Биологическая химия - часть 128

Рис. 14.4. Созревание валиновой тРНК (по А.А. Баеву).
Цифрами обозначены фрагменты молекулы тРНК.

Транспортные РНК

В лаборатории М. Хогланда было выяснено, что при инкубации

14

С-аминокислоты с растворимой фракцией цитоплазмы в присутствии

АТФ и последующим добавлением трихлоруксусной кислоты в образовавшемся

белковом осадке метка не открывается. Эти данные позволили сделать

заключение, что меченая аминокислота не включается в белковую мо-

лекулу. Метка оказалась связанной ковалентно с РНК, содержащейся

в безбелковом фильтрате. Дальнейшие исследования показали, что РНК,

к которой присоединяется меченая аминокислота, имеет небольшую мо-

лекулярную массу и сосредоточена в растворимой фракции, поэтому ее

сначала назвали растворимой, а позже адапторной, или транспортной, РНК

(тРНК). На долю тРНК приходится около 10–15% от общего количества

клеточной РНК. К настоящему времени открыто более 60 различных тРНК.

Для каждой аминокислоты в клетке имеется по крайней мере одна спе-

цифическая тРНК. (Для ряда аминокислот открыто более одной: в част-

ности, для серина, лейцина и аргинина – 6 разных тРНК, для аланина,

треонина и глицина – по 4 разных тРНК, хотя и в этом случае каждая тРНК

связана со специфической аминоацил-тРНК-синтетазой.) Молекулярная

масса большинства тРНК колеблется от 24000 до 29000. Они содержат от

75 до 85 нуклеотидов, в том числе 8 и более из них являются моди-

фицированными основаниями. Аминокислоты присоединяются в конечном

итоге к свободной 3'-ОН-группе (см. ранее о ферментах аминоацил-

тРНК-синтетаз 1-го класса) концевого мононуклеотида, представленного во

всех тРНК АМФ (адениловая кислота), путем образования эфирной связи.

Интересно, что почти все тРНК обладают не только удивительно сходными

функциями, но и очень похожей трехмерной структурой (рис. 14.3).

Установлена первичная структура почти всех 60 открытых тРНК

(рис. 14.4). Знание последовательности нуклеотидов и, следовательно,

состава тРНК дало в руки исследователей много ценных сведений о

биологической роли отдельных компонентов тРНК. Общей для тРНК

оказалась также нативная трехмерная структура, установленная методом

517

Печень

Дрожжи

Активное состояние

Неактивное состояние

рентгенокристаллографического анализа и названная первоначально кон-

формацией клеверного листа; на самом деле эта конформация имеет

перевернутую L-образную форму (см. рис. 14.3). Определение тРНК этим

методом позволило выявить ряд отличительных особенностей структуры.

В молекуле тРНК открыты спирализованные участки, необычные водо-

родные связи и гидрофобные взаимодействия во внеспирализованных

участках. Показано, что тРНК имеет псевдоуридиловую петлю, обра-

зованную из нуклеотидов, содержащих псевдоуридин (ТψС), и дигидро-

уридиловую петлю. Обе петли участвуют в образовании угла буквы L. На

3'-ОН-конце располагается одинаковая для всех тРНК последовательность

триплета ЦЦА-ОН, к которой присоединяется посредством эфирной связи

специфическая аминокислота. Связывание в основном происходит через

3'-ОН-группу концевого аденилового нуклеотида, хотя, как было указано,

получены доказательства возможности предварительного присоединения

аминокислоты и через его 2'-ОН-группу.

Роль отдельных участков тРНК недостаточно раскрыта. В частности,

псевдоуридиловая петля, по-видимому, обеспечивает связывание амино-

ацил-тРНК с рибосомой, а дигидроуридиловая петля, вероятнее всего,

необходима как сайт (место) для узнавания специфическим ферментом –

аминоацил-тРНК-синтетазой. Имеется, кроме того, добавочная петля,

состав которой варьирует у разных типов молекул тРНК; ее назначение

неизвестно. Существенным, с полностью раскрытой функцией участком

является антикодоновая петля, несущая триплет, названный антикодо-

ном, и расположенная на противоположной стороне от того конца, к кото-

рому присоединяется аминокислота. Антикодоновая петля состоит из

7 нуклеотидов: три занимают центральное положение и формируют

собственный высокоспецифичный антикодон, по два нуклеотида распо-

ложены по обе стороны от него, включая модифицированный пурин и

варьирующее основание с одной стороны и два пиримидиновых осно-

вания – с другой стороны. Антикодон является специфичным и компле-

ментарным к соответствующему кодону мРНК, причем оба они анти-

параллельны в своей комплементарности.

Тщательный анализ нуклеотидной последовательности разных тРНК

показал, что все они содержат одинаковый 5'-концевой нуклеотид – ГМФ –

со свободной 5'-фосфатной группой. Адапторная функция молекул тРНК

заключается в связывании каждой молекулы тРНК со своей специфической

аминокислотой. Однако, поскольку между нуклеиновой кислотой и спе-

цифической функциональной группой аминокислот нет соответствия и

сродства, эту функцию узнавания, точнее, посредника между тРНК и

аминокислотой, должна выполнять белковая молекула фермента. Взаимо-

действие между аминоацил-тРНК-синтетазой и тРНК принято обозначать

как «вторичный генетический код», подчеркивая тем самым его ключевую

роль в обеспечении точности синтеза белка, причем правила кодирования

являются, вероятнее всего, более сложными, чем правила «первичного»

генетического кода (см. далее).

Матричная РНК

Ранее было указано на необходимость участия предобразованной молекулы

РНК для правильной расстановки аминокислот в полипептидной цепи. Еще

сравнительно недавно предполагали, что такой молекулой может служить

рРНК. Это предположение как будто бы подкреплялось и опытами по

заражению клеток Е. coli ДНК фага. Оказалось, что немедленно после

518

заражения синтез нормальных клеточных ДНК прекращается и начинается

интенсивный синтез фаговой ДНК. Более того, весь белоксинтезирующий

аппарат клеток перестраивался на синтез только фаговых белков. Состав

синтезированных фаговых белков отличался от состава белков бактерии.

Было высказано предположение, что при заражении фагом, очевидно,

меняется последовательность оснований в РНК, однако и эта гипотеза не

подтвердилась. По мнению ряда известных ученых, предобразованная

РНК, необходимая для изменения типа синтезируемого белка, должна

обладать высокой скоростью обновления своего состава, т.е. молекула

такой РНК должна синтезироваться и распадаться с такой скоростью,

чтобы обеспечить подобную скорость обновления нуклеотидного состава.

Фактически рРНК оказалась метаболически малоактивной и весьма ста-

бильной, поэтому становилось очевидным, что она не может служить

в качестве матрицы.

В ряде лабораторий (в частности, в лаборатории С. Бреннера) были

получены данные о возможности существования в клетках в соединении

с рибосомами короткоживущей РНК *, названной информационной (иРНК).

Сейчас она обозначается как матричная РНК (мРНК), потому что ее роль

заключается в переносе информации от ДНК в ядре (где она синтезируется

под действием ДНК-зависимой РНК-полимеразы) до цитоплазмы, где она

соединяется с рибосомами и служит матрицей, на которой осуществляется

синтез белка. Эта блестящая гипотеза затем экспериментально была до-

казана в лаборатории М. Ниренберга. При изучении влияния различных

фракций клеточной РНК на способность рибосом, выделенных из Е. coli,

к синтезу белка было установлено, что некоторые из них стимулировали

включение

 14

С-аминокислот в синтезируемый полипептид. Добавление

синтетического полинуклеотида, в частности полиуридиловой кислоты

(поли-У), в белоксинтезирующую систему приводило к включению в

синтезирующуюся белковую молекулу единственной аминокислоты –

фенилаланина. Поли-У вызывал синтез в бесклеточной системе необычного

полипептида полифенилаланина. Таким образом, искусственно синтези-

рованный полирибонуклеотид, добавленный к препаратам рибосом, вклю-

чавшим известные к тому времени факторы белкового синтеза и источники

энергии, вызывал синтез определенного, запрограммированного полипеп-

тида.

Эти опыты открыли возможность для экспериментальной расшифровки

всего  г е н е т и ч е с к о г о кода, при помощи которого информация от РНК

передается на синтезируемый белок. Последовательность нуклеотидов РНК

реализуется в специфической последовательности аминокислот синтези-

руемой полипептидной цепи. Опыты М. Ниренберга свидетельствуют

также о том, что не рибосома и не рибосомная рРНК являются матрицей,

на которой синтезируются специфические белки, а эту роль выполняют

поступающие извне матричные РНК. Итак, ДНК передает информацию на

РНК, которая синтезируется в ядре и затем поступает в цитоплазму; здесь

РНК выполняет матричную функцию для синтеза специфической белковой

молекулы. Матричная гипотеза белка, как и других полимерных молекул

ДНК и РНК (см. ранее), в настоящее время получила подтверждение. Ее

правомочность была доказана в экспериментах, которые обеспечивали

точное воспроизведение первичной структуры полимерных молекул. Этот

* Впервые на возможность существования в клетках быстро обменивающейся молекулы

РНК было указано в работах А.Н. Белозерского и А.С. Спирина.

519

синтез в отличие от малоуправляемого химического синтеза отличался не

только высокой скоростью и специфичностью, но и направленностью

самого процесса в строгом соответствии с программой, записанной в

линейной последовательности молекулы матрицы.

Природа генетического кода

Проблема синтеза белка тесно связана с понятием генетического кода.

Генетическая информация, закодированная в первичной структуре ДНК,

еще в ядре переводится в нуклеотидную последовательность мРНК. Вопрос

о том, каким образом эта информация передается на белковую молекулу,

долго не был ясен. Первые указания на существование прямой линейной

зависимости между структурой гена и его продуктом – белком можно найти

у Ч. Яновского. В серии изящных опытов с применением методов гене-

тического картирования и секвенирования он показал, что порядок из-

менений в структуре мутантного гена триптофансинтазы у Е. coli точно

соответствует порядку изменений в аминокислотной последовательности

молекулы белка-фермента.

Эукариотические клетки обладают особым механизмом точного и эф-

фективного перевода последовательности мРНК в соответствующую по-

следовательность аминокислот синтезируемого белка. Сами молекулы

мРНК не имеют сродства к аминокислотам, и было высказано пред-

положение о том, что для перевода нуклеотидной последовательности

мРНК на аминокислотную последовательность белков необходим некий

посредник, названный адаптором (см. ранее). Молекула адаптора должна

быть наделена способностью узнавать нуклеотидную последовательность

специфической мРНК и соответствующую аминокислоту. Клетка, имеющая

подобную адапторную молекулу, может встраивать каждую аминокислоту

в подходящее место полипептидной цепи в строгом соответствии с нуклео-

тидной последовательностью мРНК. Остается, таким образом, незыб-

лемым положение, что сами по себе функциональные группы аминокислот

не способны вступать в контакт с матрицей и информационной мРНК.

Было показано, что в нуклеотидной последовательности мРНК имеются

кодовые «слова» для каждой аминокислоты – генетический код. Вероятнее

всего, он заключается в определенной последовательности расположения

нуклеотидов в молекуле ДНК. Вопросы о том, какие нуклеотиды от-

ветственны за включение определенной аминокислоты в белковую мо-

лекулу и какое количество нуклеотидов определяет это включение, ос-

тавались нерешенными до 1961 г. Теоретический разбор показал, что код не

может состоять из одного нуклеотида, поскольку в этом случае только

4 аминокислоты могут кодироваться. Однако код не может быть и

дуплетным, т.е. комбинация двух нуклеотидов из четырехбуквенного «ал-

фавита» не может охватить всех аминокислот, так как подобных ком-

бинаций теоретически возможно только 16 (4

2

 = 16), а в состав белка

входит 20 аминокислот. Для кодирования всех аминокислот белковой

молекулы был бы достаточным триплетный код, когда число возможных

комбинаций составит 64 (4

3

 = 64).

Из приведенных данных М. Ниренберга становится очевидным, что

поли-У, т.е. РНК, гипотетически содержащая остатки только одного

уридилового мононуклеотида, способствует синтезу белка, построенного из

остатков одной аминокислоты – фенилаланина. На этом основании был

сделан вывод, что кодоном для включения фенилаланина в белковую

молекулу может служить триплет, состоящий из трех уридиловых нуклео-

520