бактерий, выделенных из различных природных субстратов [68, 73].

Большой вклад в изучение молочнокислых бактерий вина и их классификацию сделан группой ученых винодельческой стандии в Бордо (Франция) под руководством Э. Пейно [295, 300, 315]. Ими изучено более 700 штаммов молочнокислых бактерий, выделенных из вин, и установлено соответствие признаков бактерий, описанных Г. Мюллером-Тургау и А. Остервальдером, вновь выделенным бактериям, идентифицированным по современным системам.

В табл. 33, составленной 3. Д. Рабинович по работам Э. Пейно, приведены возбудители заболеваний вина, идентичные по своим признакам и свойствам ранее описанным.

Таким образом, молочнокислые бактерии вина, описанные Г. Мюллером-Тургау и А. Остервальдером, нашли место в общей системе классификации молочнокислых бактерий и должны именоваться согласно номенклатуре, принятой в настоящее время. Исключение составляет Bact. tartarophtorum, описание которой не удалось идентифицировать ни с одним из выделенных штаммов. Э. Пейно считает, что свойство разлагать винную кислоту, положенное в основу характеристики данного вида, присуще также молочнокислым бактериям других видов и не может считаться основным видовым признаком.

В последние годы было предложено много новых схем и принципов классификаций.

Кроме общепринятых методов изучения морфологических, культуральных и физиологических свойств в качестве диагностических признаков учитывают потребность молочнокислых бактерий в витаминах, инфракрасные спектры поглощения, химический состав клеточных оболочек бактерий, серологические свойства, данные хроматографического изучения свободных аминокислот и другие методы [185].
 

Таблица 33

 

Подробный анализ имеющихся схем классификаций молочнокислых бактерий проведен Е. И. Квасниковым и О. А. Нестеренко в монографии [73]. Схема классификации, предложенная для молочнокислых палочек английскими исследователями М. Рогозой и М. Шарп, признана европейскими микробиологами наиболее удовлетворительной [317].

Род Lactobacillus. К роду молочнокислых бактерий Lactobacillus относятся грамположительные неветвящиеся палочки, неподвижные, не восстанавливающие нитратов в нитриты, не образующие каталазы, сбраживающие углеводы с образованием молочной кислоты. Они характеризуются сложными потребностями в источниках питания, слабой дыхательной активностью, незначительным воздействием на белки и жиры, относительно кислотоустойчивы (способны расти при pH 3,8 и ниже), развиваются в анаэробных условиях.

До настоящего времени общепринятым является разделение рода лактобацилл на три подрода, проведенное Орла-Иенсеном: Thermobacterium объединяют гомоферментативные бактерии, которые развиваются при высоких температурах; Streptobacteri-um — гомоферментативные, развивающиеся при температурах 15—30°С; Betabacterium — гетероферментативные бактерии.

Для определения вида молочнокислых бактерий в литературе описан 41 тест [70]: рост при температуре 15 и 45°С и в присутствии 0,4% типоля, характер роста в лакмусовом молоке, предельное кислотообразование в молоке, конфигурация образуемой молочной кислоты, образование зерен волютина, образование .аммиака из аргинина и углекислого газа из глюкозы и цитратов, гидролиз эскулина, сбраживание арабинозы, ксилозы, рам-нозы, фруктозы, маннозы, галактозы, сорбозы, а-метил-D-ман-нозида, а-метил-D-глюкозида, мальтозы, лактозы, сахарозы, трегалозы, целлобиозы, мелибиозы, рафинозы, мелезитозы, инулина, декстрина, гликогена, крахмала, глицерина, эритрита, адо-нита, маннита, дульцита, сорбита, инозита, салицина, амигда-лина.

А. А. Ленцнер, М. А. Тоом и сотр. [132] отобрали 16 тестов, диагностическая ценность которых, по их мнению, достаточна для определения вида лактобацилл. В табл. 34 приведены физиолого-биохимические свойства некоторых видов молочнокислых бактерий и видовая характеристика палочковидных бактерий, составленная ими с учетом общепризнанных схем классификации.

Согласно схеме классификации М. Рогозы и М. Шарп [317], гетероферментативные палочки L. buchneri отличаются от L. brevis сбраживанием мелезитозы, L. fermenti отличаются от других

гетероферментативных палочек тем, что не растут при температуре 15°С, а растут при 45°С. Гомоферментативные палочки L. plantarum отличаются от гетероферментативных сбраживанием целлобиозы, рамнозы, мелезитозы, маннозы и другими признаками (рис. 32 и 33).

Французские исследователи [266, 315] предлагают и следующим образом обосновывают необходимость введения специфической классификации молочнокислых бактерий для энологиче-ской бактериологии. Сбраживание мелезитозы, целлобиозы, рафинозы и других сахаров для энологии не имеет большого практического значения. Гораздо важнее отношение бактерий к сахарам, распространенным в винных средах, таким, как арабиноза и ксилоза.

Функция сбраживания пентоз у кокков и палочек заслуживает особого внимания. Оказывается, что кокки чрезвычайно редко сбраживают ксилозу, но еще реже палочки сбраживают ара-бинозу. Также немногочисленны кокки, которые сбраживают обе эти пентозы, и палочки, которые не сбраживают ни одну из пентоз.

Таким образом, обнаруживается параллелизм между формой клеток и некоторыми функциями брожения. Эти наблюдения придают большую ценность тестам сбраживания пентоз. В связи с этим предложен для дифференциации молочнокислых палочек пентозный тест, который взят за основу в системе классификации Вогна. Для энологической классификации предложен и второй тест — сбраживание лимонной кислоты.

В табл. 35 приведена классификация молочнокислых бактерий вина на основании пентозного теста и сбраживания лимонной кислоты [315].

Таким образом, по энологической классификации имеется две разновидности L. plantarum: гомоферментативные бактерии,

сбраживающие пентозы и разлагающие лимонную кислоту, и бактерии, разлагающие лимонную кислоту и не сбраживающие пентоз. Такая характеристика бактериальных видов удобна для практического виноделия.

Род Pediococcus. К роду Pediococcus относятся грамположи-тельные, неспорообразующие, неподвижные кокки, располагающиеся единично, парами, кучками (см. рис. 36), тетрадами, но никогда цепочками; микроаэрофильные или анаэробные, часто требующие присутствия С02 для роста, образующие D (—) молочную кислоту или смесь кислот D (—) и L ( + ), не восстанавливающие нитраты и нитриты, не разжижающие желатину, в основном не образующие каталазу, гомоферментативные. Некоторые штаммы продуцируют слизь из сахарозы [73].
 

В вине встречается вид Pediococcus cerevisiae — гомоферментативные кокки, не сбраживающие пентоз. Этот вид анаэробен и требует для своего роста присутствия углекислого газа. Всегда сбраживает глюкозу, фруктозу, маннозу, целлобиозу, трегалозу.

Гомоферментативные кокки, сбраживающие пентозы, относятся к виду Pediococcus pentosaceus.

 

Род Leuconostoc.

 Бактерии рода Leuconostoc относятся к гетероферментативным коккам, имеющим удлиненную яйцевидную форму; располагаются единично, парами или короткими цепочками (рис. 34, 35). Особенностью лейконостоков является неспособность их образовывать из аргинина аммиак, как правило, они не имеют каталазы. При сбраживании углеводов наряду с молочной кислотой образуют С02, этиловый спирт и летучие кислоты; некоторые штаммы образуют маннит из фруктозы. Растут при температуре 10°С, но не при 45°С [73].

Энологический интерес представляет отношение гетероферментативных кокков к пентозам, которые сбраживаются преимущественнее гексоз. Брожение сахарозы и гексоз часто ослабленное и эта черта стабильная, не адаптивная. Предлагается различать варианты вида Leuconostoc oenos (см. табл. 35) по классификации молочнокислых бактерий вин, приведенной выше [315].

Характеристика вида Leuconostoc oenos: гетероферментатив-ные кокки, располагающиеся в виде цепочек, грамположительны, развиваются при pH ниже 5,0 и даже ниже 4,0; микроаэро-фильны или анаэробны, сбраживают глюкозу, иногда сахарозу, редко — рафинозу. Пентозы (арабиноза и ксилоза) сбраживаются обе или одна из них. Яблочная кислота сбраживается при низком pH, сбраживается лимонная кислота. При потреблении сахаров образуется D (—)-молочная кислота. Leuconostoc oenos выделяется из вин при яблочно-молочном брожении, реже — из испорченных вин.

Э. Пейно [297] приводит следующее описание вида Leuconostoc gracile: грамположительные кокки, располагающиеся иногда в виде цепочек, развивающиеся при pH ниже 5,0 и даже ниже 4,0, гетероферментативные, микроаэрофильны или анаэробны. Кроме глюкозы и фруктозы ферментируют лишь немногие сахара. Иногда сбраживают сахарозу, редко мальтозу, в исключительных случаях — лактозу. Не сбраживают арабинозу, ксилозу, рамно-зу. Яблочную кислоту сбраживают при низких значениях pH, всегда разлагают лимонную кислоту. При потреблении сахаров образуется молочная кислота D (—). Leuconostoc gracile изолируется из вин при яблочно-молочном брожении.

По мнению ряда авторов [223, 297, 304, 306], Leuconostoc gracile совершенно идентичен виду Bact. gracile, описанному Г. Мюл-лером-Тургау и А. Остервальдером в 1913 г.

Классификация молочнокислых бактерий, изолированных из вин, выполнена во многих винодельческих районах мира. Проведено определение видового состава молочнокислых бактерий и в нашей стране. По наблюдениям Л. С. Юстратовой [230], из вин Молдавии наиболее часто выделяются гомоферментативные палочки, реже гетероферментативные палочки. Г. Ф. Кондо [79] в молдавских винах неоднократно найдены молочнокислые кокки.

Выделение в чистую культуру и таксономическое определение молочнокислых бактерий из армянских вин проведено Э. О. Петян [138] и Б. П. Авакяном [2]. Определен видовой состав молочнокислых бактерий в винах Крыма (Южный берег, предгорная и степная части), в винах Кировабадского района Азербайджанской ССР и в некоторых винах Одесской области. Выделенные штаммы молочнокислых бактерий принадлежали к го-моферментативным палочкам Lactobacillus plantarum и коккам Pediococcus cerevisiae и гетероферментативным палочкам Lactobacillus brevis и L. buchneri и коккам Leuconostoc gracile и Leuconostoc oenos. В табл. 36 приведен количественный состав выделенных культур по районам и соотношение биохимических групп бактерий. Из приведенных данных видно, что наиболее распространены в исследованных винах гетероферментативные палочки и гетероферментативные кокки. Гомоферментативные палочки и кокки встречались реже. Для сравнения в таблице приведены также данные, полученные Э. Пейно в основном при анализе французских вин [150].
 

В других винодельческих районах соотношение биохимических групп молочнокислых бактерий может быть, несомненно, иным. Не исключена возможность иного соотношения и в зависимости от состава вина, условий года, природных условий района.

Из работ, посвященных экологии молочнокислых бактерий в отдельных винодельческих районах страны, надо отметить исследования Р. Г. Гогоберидзе [47] грузинских вин и В. П. Журавлевой [60] туркменских вин.