содержание .. 17 18 19 20 ..

Руководство по иммунофармакологии - часть 19

Хромогликат

245

зинофилов, что, возможно, указывает на ак-

подобных препаратов значительно варьируют и

тивацию in vivo первых клеток и выделение

находятся в обратной зависимости от силы

хемотаксических факторов-вторыми. Более

секреторного стимула. Таким образом, хромон

того, отмечается положительная корреляция

может представлять собой более чем сильный

между числом полученных тучных клеток и тя-

ингибитор секреции гистамина бронхоальвео-

жестью заболевания, определяемого индексами

лярными клетками in vivo при обычном в кли-

обструкции воздушного потока. Бронхо-

нических ситуациях уровне секреции. Вероятно,

альвеолярные клетки больных астмой значи-

что использование препарата связано, по край-

тельно более чувствительны к стимуляции

ней мере частично, и с этим действием.

анти-IgE и выделяют гораздо больший процент

Разнообразие чувствительности к препарату

общего гистамина при всех эффективных дозах

наглядно показывает сложности, существующие

антисыворотки. Это усиление ответа относится

при подборе тест-системы для скрининга

лишь к клеткам легких, а для базо-филов

потенциальных

противоаллергических

периферической крови больных астмой и

препаратов. Более того, если такие препараты

здоровых людей не выявлено разницы в ин-

проявят тканевую специфичность, сходную с

дуцированной анти-IgE секреции гистамина.

хромогликатом, который, например, активен в

Клетки из лаважной жидкости аллергических

отношении бронхоальвеолярных, но не кожных

доноров выделяют гистамин и при использо-

тучных клеток человека, то вряд ли какое-то

вании специфического антигена.

одно соединение станет панацеей при всех

Эти данные имеют клиническое значение,

аллергических нарушениях. Необходим целый

поскольку лаважные клетки локализуются в

ряд препаратов, направленных как на особые

дыхательных путях или альвеолах (или в не-

тучные клетки, так и на специфические

посредственной близости от них). Таким обра-

болезненные состояния.

зом, они легко и немедленно вступают в кон-

такт с вдыхаемым антигеном, а при активации

выделяют медиаторы непосредственно на по-

верхность дыхательных путей. Ввиду этого они

могут представлять собой тип тучных клеток,

имеющих первичное значение в начальном па-

тогенезе астмы человека. Более того, ввиду их

поверхностной локализации в дыхательных пу-

тях лаважные клетки подвергаются наиболь-

шему воздействию хромогликата in vivo. До-

полнительное значение имеет повышенная чув-

ствительность данных клеток к препарату по

сравнению с паренхиматозными тучными клет-

ками. Однако необходимо помнить и о чрезвы-

чайной трудности соотнесения активности в

препаратах in vitro и in vivo. В практических

целях эксперименты in vitro обычно проводятся

таким образом, чтобы обеспечить получение

30% (или более) подавления секреции гистами-

на от его общего содержания в клетке. Однако

часть гистамина, выделяемого in vivo даже во

время наиболее сильного приступа, вероятно,

гораздо меньше этого значения. Хорошо изве-

стно, что эффекты хромогликата и других

Противовоспалительное действие

кортикостероидов

Р.Дж. Флауэр, М.М. Дейл (R.J. Flower, M.M. Dale)

Кортикостероиды- природные

Влияние глюкокортикоидов на

гормоны

системы организма

Кортикостероиды-это гормоны, секретируе-мые

По своей значимости эффекты глюкокортико-

корой надпочечников. Они классифицируются

идов могут быть разделены на две категории: 1)

как

глюкокортикоиды,

влияющие

на

противовоспалительные и иммунодепрес-

углеводный и белковый обмен и обладающие

сивные; 2) метаболические и опосредованные

противовоспалительными эффектами, и ми-

гипоталамусом и передним гипофизом эффек-

нералокортикоиды, играющие важную роль в

ты обратной негативной связи, а также неко-

водном и электролитном балансе. В данной

торые другие. При физиологическом выделе-

главе рассматриваются глюкокортикоиды.

нии глюкокортикоидов в условиях целостного

К основным природным глюкокортикои-дам

организма все эти эффекты обеспечивают вы-

относятся

кортизол

(гидрокортизон)

живание, особенно в условиях, угрожающих

кортикостерон. Кортизол намного активнее

жизни. Те же эффекты необходимы при прове-

кортикостерона и составляет 90% всех корти-

дении заместительной терапии в случае недо-

костероидов, вырабатываемых в организме че-

статочной функции коры надпочечников. Од-

ловека; у животных могут преобладать другие

нако при использовании глюкокортикоидов в

глюкокортикоиды.

качестве противовоспалительных препаратов

Уровень кортизола в плазме составляет 4- 16

все эффекты, кроме противовоспалительных,

мкг/100 мл; отмечаются суточные колебания его

считаются побочными и нежелательными.

концентрации: максимум - примерно в 8ч утра и

Разнообразие биологических эффектов глю-

минимум

- около

16 ч. Для достижения

кокортикоидов может, на первый взгляд, вы-

противовоспалительного эффекта необходима

зывать недоумение, но недавно была предло-

концентрация примерно 100 мкг/100 мл.

жена гипотеза, объясняющая это положение.

Эндогенные глюкокортикоиды не циркули-

Идея, выдвинутая Munck и соавт. в 1984 г.,

руют в плазме в свободной форме. В плазме

предполагает, что глюкокортикоиды секрети-

крови содержится кортикостероидсвязываю-

руются для предотвращения выхода из-под

щий глобулин, который вместе с альбумином

контроля защитных механизмов организма,

связывает примерно

90% общего количества

которые активируются при заболевании и спо-

плазменных глюкокортикоидов. Функция этого

собны нарушать гомеостаз. Под защитными

белка изучена не полностью, однако известно,

механизмами Munck подразумевает такие ре-

что его содержание в крови меняется при

акции на травму и заболевание, как воспаление,

заболеваниях, беременности и других состоя-

лихорадка, боль и др.

ниях.

Другими словами, глюкокортикоиды со-

Глюкокортикоиды не хранятся в готовом

ставляют часть регуляторных механизмов,

виде, а синтезируются и выделяются при сти-

контролирующих реакции воспаления, и нахо-

муляции клеток коры надпочечников кортико-

дятся в состоянии тонической активности у

тропином, пептидным гормоном передней доли

здоровых млекопитающих. При лечении боль-

гипофиза.

ных экзогенными стероидами уровень гормо-

Выделение кортикотропина регулируется

нального подавления защитных механизмов

кортикотропин-рилизинг-фактором гипотала-

возрастает почти до максимального значения.

муса (КРФ), а глюкокортикоиды по механизму

отрицательной обратной связи оказывают

Противовоспалительное действие

влияние на высвобождение этих двух гормонов

глюкокортикоидов

(рис. 104).

В течение многих лет наши представления о

246

функции глюкокортикоидов в организме бы-

Кортикостероиды

247

Рис. 104. Регуляция синтеза и выделения

кортикостероидов гормонами переднего

гипофиза и гипоталамуса. Знак плюс-

стимулирующий эффект; знак минус-

тормозящий эффект.

ли довольно туманными. С 30-х годов извест-

том, часто наступает стойкая ремиссия во время

но, что у человека и животных при стрессе,

беременности, а также при желтухе. Известно,

травмах и инфекциях в крови обязательно

что при беременности в крови наблюдается

повышается уровень стероидов. Известный

резкий подъем уровня глюкокортикоидов, по-

австрийский физиолог Ганс Селье объяснял эту

этому Hench высказал догадку, что именно эти

реакцию защитным механизмом и считал, что

гормоны обладают противовоспалительным

стероиды так или иначе поддерживают

действием. Данная работа по времени совпала с

воспаление1. Селье выделил много различных

получением синтетического кортизола, бла-

физиологических реакций на стресс, отметил

годаря чему Hench смог с успехом применить

их стереотипность и назвал их комплекс «об-

гормон у больных ревматоидным артритом и

щим адаптационным синдромом».

другими хроническими воспалительными за-

Идея Селье длительное время оказывала и

болеваниями. Эта работа заложила основу

продолжает оказывать влияние на наше

современной глюкокортикоидной терапии.

мышление, однако данные, полученные вскоре

Сейчас известно, что препараты данной группы

после второй мировой войны, внесли некото-

исключительно эффективны практически при

рые сомнения относительно оценки роли сте-

всех воспалительных заболеваниях независимо

роидов. Американский врач Phillip Hench об-

от их причинных факторов. Противовос-

наружил, что у женщин, страдающих артри-

палительные стероиды (кортизол и его синте-

тические аналоги) относятся к наиболее часто

назначаемым лекарственным препаратам, но, к

сожалению, их терапевтическая ценность при

1 Было бы ошибкой относить воспаление к патологическим

воспалительных заболеваниях снижается, так

процессам. Без адекватной способности к воспалительной

реакции организм не может противостоять инфекции и

как их длительное применение чревато разви-

восстанавливать ткани после травмы.

тием побочных эффектов.

!?•

248

Глава 24

Уровни подавления воспаления

Таблица 24. Некоторые медиаторы воспаления, синтез или

действие которых снижается глюкокортикоидами

глюкокортикоидами

Интерферон

Глюкокортикоиды подавляют как ранние, так и

Интерлейкин-1

поздние проявления острого воспаления-по-

Интерлейкин-2

Субстанции, стимулирующие естественные киллеры

краснение, жар, боль, отек, а также последую-

Простагландины

щие процессы репарации и заживления ран. Они

Лейкотриены

подавляют воспаление любого типа вне

Брадикинин

зависимости от вызвавшей его причины: внед-

Фактор активации тромбоцитов

рившийся патоген, физический или химический

Гистамин

Нейтральные протеазы

стимул, неадекватно развившийся иммунный

ответ при повышенной чувствительности или

при аутоиммунном заболевании.

При применении глюкокортикоидов умень-

ствием глюкокортикоидов. Они также снижают

шаются вазодилатация и экссудация. Умень-

поступление лимфоцитов в область клеточ-но-

шение вазодилатации частично связано с сосу-

опосредованных иммунных реакций. Кроме

досуживающим действием на небольшие кро-

того, уменьшается активность макрофагов, что

веносные сосуды. Особенно заметно сокраще-

отчасти связано с сокращением продукции

ние накопления лейкоцитов (как нейтрофилов,

лимфокинов, а также с понижением их чувстви-

так и моноцитов) в месте воспаления, что,

тельности к действию лимфокинов. В резуль-

вероятно, является одной из основных причин

тате начинается неконтролируемый рост ту-

снижения резистентности организма к инфек-

беркулезных бацилл и других микроорганиз-

ции. Уменьшение поступления нейтрофилов в

мов, которые в норме сдерживаются макрофа-

зону воспаления сопровождается их повы-

гами, активированными лимфокинами.

шенным выходом из костного мозга, что при-

Влияние глюкокортикоидов на воспали-

водит к нейтрофильному лейкоцитозу (см. главу

тельную реакцию в одном из ее аспектов изу-

20). Напротив, уменьшение выхода моноцитов

чено особенно хорошо и будет описано ниже.

из костного мозга приводит к снижению их

количества в крови. Мононуклеарные фагоциты

Влияние глюкокортикоидов

менее активны против бактерий; отмечается

на обменные процессы

также ослабление секреции нейтральных про-

теаз. Снижается активность фибробластов, ко-

и его связь с побочными эффектами

торые продуцируют меньшие количества кол-

лагена и мукополисахаридов.

Глюкокортикоиды оказывают сильное влияние

Действие глюкокортикоидов на лимфоциты

на метоболизм углеводов, уменьшая захват и

зависит от вида животных. У видов, чувстви-

утилизацию глюкозы, а также увеличивая

тельных к стероидам (кролики, крысы, мыши),

глюконеогенез и отложение гликогена. Ре-

глюкокортикоиды вызывают лимфолизис, ко-

зультирующим действием гормонов является

торый приводит к уменьшению количества Т-и

тенденция к повышению уровня сахара в крови.

В-клеток и их продуктов. У резистентных видов

Под действием глюкокортикоидов снижается

(люди, обезьяны, морские свинки) лимфолизис

синтез белка и усиливается их метаболизм, что

или отсутствует, или бывает незначительным.

приводит к отрицательному азотному балансу.

Однако в системах определения in vitro

В жировом обмене отмечается усиление

обнаруживается ослабление пролифера-тивной

липолиза за счет «пермиссивного» влияния на

реакции на митогены и антигены, что связано со

действие других липолитических гормонов.

снижением

образования

интерлей-кина-2

Вообще, роль глюкокортикоидов заключается в

(ростовой фактор Т-клеток). В таком случае

поддержании гомеостаза глюкозы за счет

влияние глюкокортикоидов на первичный

привлечения различных субстратов, таких как

иммунный ответ выражено сильнее, чем на

гликоген, белок и жиры.

вторичный, поскольку клональная экспансия

Глюкокортикоиды обладают и некоторым

клеток при вторичном ответе уже снижена в

влиянием на водный и электролитный баланс.

результате уменьшенной продукции интер-

Кроме того, они имеют важное значение в под-

лейкина-2 (см. рис. 4).

держании целостности мышечной, сердечно-

В табл. 24 приведен список медиаторов вос-

сосудистой и центральной нервной систем.

паления, синтез которых нарушается под дей-

Хотя системные метаболические эффекты

Кортикостероиды

249

не имеют отношения к противовоспалительно-

ских аналогов гидрокортизона

(в отличие от

му действию глюкокортикоидов, их понимание

обычных попыток получения новых патенто-

необходимо для оценки побочных эффектов

ванных средств) является увеличение длитель-

препаратов (см. ниже).

ности их действия. Совершенно очевидно (см.

табл. 25), что период полураспада гидрокорти-

зона очень короток и продолжительность дей-

Глюкокортикоидные препараты,

ствия некоторых его синтетических аналогов

содержащие синтетические

значительно его превышает. Это было достиг-

производные гидрокортизона

нуто благодаря синтезу производных гидро-

кортизона

(часто фторированных), которые

Кортикостероиды, образующиеся в коре над-

обладают повышенным связыванием с рецеп-

почечников, обладают широким спектром ак-

тором (см. ниже), пониженным метаболизмом в

тивности-от минералокортикоидной, с одной

организме и не связываются кортикостероид-

стороны, до глюкокортикоидной-с другой. Так,

связывающим белком.

альдостерон, главный эндогенный мине-

Совершенно очевидно, что эти сильные син-

ралокортикоид, вызывает сильную задержку

тетические соединения обладают рядом пре-

натрия в почках, но также оказывает некоторое

имуществ, связанных с удобством дозирования,

влияние на метаболизм углеводов. Кортизол,

быстротой и длительностью терапевтического

основной глюкокортикоид, обладает очень

действия. Однако указанные преимущества

сильным противовоспалительным действием и

нередко нивелируются побочными эффектами,

влияет на углеводный обмен; вместе с тем он

также более выраженными, чем у природного

проявляет и некоторую минералокортикоид-

гормона.

ную активность. При получении синтетических

стероидов усилия были направлены на разде-

Опасность длительного применения

ление противовоспалительных и минералокор-

тикоидных эффектов. В табл.

25 приведены

глюкокортикоидов

сравнительные данные о минералокортикоид-

ной и глюкокортикоидной активности различ-

В терапии глюкокортикоиды применяются в

ных кортикостероидов, причем в качестве стан-

основном для получения противовоспалитель-

дарта принята активность кортизола.

ных и иммуносупрессивных эффектов. Они

Другой задачей при разработке синтетиче-

применяются в трансплантационной хирургии,

Таблица 25. Сравнительная активность природных и синтетических стероидов (в качестве стандарта принята активность

гидрокортизона)

Неактивен; в активную форму переходит в организме.

Сублингвальное введение.

Инъекция.

250

Глава 24

Таблица 26. Побочные эффекты длительной терапии глю-

Внутриклеточные рецепторы

кокортикоидами

глюкокортикоидов

Горб буйвола

Лунообразное лицо

В настоящее время хорошо известно, что по-

Повышенная кровоточивость (экхимозы)

давляющее большинство (а возможно, и все)

Гипертензия

биологических эффектов глюкокортикоидов,

Остеопороз

имеющих эндогенное происхождение или вве-

Мышечная слабость

Пониженная резистентность к инфекциям

денных экзогенно, опосредуется сложным ря-

Истончение кожи

дом событий, возникающих при связывании

Глаукома

гормонов со специфическими внутриклеточны-

ми рецепторами.

Клетки большинства тканей организма об-

а также при лечении заболеваний, при которых

ладают внутриклеточными стероидными ре-

происходит неадекватное развитие иммунных

цепторами. Они представляют собой асиммет-

реакций (аутоиммунные заболевания и различ-

ричные белки с молекулярной массой 30000-

ные формы гиперсенситивности). Это очень

50000 дальтон. Плотность рецепторов состав-

ценные препараты, порой даже спасающие

ляет от 3000 до 100000 на клетку; рецепторы

жизнь. Однако при назначении глюкокортико-

высокоаффинны, константа диссоциации-0,1-10

идов как противовоспалительных препаратов

нМ. Стероиды легко проникают в клетку, и их

следует помнить, что они подавляют проявле-

взаимодействие с рецепторами приводит к

ния воспаления, не устраняя его причины. Нор-

изменению конформации рецептора, в ре-

мальная биологическая реакция на интеркур-

зультате чего открываются места связывания

рентные инфекции также подавляется, поэтому

для ядерного материала. Рецептор состоит из

активизируются латентные инфекции, например

двух субъединиц, участвующих в связывании

туберкулез.

стероидов. Одна субъединица несет также мес-

В современных синтетических препаратах

то связывания с белком хроматина, а другая-с

успешно разделены минералокортикоидная и

ДНК. Комплекс движется в ядро и взаимодей-

глюкокортикоидная активность, поэтому неко-

ствует со специфическими контролирующими

торые глюкокортикоиды практически не об-

местами на чувствительных к стероидам генах,

ладают минералокортикоидной активностью.

ускоряя или замедляя транскрипцию гена. В

Отделение противовоспалительной актив-

первом случае увеличивается синтез соответ-

ности от метаболических эффектов оказалось

ствующей информационной РНК, что приводит

безуспешным, поэтому использование глюко-

к повышению синтеза специфических белков.

кортикоидов как противовоспалительных пре-

Эти белки представляют собой медиаторы

паратов, особенно в течение длительного вре-

эффектов стероидов (рис. 105). После взаимо-

мени, чревато возникновением выраженного

действия комплекс рецептор - стероид диссо-

влияния на обмен углеводов, белков и жиров, а

циирует вне ядра, а рецептор регенерирует.

также подавлением активности системы ги-

Предполагается, что стероиды, помимо транс-

поталамус

- гипофиз

- надпочечники. Резкое

крипционного контроля, описанного выше,

прекращение терапии чревато появлением у

осуществляют посттранскрипционный конт-

больного состояния адренокортикальной не-

роль, однако конкретных данных, свидетельст-

достаточности.

вующих в пользу его существования, пока

Переносимость кратковременной терапии

слишком мало. В большинстве же эффектов

даже высокими дозами в целом великолепна.

отрицательной обратной связи стероидов с ги-

Проблемы возникают при хроническом лече-

поталамусом транскрипция, по-видимому, не

нии. Помимо пониженной резистентности к

вовлекается.

инфекции, которая вызывается тем же подав-

Участие синтеза информационной РНК и

лением функции лейкоцитов (что лежит в ос-

белка во многих эффектах стероидов становит-

нове большинства противовоспалительных эф-

ся очевидным при блокаде этих эффектов инги-

фектов), они включают нарушения метабо-

биторами синтеза РНК и белка (актиномици-

лизма, составляющие классический синдром

ном D и циклогексимидом). Также ясно, что

побочных эффектов глюкокортикоидов

(табл.

глюкокортикоиды индуцируют ферменты не

26).

только in vitro, но и in vivo. Это может служить

основой объяснения некоторых обменных эф-

Кортикостероиды

251

Рис. 105. Механизм действия глюкокортикоидов на внутриклеточные рецепторы.

КСГ-кортикостероидсвязывающий глобулин (в плазме); К - кортикостероид; Р-рецептор; иРНК-

информационная рибонуклеиновая кислота.

фектов глюкокортикоидов, хотя известной ин-

Предполагалось, что если фармакологическая

дукцией ферментов не объясняются все вы-

активность аспириноподобных препаратов свя-

званные метаболические изменения.

зана со способностью блокировать биосинтез

простагландинов, то и другие противовоспа-

лительные препараты могут иметь подобный

Аспириноподобное действие

механизм действия.

глюкокортикоидов

Интерес многих исследователей был при-

Ко времени написания книги невозможно было

влечен к стероидам. При расшифровке меха-

дать полное объяснение противовоспалитель-

низма действия аспириноподобных препаратов

ного действия глюкокортикоидов, оказываю-

было обнаружено, что стероидные противо-

щих влияние на воспаление на различных уров-

воспалительные препараты не действуют на

нях. Но по крайней мере некоторые их эффекты

микросомную циклооксигеназу даже при очень

можно объяснить действием на фермент,

высоких концентрациях. Однако стероидные

встроенный в мембрану и называемый

препараты проявляют ряд эффектов аспири-

фосфолипазой А2.

ноподобных препаратов, которые, вероятно,

Исследование, приведшее к этому выводу,

связаны с угнетением биосинтеза простаглан-

было предпринято в начале 70-х годов. Откры-

динов; поэтому сохранялось предположение о

тие угнетения биосинтеза простагландинов ас-

вмешательстве стероидов в обмен проста-

пириноподобными препаратами (см. главу 25)

гландинов. В табл. 27 сравнивается антицикло-

побудило к изучению влияния других типов

оксигеназная активность четырех аспирино-

препаратов на образование простагландинов.

подобных препаратов и четырех противово-

252

Глава 24

Таблица 27. Различия в антиферментативной активности стероидных (звездочка) и аспириноподобных противовоспали-

тельных препаратов

спалительных стероидов. Препараты обоих

ние распада фосфолипидов и, следовательно,

типов эффективны в системах, определяющих

угнетение выделения арахидоната.

противовоспалительную активность (отек лапки

Для понимания этого факта следует вспом-

крыс), но циклооксигеназу блокируют только

нить, что простагландины образуются из ара-

аспириноподобные препараты. В связи с этими

хидоновой кислоты. В большинстве клеток

данными возникает и теоретическая проблема,

количество свободной арахидоновой кислоты

поскольку непонятно, почему стероиды, будучи

очень невелико, хотя в виде различных эфиров

мощными

противовоспалительными

она присутствует в высоких концентрациях.

препаратами, не вмешиваются в биосинтез

Поскольку простагландины в клетке не хра-

простагландинов. Означает ли это, что они

нятся (они выделяются немедленно после син-

имеют совершенно иной механизм действия?

теза), фактором, лимитирующим скорость их

Или же простагландины не играют важной роли

биосинтеза, является доступность субстрата.

в воспалении? В ряде работ, опубликованных в

Одной из начальных стадий формирования

начале и середине

70-х годов, убедительно

простагландинов является выделение из пула

показано, что стероиды способны блокировать

эфиров субстрата-арахидоновой кислоты.

образование простагландинов, хотя и при

Наибольшее доверие внушает, гипотеза, сог-

помощи механизма действия, отличного от

ласно которой главным источником арахидо-

аспириноподобных веществ.

новой кислоты служат фосфолипиды, а фер-

Gryglewski и его сотрудники обнаружили,

мент, необходимый для выделения субстрата,

что кортикостероиды, гидрокортизон и декса-

является фосфолипазой А2.

метазон предупреждают вызванное норадре-

налином выделение простагландинов в пер-

Подавление глюкокортикоидами

фузируемых мезентериальных сосудах кроли-

фосфолипазы А2 в перфорируемом

ков, а также антигениндуцированное выделение

простагландинов в перфузируемых легких

легком морских свинок

морских свинок. Прямое превращение арахи-

новой кислоты стероидами в этих моделях не

Перфузируемые легкие морских свинок наряду

блокировалось, поэтому место блока не связано

с множеством других систем биологического

ни с циклооксигеназой, ни с

«механизмами

определения уже многие годы остаются из-

выделения». Действительно, исследователи

любленным инструментом изучения образова-

пришли к заключению, что кортикостероиды

ния и выделения простагландинов (рис. 106).

действуют

посредством

ограничения

Идея метода определения крайне проста. Ок-

доступности субстрата. Эта точка зрения вскоре

сигенированный раствор Кребса при темпера-

получила подтверждение в ряде исследований.

туре

37°С перфузируется со скоростью

5-10

В изящных экспериментальных работах,

мл/мин через легочную артерию изолиро-

опубликованных в 1976 и 1977 гг. Levin и его

ванного легкого морских свинок. Содержимое

группа, используя культуры клеток, меченных

легочных вен направляется на ткани, выбран-

арахидоновой кислотой, содержащей тритий,

ные для биологической оценки. Для опреде-

смогли продемонстрировать подавле-

ления простагландиновых эндоперекисей пред-

Кортикостероиды

253

Рис. 106. Экспериментальная установка

для перфузии изолированных легких

морских свинок.

Раствор Кребса направляется насосом

через канюлю в легочной артерии.

Рилизинг-фактор (РФ) или арахидоновая

кислота (АК) может вводиться в канюлю,

что вызывает выделение простагландинов.

почтение обычно отдается полоскам аорты

ко свидетельствует об отсутствии ингибитор-

кроликов, полоскам желудка крыс, толстой

ного действия препарата на циклооксигеназу.

кишке крыс, трахее морских свинок и прямой

При исследовании других стероидов вскоре

кишке цыплят. Специфичность тканей к про-

было установлено, что почти все противовос-

стагландиновым метаболитам можно повысить

палительные глюкокортикоиды эффективны в

введением в венозный отток антагонистов

отношении РФ-индуцированного выделения, а

других веществ, вызывающих сокращение

также в отношении выделения, вызванного

гладких мышц.

гистамином и 5-окситриптамином. Более того,

В 1976 г. этот метод был использован для

их ранжирование по активности в отношении

определения активности рилизинг-фактора,

РФ совпадало с ранжированием по противо-

вещества, вызывающего сокращение аорты

воспалительной активности. Половые гормоны

кролика (ВСАК-РФ, или просто РФ),- низко-

и альдостерон в данной системе не активны.

молекулярной части экстракта, полученного

В отличие от ацетилсалициловой кислоты

при перфузии легких, стимулированных анти-

или индометацина при действии стероидов на

геном. Как показано на рис. 106, введение в

перфузируемые легкие всегда наблюдается

легочную артерию РФ приводит к выделению

латентный период 15-30 мин.

легкими веществ, вызывающих сокращение

Как и где действуют стероиды? Если ара-

гладких мышц, которые идентифицируются

хидоновая кислота вводится в легочную ар-

различными биологическими и другими мето-

терию перфузируемого легкого морских свинок,

дами как смесь простагландиновых эндопере-

она немедленно переходит в оксикислоты и

кисей и тромбоксана А2. Индометацин и другие

продукты превращения простагландиновых

аспириноподобные

вещества

подавляют

эндоперекисей. Из этого был сделан вывод о

образование этих веществ. Но при изучении

том, что доступность субстрата (арахидоновой

ингибиторной активности препаратов других

кислоты)

является

важным фактором,

типов обнаружено, что противовоспалительный

ограничивающим скорость образования прос-

стероид дексаметазон предупреждает действие

тагландинов при использовании данного метода.

РФ, но не подавляет превращение легкими

В этом случае высвобождающие вещества

арахидоновой кислоты в простагландино-вые

(такие как РФ) действуют, выделяя субстрат из

продукты (рис. 107).

внутриклеточных депо. Эту гипотезу проверили,

Отсутствие влияния дексаметазона на пре-

измерив выделение простагландинов

вращение арахидоновой кислоты легкими чет-

254

Глава 24

Рис. 107. Определение биологической

активности эффлуента перфузируемых

легких морской свинки с помощью полоски

аорты (ПА) кролика показывает

превращение арахидоновой кислоты (АК)

в продукты простагландинов, обладающих

контрактильной активностью по

отношению к гладким мышцам, и

образование этих продуктов после

введения ФРСАО-ЗФ (РФ). Действие РФ

дозозависимо блокируется дексаметазоном,

вводимым в легочную артерию. На

нижней гистограмме показан стандартный

способ графического отображения

полученной биологической оценки в виде

отношения между реакциями на РФ и АК

(этот метод используется дальше по

тексту).

легкими после введения различных веществ. В

в легких. Фоновая фосфолипазная активность

каждом случае введение РФ вызывало выде-

легких блокируется рядом препаратов, вклю-

ление арахидоновой кислоты. При введении в

чая мепакрин (известный ингибитор фосфоли-

перфузат стероиды блокировали этот эффект, но

пазы); ацетилсалициловая кислота и индоме-

через 30-40 мин после прекращения ин-фузии

тацин практически неэффективны против этого

стероидов он восстанавливался.

фермента. Гл юкокортикоиды - бетаметазон,

Вполне выроятно, что противовоспалитель-

дексаметазон и гидрокортизон

- проявляют

ные стероиды каким-то образом предупреждают

себя как очень активные ингибиторы в отличие

выделение субстрата из внутриклеточного

от минералокортикоида альдостерона.

липидного депо. Но из какого? В селезенке и

Стероиды в отличие от мепакрина не влия-

тромбоцитах большая часть арахидоновой

ют на активность фосфолипазы А2 в бескле-

кислоты, используемой для биосинтеза

точных гомогенатах, причем подавление от-

простагландинов, относится к фосфатид-ной

личается от такового, вызываемого нестерои-

фракции. Концептуальным достижением в

дами, и по временным параметрам. На рис. 108

признании фракции фосфатидов в качестве

представлены результаты эксперимента, в

источника арахидоната является то, что это

котором гидролиз фосфатидов измеряли

позволяет легко объяснить способность мно-

каждые 10 мин до начала, во время и после

жества событий, связанных с мембраной, за-

инфузии дексаметазона. Перед инфузией сте-

пускать образование простагландинов. Если

роидов фоновый гидролиз возрастал, а вскоре

клеточным источником арахидоната является

после добавления стероидов гидролиз стал за-

пул фосфатидов, то из этого следует, что

медляться и спустя 50 мин полностью прекра-

фосфолипаза А2 выполняет важную роль. В

тился. После прекращения инфузии скорость

конкретной ситуации в отношении арахи-

гидролиза начала возрастать и достигла конт-

доновой кислоты, которая в основном этери-

рольного уровня через 40- 50 мин.

фицируется в позиции

2', фосфолипаза А2

Фоновая фосфолипазная активность может

является гидролитическим ферментом.

стимулироваться или подавляться. Активация

Стимулируют ли фосфолипазу вещества,

фермента и фонового гидролиза осуществляет-

выделяющие простагландины? И если это так,

ся различными веществами. Стимулирующая

то является ли данный ферментативный этап

фосфолипазу активность гистамина, РФ и ан-

чувствительным к стероидам? Для ответа на эти

тигена дозовозависимо блокируется мепакри-

вопросы был использован метод определения

ном и стероидами.

фосфолипазной активности в перфузируемых

Показано, что противовоспалительные сте-

легких. Этот метод зависит от метаболизма

роиды отменяют выделение тромбоксанов за

специфических меченых фосфатидов

счет предупреждения мобилизации арахидоно-

Кортжостероиды

255

Рис. 108. Подавление фосфолипаза-А2-

подобной активности легких

дексаметазоном.

вой кислоты, вторичной по отношению к акти-

антифосфолипазного фактора. В ряде после-

вации фосфолипазы. Как это достигается? И

дующих экспериментов были получены весо-

почему стероиды действуют только на

мые доказательства этой гипотезы. Легкие

интактные клетки?

морских свинок перфузировали в разных усло-

виях (рис. 109, а). Перфузат из одного легкого

(называемого легкое-генератор) реоксигениро-

Индукция синтеза глюкокортикоидами

вали и подавали насосом в другое легкое (тест-

белкового ингибитора фосфолипазы А2

легкое), получавшее также циклогексимид для

подавления чувствительности к стероидам.

Как отмечалось выше, для проявления боль-

Противовоспалительные стероиды вводили либо

шинства эффектов стероидов необходимо свя-

через легкое-генератор, либо прямо в перфузат

зывание препарата с цитозольным рецептор-

(минуя генераторное легкое). Таким образом,

ным белком. Комплекс препарат-рецептор

единственная разница между перфузатами тест-

затем переносится в ядро, где начинается цепь

легкого заключалась в прохождении

(или

событий, приводящих к биологическому эф-

непрохождении) стероидов через первое легкое.

фекту. Подобная ситуация наблюдается в лег-

Для определения фосфо-липазной активности

ких; было показано, что легкие морских свинок

проводился

биологический

или

содержат белковые растворимые глюкокорти-

коидные рецепторы, способные к связыванию

радиоиммунологический анализ.

[3Н]-дексаметазона. Интересно, что кортексо-

Если стероиды инфузировали прямо в тест-

лон, аналог глюкокортикоидов, предупреждает

легкое, они не влияли на фосфолипазную

связывание дексаметазона с рецептором в

активность, но при их введении в легкое-гене-

данной системе, подавляя тем самым действие

ратор отмечалось существенное снижение фос-

дексаметазона не менее эффективно, чем это

фолипазной активности тест-легкого. Сходные

наблюдается при введении ингибиторов синтеза

результаты были получены, когда стероиды

РНК

(актиномицина D), синтеза белка

вводили сначала в легкое-генератор, после чего

(пуромицина) или обоих (циклогексимид). Эти

легкие меняли местами. В этом случае подав-

данные четко свидетельствуют о том, что

ленный фосфолипидный гидролиз на РФ вос-

(несмотря на короткий латентный период

станавливался, когда стероиды добавляли к

действия) стероиды вызывают антифосфоли-

тест-легкому.

пазный эффект, индуцируя транскрипцию и

Эти и подобные им эксперименты убеди-

трансляцию в легочных клетках-мишенях.

тельно продемонстрировали высвобождение под

Одним из возможных объяснений этого

действием стероидов некоторыми типами

может служить предположение, что стероиды

клеток легких сильного ингибитора фосфоли-

инициируют синтез de novo (или секрецию)

пазозависимого биосинтеза простагландинов.

256

Глава 24

Рис. 109. Фактор, индуцированный

стероидами, выделяется в эффлуент

легкого и может оказывать

антифосфолипазное действие на второе

легкое.

Оба легких перфузируются в

определенной последовательности (а).

Реоксигенированный эффлуент из

генерирующего легкого направляется

насосом в тест-легкое, которое также

обрабатывается циклогексимидом для

предотвращения действия стероидов.

Дексаметазон (1 мкг/мл) инфузировали

или прямо в эффлуент первого легкого

(1Э), или сначала пропускали через

генерирующее легкое (ТЛ). После

достижения равновесия стероиды вводили

в 1Э, при этом изменения активности

фосфолипазы не происходило (б). Однако

при инфузии ТЛ наблюдалось немедленное

падение фосфолипазной активности

второго легкого, что свидетельствует о

возвращении уровня фактора,

обладающего антифосфолипазной

активностью к контрольным значениям.

Светлые столбики-биооценка, темные-

радиооценка.

Несмотря на целесообразность модели пер-

биторного пептида, причем нижняя часть кри-

фузируемых легких, она не является типичной

вой доза

- ответ проходит в области, соот-

для многих типов экспериментальных моделей.

ветствующей нормальной концентрации сте-

Аналогичный эффект наблюдается при

роидов надпочечников в крови.

использовании некоторых других типов клеток.

Характеристики белковых факторов перфу-

Например, перитонеальные макрофаги крысы

зируемых легких морских свинок и инкуби-

образуют простагландины при инкубации с

руемых перитонеальных макрофагов крыс, по-

бактериями. В присутствии глюко-кортикоидов

видимому, весьма сходны, а при гель-хро-

это образование подавляется, но оно может

матографии подтверждается их близость по

быть восстановлено добавлением арахидоната.

молекулярной массе (например, 15 000). Вполне

Последующие исследования показали, что

вероятно, что они идентичны или по крайней

эффект стероидов зависит от биосинтеза de novo

мере близкородственны. Белок крысиных

белка и РНК; как и в легких, блокирующее

лейкоцитов назван

«макрокортином», и все

действие стероидов связано с растворимым

экспериментальные данные свидетельствуют о

белком, выделяемым макрофагами. Определена

его сходстве с легочным макрокортином.

связь между дозой гидрокортизона и

Если перитонеальные макрофаги могут ин-

количеством выделенного инги-

дуцироваться к выделению макрокортина in

Кортикостероиды

257

vitro, то не исключено, что подобные события

Вскоре было установлено, что все эти белки

происходят in vivo после введения стероидов.

иммунологически родственны и, вероятно, об-

Для проверки этой гипотезы крысам вводили

разуются при протеолитическом распаде белка

глюкокортикоиды

(обычно дексаметазон), а

40 К. Позже это семейство белков было названо

затем спустя 1-5 ч собирали при помощи лаважа

«липокортинами», а белок

40 К

- просто

белки

перитонеальной

полости

(пери-

«липокортином».

тонеальная полость содержит большое коли-

чество резидентных макрофагов). В лаважной

Очистка, определение аминокислотной

жидкости определялось наличие антифосфоли-

последовательности и клонирование

пазной активности, которая повышалась в не-

липокортина

сколько раз после введения дексаметазона или

гидрокортизона. Интересно, что у адренэкто-

Недавно был очищен белок 40 К и определена

мированных крыс базальный уровень макро-

его аминокислотная последовательность; его

кортина был значительно ниже, но ответ на

человеческий ген был клонирован учеными из

стероиды сохранялся на нормальном уровне.

Biogen Genetic Engineering Company (США).

Это свидетельствует о существовании посто-

Белок, который является мономером, до-

янного стероидного давления, которому под-

статочно необычен ввиду высокого содержания

вергаются все здоровые млекопитающие и ко-

в нем аминокислотных остатков с большим

торое отвечает за фоновые значения макро-

зарядом; поэтому данная молекула очень

кортина в лаважной жидкости. АКТГ также

полярна. Белок достаточно консервативен:

вызывает появление макрокортина в лаважной

выявлено большое сходство липокортина у

жидкости; то же наблюдается при стрессе (со-

крысы и у человека.

держание крыс в холодной комнате в течение 30

Ген, кодирующий липокортин, очень чувст-

мин). Ни один из стимулов не был эффек-

вителен к стероидам, уровень иРНК для ли-

тивным у адреналэктомированных крыс, что

покортина повышается после стимуляции кле-

указывает на критическую роль надпочечников

ток глюкокортикоидами.

в этой реакции.

Неожиданным является то, что при опре-

делении внутренней структуры белка липокор-

Липокортиновое семейство белков:

тина обнаружены четыре повторяющиеся

субъединицы, которые способны связывать

макрокортин, ренокортин и

кальций и фосфолипид. Это свойство служит

липомодулин

характеристикой семейства белков, располага-

Хотя в данной главе основное внимание уде-

ющихся в клеточных мембранах, которым да-

ляется открытию макрокортина, другие группы

вались различные наименования разными

исследователей, занимавшиеся проблемой

группами исследователей. Весьма вероятно, что

действия стероидов, достигли аналогичных

липокортин идентичен или близкородствен

результатов.

некоторым из этих белков. Как показали не-

Идея о том, что глюкокортикоиды индуци-

давние исследования, существует несколько

руют синтез антифосфолипазного белка, была

типов липокортина, хотя неизвестна биологи-

одновременно выдвинута Hirata и Axelrod

ческая роль и других членов этого семейства.

(Национальный институт здоровья, США). В

Pepinsky и соавт. (1988) предположили сущест-

серии изящных экспериментов они показали,

вование связи между семейством липокортина и

что ингибиторное влияние глюкокортикоидов

другими мембранными белками, связывающими

на хемотаксис лейкоцитов связано с образо-

кальций и липиды.

ванием гликопротеина с молекулярной массой

При изучении внутренней структуры липо-

примерно 70000 дальтон. Образование белка,

кортина получено возможное объяснение ме-

названного липомодулином, зависит от окку-

ханизма его влияния на фосфолипидный гид-

пации рецептора, ДНК-зависимого синтеза РНК

ролиз. Липокортин может сильно связываться с

и синтеза белка. В больнице Necker (Париж)

анионными фосфолипидами в присутствии

другая группа исследователей выделила

кальция, поэтому предложена модель подав-

белковую фракцию из культурируемых почеч-

ления липокортином фосфолипазы, согласно

ных клеток, обработанных глюкокортикоида-

которой механизмом является конкуренция за

ми, которая подавляет фосфолипазу А2. Эта

субстрат. Davidson и соавт. (1987) подтвердили

фракция представляет собой смесь белков с

возможность этого механизма; однако необхо-

молекулярной массой 15 и 30 К.

димо помнить, что липокортин может само-

содержание .. 17 18 19 20 ..