содержание .. 5 6 7 8 ..
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ (СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ)
Ионизация, гидратация, растворимость,
осмотические и онкотические свойства, оптические свойства
Физико-химические свойства белков зависят в основном от свойств боковых радикалов аминокислот, входящих в их состав, а также от количества свободных функциональных групп, в том числе аминных и карбоксильных, которые не были использованы для образования пептидных связей. Белки характеризуются высокой вязкостью растворов, незначительной диффузией, способностью к набуханию в больших пределах, оптической активностью, подвижностью в электрическом поле, низким осмотическим и высоким онкотическим давлением, способностью к поглощению УФ-лучей при 280 нм (это свойство, обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, используется для количественного определения белков).
Многие белки хорошо растворяются в воде, что обусловлено наличием на поверхности белковой молекулы свободных гидрофильных групп (– OH, – NH2, – COOH и др.). Растворимые белки ‒ гидрофильные коллоиды, активно связывающие воду; их растворы обладают значительной вязкостью, низким осмотическим давлением. Различные белки растворяются по-разному. Белки опорных тканей (кератин, проколлаген, коллаген, эластин и др.) нерастворимы в воде. Растворимость белка в воде зависит от характера белка, реакции среды и присутствия электролитов. В кислой среде лучше растворяются белки, обладающие кислыми свойствами (альбумины, глобулины, проламины, глютелины); щелочные белки (протамины, гистамины) лучше растворяются в щелочной среде. Различия в растворимости отмечаются как среди кисло-, так и среди щелочнореагирующих белков. Альбумины растворяются в дистиллированной воде, а глобулины растворяются в воде только в присутствии электролитов. Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных NH2- и СООН-групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований. В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных аминокислот белки в растворе несут отрицательный или положительный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при очистке белков методом электрофореза.
Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Молекулы белка не способны проникать через полупроницаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и животных тканей.
Характерной константой белков является изоэлектрическая точка – pI. В изоэлектрической точке суммарный заряд белков, обладающих амфотерными свойствами, равен нулю и белки не перемещаются в электрическом поле. Зная аминокислотный состав белка, можно приближенно определить изоэлектрическую точку. Изоэлектрическая точка большинства белков животных тканей лежит в пределах от 5,5 до 7,0, что свидетельствует о частичном преобладании кислых аминокислот. Однако в природе имеются белки, у которых значения изоэлектрических точек лежат в крайних значениях рН среды. В частности, величина рI пепсина (фермент желудочного сока) равна единице, сальмина (основной белок из молоки семги) – почти двенадцати.
В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и легко выпадают в осадок. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени зависит от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее величину не влияет концентрация белка.
В химии белков существует понятие «изоионная точка белка». Раствор белка называется изоионным, если он не содержит никаких других ионов, кроме ионизированных остатков аминокислот белковой молекулы и ионов, образующихся при диссоциации воды. Для освобождения белка от посторонних ионов его раствор обычно пропускают через колонку, наполненную смесью анионо- и катионообменников. Изоионной точкой данного белка принято называть значение рН изоионного раствора этого белка:
[H+] + [P] ∙ Z = [OH-],
где [Р] – молярная концентрация белка; Z – средний заряд молекулы.
Согласно этому уравнению, изоионная точка белка зависит от его концентрации. Очевидно, поэтому белок, за исключением случая, когда рI равно семи, не может быть одновременно изоэлектрическим и изоионным.
Белки обладают оптической активностью (способностью вещества вращать плоскость поляризации проходящего через него света), поскольку состоят из аминокислот, которые являются энантиомерами.
Все белки, как правило, поглощают ультрафиолетовый свет. На этом свойстве основан спектрофотометрический метод определения белков (по интенсивности поглощения при 280 нм). Обусловлено поглощение в УФ области спектра присутствием в белке ароматических аминокислот – Trp, Tyr, Phe. Условно принято, одна единица оптической плотности раствора при 280 нм соответствует концентрации белка, равной примерно 1 мг/мл (при толщине кюветы 1 см).
Белковые растворы обладают также способностью флуоресцировать – испускать квант света при переходе из электронно-возбужденного состояния в основное. Флуоресцирующими аминокислотными остатками в белках являются Trp, Tyr, Phe.
В видимом диапазоне (380-780 нм) можно определять содержание окрашенных белков – хромопротеинов (гемоглобина, цитохромов и др.). В инфракрасной области спектра (780-10000 нм) поглощают все белки. ИК-спектры используют для определения α-спиральных, β-структурных и аморфных участков в белковых молекулах.
Для растворов белка характерен эффект Тиндаля – рассеивание света белковыми частицами (при боковом освещении виден светящийся конус).
Молекулярная масса и размеры белков. Методы определения
молекулярной массы белков. Необходимость применения комплекса
методов для точной оценки молекулярной массы белков
Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков колеблется от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры белка. Такие полипептидные цепи называются субъединицами. Их молекулярная масса варьирует в широких пределах: от 6000 до 100000 и более. Для выражения молекулярной массы белков используют также специальную единицу – дальтон.
Дальтон (Да) – единица массы, практически равная массе атома водорода (т.е. 1,0000 по шкале атомных масс). Терминами «дальтон» и «молекулярная масса» пользуются как взаимозаменяемыми: например, белок в 20000 дальтон имеет молекулярную массу 20000. Наименование дано в честь Джона Дальтона, разработавшего атомарную теорию строения материи. Килодальтон (кДа) – единица массы, равная 1000 дальтон. Масса большинства белков лежит в пределах от 10 до 100 кДа.
Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для огромного количества встречающихся в природе белков химическое строение не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические, осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и др.). На практике чаще всего используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез.
При определении молекулярной массы белков методами седиментационного анализа используют аналитические ультрацентрифуги (первая ультрацентрифуга была сконструирована в 1923 г. Т. Сведбергом), в которых удается создать центробежные ускорения (g), в 200000 и более раз превышающие ускорение земного притяжения. Обычно молекулярную массу вычисляют по скорости седиментации молекул белка или седиментационному равновесию. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница «растворитель-белок» (регистрируется автоматически). Оптические свойства растворителя и белка используются при определении скорости седиментации; которую выражают через константу седиментации s, зависящую как от массы, так и от формы белковой частицы:
v
S = ------ ,
ω2 ∙ r
где v – скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с; ω – угловая скорость ротора, рад/с; r – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка, см. Константа седиментации имеет размерность времени (ее выражают в секундах). Величина константы седиментации, равная 1·10–13 с, условно принята за единицу и названа сведбергом (S). Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах 1–50 S, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 S.
Для вычисления молекулярной массы, помимо константы седиментации, необходимы дополнительные сведения о плотности растворителя и белка и другие согласно уравнению Сведберга:
RTS
M = ------------
D (1- v ρ)
где R – газовая постоянная, эрг/(моль∙гр.); Т – абсолютная температура (по шкале Кельвина); S – константа седиментации; ρ – плотность растворителя; v – парциальный удельный объем молекулы белка; D ‒ коэффициент диффузии.
Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифугирования требует много времени и дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны простые методы (гель-хроматография и электрофорез).
Гель-хроматографию проводят при заполнении колонки пористым гелем сефадекса. Через колонку пропускают ряд белков с известной молекулярной массой и строят график зависимости логарифма молекулярной массы от значений их элюционных объемов. Между логарифмом молекулярной массы белка, имеющего сферическую форму, и элюционным объемом существует прямая зависимость. Легко определить молекулярную массу исследуемого белка, зная его объем элюции.
Второй разновидностью этого метода является тонкослойная гель-хроматография. Длина пробега белка через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от его молекулярной массы (рис.7.1).
Рис.7.1. Зависимость между длиной пробега белковых частиц при гель-хроматографии в тонком слое сефадекса G-150 и их молекулярными массами
При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле строят график зависимости между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис.7.2).
Рис.7.2. Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле. присутствии додецилсульфата натрия
Электрофорез проводят в присутствии детергента – додецилсульфата натрия (SDS), т.к. только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная зависимость между логарифмом молекулярной массы и подвижностью белков.
Додецилсульфат натрия
Денатурация белков
Природные белки имеют определенную, строго заданную пространственную конфигурацию и характерные физико-химические и биологические свойства при физиологических значениях температуры и рН среды. Под влиянием различных физических и химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства, т.е. денатурируют. Денатурация ‒ нарушение уникальной структуры нативной молекулы белка, ее третичной структуры, приводящее к потере характерных свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность, биологическая активность и т.д.) (рис.7.3). Большинство белков денатурирует уже при нагревании их растворов выше 50–60°С.
Рис.7.3. Денатурация белка: а) нативный белок; б) стадия обратимой денатурации; в) стадия необратимой денатурации
При денатурации происходит потеря растворимости белка, особенно в изоэлектрической точке, повышение вязкости белковых растворов, увеличение количества свободных функциональных SH-групп и изменение характера рассеивания рентгеновских лучей. Характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической, антигенной или гормональной). При денатурации белка разрушаются в основном нековалентные связи (в частности, гидрофобные взаимодействия и водородные связи). Дисульфидные связи в присутствии восстанавливающего агента меркаптоэтанола разрываются, в то время как пептидные связи самого остова полипептидной цепи не затрагиваются. В этих условиях развертываются глобулы нативных белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры.
Денатурация белков с потерей биологической активности может происходить под действием высокой температуры, ультрафиолетового излучения, кислот, щелочей, ионов тяжелых металлов. Денатурация бывает обратимой (ренатурация) и необратимой.
содержание .. 5 6 7 8 ..