Биологическая химия - часть 130

Катализирующая II стадию трансформилаза оказалась более специ-

фичной, чем метионил-тРНК-синтетаза: она не формилирует ни свободный

метионин, ни метионин в комплексе с тРНК

Мет

.

Таким образом, N-формилметионил-тРНК является первой аа-тРНК,

которая определяет включение N-концевого остатка аминокислоты и тем

самым начало трансляции. Процесс формилирования имеет важный хи-

мический и биологический смысл: блокируя участие NН

2

-группы метионина

в образовании пептидной связи, он обеспечивает тем самым синтез белка

в направлении NH

2

 –> СООН; образовавшаяся формилметионил-тРНК,

кроме того, первой связывается с определенным участком 30S субчастицы

рибосомы и с мРНК.

Необходимым условием инициации, как было отмечено, является также

наличие инициирующих кодонов, кодирующих формилметионин. У бак-

терий эту функцию выполняют триплеты АУГ и ГУГ мРНК. Однако они

кодируют формилметионин (или начальный метионин в эукариотической

клетке) только будучи начальными триплетами при считывании мРНК.

Если эти триплеты являются обычными, т.е. внутренними, то каждый из

них кодирует свою аминокислоту: в частности, АУГ кодирует метионин,

а ГУГ – валин. Ясно, что начальный, инициаторный 5'-АУГ-кодон должен

чем-то отличаться от других АУГ-кодонов, возможно, структурой ок-

ружения триплета. Предполагают, что инициаторному 5'-АУГ-кодону у

прокариот предшествует сигнальная полипуриновая (порядка от 8 до 13

оснований) последовательность (Shine–Dalgarno sequence), которая узна-

ется полипиримидиновой 3'-антипараллельной последовательностью в мо-

лекуле 16S рРНК 30S субчастицы. Допускается, кроме того, существование

определенных различий во вторичной структуре мРНК в участке ини-

циирующего кодона, способствующих его узнаванию.

К настоящему времени выяснена природа белковых факторов ини-

циации. У Е. coli (см. табл. 14.1) открыты три таких инициирующих фак-

тора, обозначаемых соответственно IF-1, IF-2, IF-3. Все они получены

в высокоочищенном состоянии с примерными молекулярными массами

9000, 10000 и 22000 соответственно. IF-3 обеспечивает узнавание участка

на молекуле мРНК, к которому присоединяется формилметионил-тРНК.

Данный белковый фактор первым связывается со свободной 30S суб-

частицей рибосомы и препятствует ассоциации 30S и 50S субчастиц в 70S

рибосому без молекулы мРНК. IF-1 способствует связыванию инициатор-

ной формилметионил-тРНК с комплексом 30S субчастицы и мРНК. Бел-

ковый фактор IF-2, вероятнее всего, способствует объединению 30S и 50S

субчастиц после того, как на первой субчастице уже присутствуют ини-

циирующие кодоны мРНК, N-формилметионил-тРНК, IF-3, IF-1 и ГТФ.

Этот белок рассматривают как фактор стабилизации всего инициаторного

70S комплекса (см. далее).

525

N

10

-СНО-ТГФК

ДГФК

Метионил-тРНК

фМет

N-формилметионил-

тРНК

фМет

Трансформилаза

Рис. 14.5. Схематическое изображение взаимодействия формилметионил-тРНК и

мРНК с 30S субчастицей рибосомы (а) и транслирующей (функционально активной)

70S рибосомой (б).

Аналогичные белковые факторы инициации обнаружены также в эука-

риотических клетках. Открыто около 10 эукариотических белковых фак-

торов инициации (см. табл. 14.1), их принято обозначать eIF. Все они,

по-видимому, важны для инициации, однако только три из них абсолютно

необходимы и существенны для белкового синтеза: eIF-2, eIF-3 и eIF-5. Они

получены в чистом виде: eIF-2 состоит из α-, β- и γ-субъединиц (мол. масса

38000, 47000 и 50000 соответственно), eIF-3 (мол. масса 500000–700000)

и eIF-5 (мол. масса 125000). Укажем также, что в синтезе белка их роль

тождественна роли инициаторных белков у прокариот. Отличительной

особенностью синтеза белка у эукариот является, кроме того, наличие среди

10 белковых факторов инициации еще одного белка, названного кэп-связы-

вающим. Соединяясь с 5'-участком кэп мРНК, этот белок содействует

образованию комплекса между мРНК и 40S рибосомной субчастицей.

Необходимо отметить, что до сих пор не раскрыты тонкие молекулярные

механизмы участия белковых факторов инициации как у про-, так и

у эукариот в сложном процессе синтеза белка.

О б р а з о в а н и е  и н и ц и а т о р н о г о  к о м п л е к с а . Экспериментально до-

казано, что в процессе белкового синтеза наблюдаются постоянная дис-

социация 70S рибосом на 30S и 50S субчастицы и последующая их

р е а с с о ц и а ц и я . Сначала образуется инициаторный комплекс путем при-

соединения белковых факторов, формилметионил-тРНК и ГТФ к 30S

субчастице, к которой комплементарно антикодону формилметионил-тРНК

присоединяется мРНК при участии кодона АУГ (рис. 14.5).

Следует указать на особую роль формилметионил-тРНК: она помогает

мРНК найти на 30S субчастице определенное местоположение, обеспе-

чивающее точную трансляцию информации о последовательности амино-

кислот в полипептидной цепи (установление рамки). Как только мРНК

присоединяется к комплексу, высвобождается белковый фактор IF-3 и

оставшийся комплекс легко присоединяет 50S субчастицу, образуя трансли-

рующую, т.е. функционально активную, 70S рибосому. В процессе этих

перестроек рибосомы освобождают остальные белковые факторы ини-

циации и продукты гидролиза ГТФ (ГДФ и неорганический фосфат),

энергия которого расходуется, по-видимому, на формирование иницииру-

ющего 70S комплекса рибосомы. В этом комплексе формилметионил-тРНК

оказывается прикрепленной к пептидилсвязывающему центру рибосомы.

В гидролизе ГТФ принимает участие IF-2. У образовавшейся активной,

полностью сформировавшейся 70S рибосомы, содержащей формилметио-

нил-тРНК, оказывается свободным аминоацильный центр, который может

526

Антикодон

мРНК

фМет-тРНК

50S

мРНК

50S

фМет-тРНК

а

б

30S

30S

Рис. 14.6. 50S субчастица рибосомы с двумя центрами связывания тРНК.

реагировать с определенной аа-тРНК, соответствующей очередному кодону

мРНК. С этого момента начинается II этап синтеза белка – элонгация.

Элонгация трансляции. Процесс элонгации полипептидной цепи у Е. coli

начинается с образования первой пептидной связи и непосредственно,

точнее топографически, связан с большой субчастицей (50S) рибосомы,

содержащей два центра для связывания тРНК: один из них называется

а м и н о а ц и л ь н ы м (А), другой – п е п т и д и л ь н ы м (П) (рис. 14.6).

В процессе элонгации у Е. coli также участвует три белковых фактора –

элонгационные факторы трансляции, сокращенно обозначаемые Tu, Ts

и G (см. табл. 14.1): EF-Tu (мол. масса 43000), EF-Ts (мол. масса 35000)

и EF-G (мол. масса 80000). У эукариот также открыты три таких фактора,

названных эукариотическими элонгационными факторами трансляции и

обозначаемых соответственно eEF-1α (мол. масса 53000), eEF-1αβ (мол.

масса 30000) и eEF-2; почти все они получены в чистом виде, для ряда из

них установлена первичная структура.

Процесс элонгации принято делить на 3 стадии: узнавание кодона

и связывание аминоацил-тРНК, образование пептидной связи и трансло-

кация. На I стадии в соответствии с природой кодона мРНК в свободный

А-участок рибосомы доставляется аминоацил-тРНК при участии фактора

элонгации Tu. Этот процесс требует затраты энергии и сопряжен с гидро-

лизом ГТФ и образованием прочно связанного комплекса Тu–ГТФ. Об-

разовавшийся комплекс подвергается диссоциации только в присутствии

второго фактора элонгации Ts, при котором освободившийся фактор Tu

может вновь, соединяясь с молекулой ГТФ, принять участие в доставке

аа-тРНК в рибосому. Таким образом, в транслирующей 70S рибосоме

в пептидильном центре располагается формилметионил-тРНК, а в А-

центре – аминоацил-тРНК (первая аминокислота после метионина). С этого

момента начинается II стадия элонгации – образование первой пептидной

связи. Для этого в рибосоме осуществляется ферментативная реакция

транспептидирования между формилметионил-тРНК в П-центре и новой

аа-тРНК в А-центре. В процессе этой реакции остаток формилметионина

переносится на свободную NH

2

-группу аа-тРНК и замыкается первая

пептидная связь в будущей полипептидной цепи. Параллельно из пеп-

тидильного центра освобождается тРНК

фМет

 в цитозоль. Фермент, ка-

тализирующий реакцию транспептирования, получил название пептидил-

трансферазы (рис. 14.7); он, вероятнее всего, является составной частью

белков 50S субчастицы. Таким образом, в процессе транспептидазной

реакции в А-центре образуется дипептидил-тРНК, а П-центр остается

свободным («вакантным»).

На III стадии процесса элонгации необходимо иметь свободный амино-

ацильный центр для присоединения следующей аа-тРНК. Для этого благо-

даря процессу транслокации образовавшийся фрагмент дипептидил-тРНК

переносится от аминоацильного на пептидильный центр. Достигается

527

Пептидильный

центр

50S

П

А

Аминоациль-

ный центр

Рис. 14.7. Перенос фМет-тРНК между двумя центрами (П и А) на большой 50S

субчастице рибосомы.

транслокация благодаря передвижению рибосомы относительно мРНК при

участии фермента транслоказы (функцию ее выполняет фактор элонгации

G у Е. coli и eEF-2 у эукариот) за счет использования энергии распада еще

одной молекулы ГТФ. В результате транслокации дипептидил-тРНК за-

нимает место в пептидильном центре рибосомы, а аминоацильный центр

освобождается для нового цикла узнавания и может присоединить новую

следующую аа-тРНК, соответствующую кодону мРНК. В процессе транс-

локации рибосома перемещается вдоль мРНК по направлению к ее 3'-концу

на расстояние в один кодон, т.е. точно на один триплет. На рис. 14.8 видно,

что рибосома вступает в следующий цикл – происходит присоединение

третьего аминокислотного остатка и т.д.

Таким образом, на стадии элонгации происходит последовательное

наращивание полипептидной цепи по одной аминокислоте в строгом

соответствии с последовательностью триплетов (кодонов) в молекуле

мРНК.

Существенным является выяснение вопроса о количестве энергии, не-

обходимой для синтеза одной пептидной связи при биосинтезе белка. Как

было отмечено, при активировании аминокислоты еще до стадии ини-

циации, т.е. при формировании аа-тРНК, расходуется энергия распада АТФ

на АМФ и пирофосфат, что приблизительно эквивалентно гидролизу

Рис. 14.8. Процесс элонгации полипептидной цепи (схема).

528

50S

тРНК

50S

Пептидил-

трансфераза

тРНК

Пептидиль-

ный центр

Аминоациль-

ный центр

Пептидил-

трансфераза

мРНК

мРНК

тРНК

Пептидилтранс-

феразная реакция

мРНК

мРНК