содержание .. 4 5 6 7 ..
УРОВНИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКОВ (СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ)
Структурная организация белков
Каждый белок характеризуется специфической аминокислотной последовательностью и индивидуальной пространственной структурой (конформацией). На долю белков приходится не менее 50% сухой массы органических соединений животной клетки. В организме человека насчитывается до 5 млн. различных видов белков. Белковая молекула может состоять из одной или нескольких цепей, содержащих от пятидести до нескольких сотен (иногда ‒ более тысячи) аминокислотных остатков. Молекулы, содержащие менее пятидесяти остатков, относят к пептидам. В состав многих молекул входят остатки цистеина, дисульфидные связи которых ковалентно связывают участки одной или нескольких цепей. В нативном состоянии белковые макромолекулы обладают специфической конформацией. Характерная для данного белка конформация определяется последовательностью аминокислотных остатков и стабилизируется водородными связями между пептидными и боковыми группами аминокислотных остатков, а также электростатическими и гидрофобными взаимодействиями.
Первичная структура белка: методы исследования.
Структурные особенности пептидной связи
Пептидная связь образуется при реакции аминогруппы одной аминокислоты и карбоксильной группы другой с выделением молекулы воды:
СН3-СН(NH2)-COOH + CH3- СН(NH2)-COOH → СН3-СН(NH2)-CO-NH-(CH3) СН-COOH + H2O
Связанные пептидной связью аминокислоты образуют полипептидную цепь. Пептидная связь имеет плоскостную структуру: атомы С, О и N находятся в sp2-гибридизации; у атома N имеется р-орбиталь с неподеленной парой электронов; образуется р-p-сопряженная система, приводящая к укорочению связи С-N (0,132 нм) и ограничению вращения (барьер вращения составляет ~63 кДж/моль). Пептидная связь имеет преимущественно транс-конфигурацию относительно плоскости пептидной связи. Подобное строение пептидной связи сказывается на формировании вторичной и третичной структуры белка. Пептидная связь ‒ жесткая, ковалентная, генетически детерминированная. В структурных формулах изображается в виде одинарной связи, однако на самом деле эта связь между углеродом и азотом носит характер частично двойной связи:
60% 40%
Это вызвано различной электроотрицательностью атомов С, N и O. Вокруг пептидной связи вращение невозможно, все четыре атома лежат в одной плоскости, т.е. компланарны. Вращение же других связей вокруг полипептидного остова достаточно свободно.
Первичная структура была открыта профессором Казанского университета А.Я. Данилевским в 1989 г. В 1913 году Э. Фишером были синтезированы первые пептиды. Последовательность аминокислот для каждого белка уникальна и закреплена генетически.
Трипептид: глицилаланиллизин
Для определения первичной структуры отдельной, химически гомогенной полипептидной цепи методом гидролиза выясняют аминокислотный состав: соотношение каждой из двадцати аминокислот в образце гомогенного полипептида. Затем приступают к определению химической природы концевых аминокислот полипептидной цепи, содержащей одну свободную NH2-группу и одну свободную СООН-группу.
Для определения природы N-концевой аминокислоты предложен ряд методов, в частности, метод Сэнжера (за его разработку Ф. Сэнжер был удостоен Нобелевской премии в 1958 г.). Этот метод основан на реакции арилирования полипептида 2,4-динитрофторбензолом. Раствор полипептида обрабатывают 2,4-динитрофторбензолом, который взаимодействует со свободной α-аминогруппой пептида. После кислотного гидролиза продукта реакции только одна аминокислота оказывается связанной с реактивом в виде 2,4-динитрофениламинокислоты. В отличие от других аминокислот она имеет желтый цвет. Ее выделяют из гидролизата и идентифицируют методом хроматографии.
Для определения С-концевой аминокислоты часто используют ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой, которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии. Существуют и другие методы определения С-концевой аминокислоты, в частности, химический метод Акабори, основанный на гидразинолизе полипептида.
Следующий этап работы связан с определением последовательности аминокислот в полипептиде. Для этого вначале проводят частичный (химический и ферментативный) гидролиз полипептидной цепи на короткие пептидные фрагменты, последовательность которых может быть точно определена. После гидролиза с помощью электрофореза и хроматографии составляют пептидные карты. Затем устанавливают последовательность аминокислот в выделенных пептидах и первичную структуру всей молекулы.
Номенклатура пептидов и полипептидов. Природные пептиды:
глутатион, карнозин, ансерин, грамицидин S, окситоцин, энкефалины
Пептиды ‒ природные или синтетические соединения, молекулы которых построены из остатков α-аминокислот, соединенных пептидными (амидными) связями. Пептиды могут содержать также неаминокислотную компоненту. По числу аминокислотных остатков, входящих в молекулы пептидов, различают дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и т.д. Пептиды, содержащие до десяти аминокислотных остатков, называются олигопептидами, содержащие более десяти аминокислотных остатков – полипептидами. Природные полипептиды с молекулярной массой более 6000 называются белками.
Аминокислотный остаток пептидов, несущий свободную α-аминогруппу, называется N-концевым, а остаток, несущий свободную α-карбоксильную группу – С-концевым. Название пептида образуется из названий входящих в его состав аминокислотных остатков, перечисляемых последовательно, начиная с N-концевого. При этом используют тривиальные названия аминокислот, в которых суффикс "ин" заменяется на "ил". Исключение составляет C-концевой остаток, название которого совпадает с названием соответствующей аминокислоты. Все аминокислотные остатки, входящие в пептиды, нумеруются, начиная с N-конца. Для записи первичной структуры пептида (аминокислотной последовательности) широко используют трех- и однобуквенные обозначения аминокислотных остатков (например, Ala-Ser-Asp-Phe-GIy – это аланил-серил-аспарагил-фенилаланил-глицин).
Отдельные представители пептидов
Глутатион — трипептид g-глутамилцистеинилглицин, содержащийся во всех животных и растительных клетках, бактериях.
Глутатион участвует в ряде окислительно-восстановительных процессов. Он выполняет функцию антиоксиданта. Это обусловлено наличием в его составе цистеина и определяет возможность существования глутатиона в восстановленной и окисленной формах.
Карнозин (от лат. carnosus ‒ мясной, caro ‒ мясо), C9H14O3N4, – дипептид (β-аланилгистидин), состоящий из аминокислот β-аланина и L-гистидина. Открыт в 1900 г. В. С. Гулевичем в мясном экстракте. Молекулярная масса 226, кристаллизуется в виде бесцветных игл, хорошо растворим в воде, нерастворим в спирте. Содержится в скелетной мускулатуре большинства позвоночных. Среди рыб встречаются виды, у которых карнозин и составляющие его аминокислоты отсутствуют (либо присутствует только L-гистидин или только β-аланин). В мышцах беспозвоночных карнозина нет. Содержание карнозина в мышцах позвоночных колеблется обычно от 200 до 400 мг% их сырой массы и зависит от их структуры и функции; у человека ‒ около 100-150 мг%.
Карнозин (β-аланил-L-гистидин) Ансерин (β-аланил-1-метил- L-гистидин)
Влияние карнозина на биохимические процессы, протекающие в скелетных мышцах, разнообразно, однако окончательно биологическая роль карнозина не установлена. Добавление карнозина к раствору, омывающему мышцу изолированного нервно-мышечного препарата, вызывает восстановление сокращений утомлённой мышцы.
Дипептид ансерин (N-метилкарнозин или β-аланил-1-метил- L-гистидин), сходный по строению с карнозином, в мышцах человека отсутствует, но имеется в скелетных мышцах тех видов, мышцы которых способны к быстрым сокращениям (мышцы конечностей кролика, грудная мышца птиц). Физиологические функции β-аланил-имидазольных дипептидов не вполне ясны. Возможно, они выполняют буферные функции и поддерживают рН в скелетной мышце, сокращающейся в анаэробных условиях. Однако ясно, что карнозин и ансерин стимулируют АТР-азную активность миозина in vitro, увеличивают амплитуду мышечного сокращения, предварительно сниженную утомлением. Академик С.Е. Северин показал, что имидазолсодержащие дипептиды не влияют непосредственно на сократительный аппарат, но увеличивают эффективность работы ионных насосов мышечной клетки. Оба дипептида образуют хелатные комплексы с медью и способствуют поглощению этого металла.
Антибиотик грамицидин S выделен из Bacillus brevis и представляющий собой циклический декапептид:
Грамицидин S
В структуре грамицидина S имеются 2 остатка орнитина, производные аминокислоты аргинина и 2 остатка D-изомеров фенилаланина.
Окситоцин − гормон, вырабатываемый нейросекреторными клетками передних ядер гипоталамуса и затем переносимый по нервным волокнам в заднюю долю гипофиза, где он накопляется и откуда выделяется в кровь. Окситоцин вызывает сокращение гладких мышц матки и в меньшей степени − мышц мочевого пузыря и кишечника, стимулирует отделение молока молочными железами. По химической природе окситоцин − октапептид, в молекуле которого 4 остатка аминокислот связаны в кольцо цистином, соединённым также с трипептидом: Pro-Leu-Gly.
окситоцин
Рассмотрим нейропептиды (опиатные пептиды). Первые два представителя нейропептидов, названные энкефалинами, были выделены из мозга животных:
Тир — Гли — Гли — Фен — Мет- Мет-энкефалин
Тир — Гли — Гли — Фен — Лей- Лей-энкефалин
Эти пептиды обладают обезболивающим действием и используются как лекарственные средства.
Вторичная структура белков: a-спираль, ее основные
характеристики, b-структура, b-изгиб. Роль водородных связей в формировании вторичной структуры. Сверхвторичные (надвторичные) структуры белка
Вторичная структура − это пространственное расположение полипептидной цепочки в виде α-спирали или β-складчатости безотносительно к типам боковых радикалов и их конформации.
Л. Полинг и Р. Кори предложили модель вторичной структуры белка в виде α-спирали, в которой водородные связи замыкаются между каждой первой и четвертой аминокислотой, что позволяет сохранять нативную структуру белка, осуществлять простейшие функции, защищать от разрушения. В образовании водородных связей принимают участие все пептидные группы, что обеспечивает максимальную стабильность, снижает гидрофильность и увеличивает гидрофобность белковой молекулы. α-спираль образуется самопроизвольно и является наиболее устойчивой конформацией, отвечающей минимуму свободной энергии.
Наиболее распространенным элементом вторичной структуры является правая α-спираль (αR). Пептидная цепь здесь изгибается винтообразно. Ha каждый виток приходится 3,6 аминокислотного остатка, шаг винта, т.е. минимальное расстояние между двумя эквивалентными точками, составляет 0,54 нм; α-спираль стабилизирована почти линейными водородными связями между NH-группой и СО-группой четвертого по счету аминокислотного остатка. Таким образом, в протяженных спиральных участках каждый аминокислотный остаток принимает участие в формировании двух водородных связей. Неполярные или амфифильные α-спирали с 5-6 витками часто обеспечивают заякоривание белков в биологических мембранах (трансмембранные спирали). Зеркально-симметричная относительно αR-спирали левая α-спираль (αL) встречается в природе крайне редко, хотя энергетически возможна. Закручивание полипептидной цепи белка в спиралеобразную структуру происходит вследствие взаимодействия между кислородом карбонильной группы i-того аминокислотного остатка и водородом амидогруппы (i+4)- аминокислотного остатка посредством образования водородных связей (рис.6.1).
Рис. 6.1. Вторичная структура белка: α-спираль
Другая форма спирали присутствует в коллагене, важнейшем компоненте соединительных тканей. Это левая спираль коллагена с шагом 0,96 нм и при остатке в 3,3 в каждом витке более пологая по сравнению с α-спиралью. В отличие от α-спирали образование водородных мостиков здесь невозможно. Структура стабилизирована за счет скручивания трех пептидных цепей в правую тройную спираль.
Наряду с α-спиралями в образовании вторичной структуры белка принимают также участие β-структуры, β-изгиб.
В отличие от конденсированной α-спирали β-слои почти полностью вытянуты и могут располагаться как параллельно, так и антипараллельно (рис.6.2).
а) б)
Рис.6.2. Параллельное (а) и антипараллельное (б) расположение β-слоев
B складчатых структурах также образуются поперечные межцепочечные водородные связи (рис.6.3). Если цепи ориентированы в противоположных направлениях, структура называется антипараллельным складчатым листом (βα); если цепи ориентированы в одном направлении, структура называется параллельным складчатым листом (βn). В складчатых структурах α-С-атомы располагаются на перегибах, а боковые цепи ориентированы почти перпендикулярно средней плоскости листа, попеременно вверх и вниз. Энергетически предпочтительной оказывается βα-складчатая структура с почти линейными H-мостиками. В растянутых складчатых листах отдельные цепи чаще всего не параллельны, а несколько изогнуты относительно друг друга.
Рис.6.3. β-складчатая структура
Кроме регулярных в полипептидных цепях есть еще и нерегулярные вторичные структуры, т.е. стандартные структуры, не образующие длинных периодических систем. Это – β-изгибы они называются так потому, что часто стягивают верхушки соседних β-тяжей в антипараллельных β-шпильках). В изгибы обычно входит около половины остатков, не опавших в регулярные структуры белков.
Супервторичная структура − это более высокий уровень организации белковой молекулы, представленный ансамблем взаимодействующих между собой вторичных структур:
1. α-спираль − два антипараллельных участка, которые взаимодействуют гидрофобными комплементарными поверхностями (по принципу «впадина-выступ»);
2. сверхспирализация α-спирали;
3. βхβ − два параллельных участка β-цепи;
4. β-зигзаг.
Встречаются разнообразные способы укладки белковой цепи (рис. 6.5). Рисунок 6.5 взят с обложки журнала Nature 1977 г. (v.268, №.5620), где была напечатана статья Дж. Ричардсона о мотивах укладки белковых цепей.
Домен – компактная глобулярная структурная единица внутри полипептидной цепи. Домены могут выполнять разные функции и подвергаться свертыванию в независимые компактные глобулярные структурные единицы, соединенные между собой гибкими участками внутри белковой молекулы.
Третичная структура белков. Типы нековалентных связей,
стабилизирующих третичную структуру. Роль S-S-мостиков
в формировании третичной структуры некоторых белков
Под третичной структурой понимают пространственное расположение полипептидной цепи (способ укладки цепи в определенном объеме). В стабилизации пространственной структуры основную роль играют нековалентные связи. К ним относятся водородные связи, электростатические взаимодействия заряженных групп, межмолекулярные ван-дер-ваальсовы силы, взаимодействия неполярных боковых радикалов аминокислот (гидрофобные взаимодействия), диполь-дипольные взаимодействия. Кроме того, важную роль в формировании третичной структуры играют дисульфидные связи (S-S-мостики) (рис.6.4).
Рис.6.4. Связи, стабилизирующие третичную структуру белка: а) электростатические силы; б) водородная связь; в) гидрофобное взаимодействие; г) диполь-дипольные взаимодействия; д) дисульфидная связь
Дисульфидные связи образуются при окислении сближенных в пространственной структуре белка остатков цистеина в остатки цистина. Считают, что дисульфидные связи, часто множественные, особенно важны для стабилизации маленьких белков, в которых не может возникнуть обширной системы нековалентных взаимодействий.
Третичная структура – уникальное для каждого белка расположение в пространстве полипептидной цепи, зависящее от количества и чередования аминокислот, т.е. предопределенное первичной структурой белка. Конфигурация белковых молекул может быть фибриллярной и глобулярной. Третичная структура многих белков составляется из нескольких компактных глобул, называемых доменами. Между собой домены обычно бывают связаны тонкими перемычками ‒ вытянутыми аморфными полипептидными цепями (рис.6.5).
Рис.6.5. Характерные мотивы укладки белковой цепи
Кроме того, в белках встречаются мотивы укладки полипептидной цепи, похожие на орнаменты на индейских и греческих вазах: мотив меандра, мотив греческого ключа, мотив зигзага-"молнии" (рис. 6.6).
При свертывании белковой глобулы значительная часть (не менее половины) гидрофобных радикалов аминокислотных остатков оказывается скрытой от контакта с окружающей белок водой. Происходит образование своеобразных внутримолекулярных «гидрофобных ядер». В них особенно представлены объемные остатки лейцина, изолейцина, фенилаланина, валина.
Рис.6.6. Мотивы укладки белковой цепи и орнаменты на индейских и греческих вазах. Вверху: мотив меандра; в середине: мотив греческого ключа; внизу: мотив зигзага-"молнии"
С появлением третичной структуры у белка появляются новые свойства – биологические. В частности, проявление каталитических свойств связано с наличием у белка третичной структуры. И наоборот, нагревание белков, приводящее к разрушению третичной структуры (денатурация), приводит и к утрате биологических свойств.
Четвертичная структура белков. Количество и типы субъединиц.
заимодействия между субъединицами, стабилизирующие четвертичную структуру. Функциональное значение четвертичной структуры белков
Четвертичная структура − это надмолекулярное образование, состоящее из двух и более полипептидных цепей, связанных между собой нековалентно, а водородными связями, электростатическими, диполь-дипольные и гидрофобными взаимодействиями между остатками аминокислот, находящихся на поверхности. Примером может служить молекула гемоглобина, вирус табачной мозаики (2130 субъединиц).
Каждый из белков-участников третичной структуры при образовании четвертичной структуры называют субъединицей или протомером. Образовавшуюся молекулу называют олигомером, или мультимером. Олигомерные белки чаще построены из четного количества протомеров с одинаковыми или разными молекулярными массами. В образовании четвертичной структуры белка принимают участие те же связи, что и при образовании третичной структуры, за исключением ковалентных.
Объединение белковых молекул третичной структуры без появления новых биологических свойств называют агрегированным состоянием. Как четвертичная структура, так и агрегированное состояние могут быть обратимо разрушены с применением детергентов, в частности, додецилсульфата натрия или неионных детергентов типа тритона. Очень часто для разрушения четвертичной структуры исследуемый белок нагревают при 100°С в присутствии 1%-ного 2-меркаптоэтанола и 2%-ного додецилсульфата натрия. В таких условиях восстанавливаются -S-S-связи между остатками Cys, которые в некоторых случаях удерживают субъединицы четвертичной структуры.
Субъединицы, образующие четвертичную структуру белка, могут быть различными как по строению, так и по функциональным свойствам (гетеромеры). Это позволяет объединить в одной структуре несколько взаимосвязанных функций, создать полифункциональную молекулу. Например, в протеинкиназе, стехиометрия червертичной структуры которой отвечает формуле С2R2, субъединица С ответственна за ферментативную активность, осуществляя перенос фосфатного остатка от АТР на белок; субъединица R является регуляторной. В отсутствие циклического АМР последняя связана с С-субъединицей и ингибирует ее. При образовании комплекса с сАМР четвертичная структура распадается и С-субъединицы оказываются способными фосфорилировать белковые субстраты. В гомомерных белках субъединицы одинаковы.
Подавляющая часть белков, имеющих четвертичную структуру, приходится на димеры, тетрамеры и гексамеры, последние встречаются у белков с молекулярной массой, большей 100 кДа.
Характерной особенностью белков с четвертичной структурой является их способность к самосборке. Взаимодействие протомеров осуществляется с высокой специфичностью, благодаря образованию десятка слабых связей между контактными поверхностями субъединиц, поэтому ошибки при формировании четвертичной структуры белков исключены.
Практически все белки-ферменты имеют четвертичную структуру и состоят, как правило, из четного числа протомеров (двух, четырех, шести, восьми). Четвертичная структура белка подразумевает такое объединение белков третичной структуры, при котором появляются новые биологические свойства, не характерные для белка в третичной структуре. В частности, такие эффекты, как кооперативный и аллостерический, характерны лишь для белков с четвертичной структурой.
Четвертичная структура – последний уровень в организации белковой молекулы, причем не обязательный – до половины известных белков ее не имеют.
содержание .. 4 5 6 7 ..