Биологическая химия - часть 25

Это соединение хотя и не обнаружено в природе, но содержит тип связи,

характерный для природных нуклеиновых кислот. Видно, что С-3' рибозы

одного нуклеотида соединяется посредством фосфодиэфирной связи с

С-5' рибозы второго нуклеотида.

В медицинской практике, в частности в онкологии, нашли широкое

применение синтетические аналоги как азотистых оснований, так нуклео-

зидов и нуклеотидов. Эти аналоги, имеющие небольшие модификации

в структуре основания или углевода, встраиваясь в соответствующие

клеточные компоненты, оказывают заметный цитотоксический эффект.

К наиболее распространенным лекарственным препаратам – аналогам пу-

риновых и пиримидиновых оснований (и соответствующим нуклеотидам)

относятся 5-фторурацил, 6-тио- и 6-меркаптопурин, 8-азагуанин, 6-азаури-

дин и 6-азацитидин, а также 5-йодпроизводное дезоксиуридина.

Помимо сокращенных названий и обозначений нуклеозидов и нуклео-

тидов (см. табл. 3.3), приняты буквенные обозначения нуклеозидов (и

нуклеотидов): в частности, для аденозина (и АМФ) это А, для гуанозина (и

ГМФ) – Г, для цитидина (и ЦМФ) – Ц, для уридина (и УМФ) – У, для

тимидина (и ТМФ) – Т. Пользуясь этими символами, приведенный выше

дирибонуклеозидмонофосфат можно обозначить как Г–Т. Заметим, что как

по структуре, так и по свойствам Г–Т и Т–Г будут сильно отличаться друг

от друга (как и в случае дипептидов).

Первичная структура нуклеиновых кислот

Под первичной структурой нуклеиновых кислот понимают порядок, после-

довательность расположения мононуклеотидов в полинуклеотидной цепи

ДНК и РНК. Такая цепь стабилизируется 3',5'-фосфодиэфирными связями.

Поскольку молекулярная масса нуклеиновых кислот колеблется в широких

пределах (от 2•10

4

 до 10

10

–10

11

), установить первичную структуру всех

известных РНК и особенно ДНК весьма сложно. Тем не менее во всех

нуклеиновых кислотах (точнее, в одноцепочечной нуклеиновой кислоте)

имеется один и тот же тип связи – 3',5'-фосфодиэфирная связь между

соседними нуклеотидами. Эту общую основу структуры можно представить

следующим образом:

Установлено, что в образовании межнуклеотидной связи участвуют

гидроксильные группы в 3'- и 5'-положениях остатков углевода.

105

Основание

Основание

Основание

Пентоза

Пентоза

Пентоза

К настоящему времени удалось определить первичную структуру почти

всех тРНК, ряда молекул 5S рРНК, 16S рРНК E.coli, вирусных РНК,

в состав которых входят сотни и тысячи нуклеотидных остатков. Ниже

приводится примерная схема последовательности нуклеотидов в молекуле

РНК. Все клеточные РНК в основном состоят из одноцепочечной по-

линуклеотидной цепи:

5'-Г–У–Г–Ц–А–А–...–У–Ц–Г–Ц–Ц–А–3'

Полинуклеотидная цепь молекулы РНК имеет на одном конце почти

всегда свободный монофосфорный эфир, который принято обозначать как

5'-конец; на противоположном конце цепи такой фосфат отсутствует,

а содержится нуклеотид со свободными 2'- и 3'-гидроксильными группами.

Если подвергнуть щелочному гидролизу молекулу РНК, то в качестве

концевого нуклеотида будут обнаружены ЦМФ со свободным фосфатом

у 5'-конца и свободный аденозин в виде свободного нуклеозида у 3'-конца

полинуклеотидной цепи.

В выяснении первичной структуры РНК решающую роль сыграли

методы ступенчатого гидролиза, осуществленного в основном экзонуклеа-

зами и заключающегося в последовательном отщеплении по одному

мононуклеотиду с одного конца молекулы нуклеиновой кислоты. Ниже

представлена первичная структура первой РНК, имеющей 77 нуклеотидов,

для которой была расшифрована нуклеотидная последовательность в

1965 г. Р. Холли и сотр., а именно аланиновой тРНК:

В этой структуре Р – остаток фосфата, ψ – псевдоУМФ, МеГ – метилгуа-

нин, ДиНУ – дигидроурацил, ДиМеГ – диметилгуанин, МеИ – метилинозин.

Следует особо указать на две существенные особенности первичной

структуры всех тРНК. Первая из них заключается в том, что 5'-концом

всегда является гуаниловая (редко цитидиловая) кислота, несущая свобод-

ный остаток фосфата у С-5'. Вторая особенность – наличие на проти-

воположном конце молекулы остатков трех мононуклеотидов с одинаковой

последовательностью – ЦЦА, причем остаток адениловой кислоты содер-

жит свободную 3'-ОН-группу *.

Между этими структурами в строго определенной последовательности

располагаются все остальные нуклеотидные остатки, среди которых на

долю минорных нуклеотидов приходится до 10%. Полинуклеотидная цепь

разных типов тРНК содержит около 75 нуклеотидов.

Матричные (информационные) РНК относятся к наиболее гетероген-

ному классу нуклеиновых кислот, отличающихся по массе (см. табл. 3.1),

структуре, размерам, стабильности и функциям. Основной функцией мРНК

является перенос информации от ДНК (точнее, от гена) на белоксинте-

зирующую систему клетки. мРНК выполняет роль матрицы и, следо-

вательно, определяет первичную структуру синтезируемого белка (подроб-

нее см. главу 14). мРНК наделены рядом особенностей первичной струк-

туры; в частности, на 5'-конце все они содержат определенную после-

* Другие особенности структуры тРНК рассматриваются в главе 14.

106

довательность рибонуклеотидов, получившую название  ш а п о ч к и (кэп).

Первым нуклеотидом является 7-метилгуанозинтрифосфат, который при-

соединяется к 5'-гидроксилу соседнего мононуклеотида, представленного

2'-О-метилпуриновым нуклеотидом. На другом 3'-конце большинства (но

не всех) мРНК содержится полиадениловая последовательность (поли-А),

насчитывающая от 150 до 200 нуклеотидов.

Роль «кэпирования» и «полиаденилирования» мРНК в белковом синтезе

окончательно не выяснена. Предполагают, что кэп необходим для спе-

цифического узнавания в процессе трансляции, в то время как поли-А

отводится роль фактора стабилизации всей молекулы мРНК.

В последние годы расшифрована первичная структура не только низко-

молекулярных 5S рРНК разных бактерий и 5,8S рРНК клеток животных, но

и высокомолекулярных 16S и 18S рРНК, насчитывающих до 1200–1500

нуклеотидных звеньев. Более того, уже выяснены нуклеотидные после-

довательности 23S рРНК E.coli и 25S рРНК дрожжевой клетки, а также

первичные структуры высокомолекулярных (28S) рРНК клеток эукариот,

насчитывающих около 4700 нуклеотидов.

В настоящее время проводятся исследования первичных структур

различных молекул ДНК. Около 15 лет назад была полностью расшифро-

вана нуклеотидная последовательность митохондриальной ДНК человека

(16569 пар нуклеотидов). Известны полные нуклеотидные последователь-

ности ДНК ряда вирусов и плазмид. Совсем недавно завершено опреде-

ление нуклеотидных последовательностей геномов двух прокариотических

организмов (Haemophilus influenzae и Mycoplasma genitalum) и появились

сообщения о расшифровке генома первого эукариотического организма –

дрожжей. Близки к завершению аналогичные исследования генома E.coli

и генома нематоды Caenorhabditis elegans. Исследователи активно ра-

ботают над полной расшифровкой генома человека.

Результаты секвенирования (определение нуклеотидной последователь-

ности) разных молекул ДНК накапливаются в виде компьютерных банков

данных, которые уже доступны для пользователей международных

компьютерных сетей (например, «Internet»). Ниже представлены три ва-

рианта схемы нуклеотидной последовательности ДНК:

107

А

Ц

Т

А

Ц

Т

А

Ц

Т

В последнее время о первичной структуре ДНК (точнее, отдельных ее

фрагментов) судят по ряду косвенных данных, например, по степени

сплоченности нуклеотидных звеньев в молекуле ДНК (определение сводит-

ся в конечном счете к выяснению числа и структуры отдельных фракций

нуклеотидов, так называемых изоплитов), также по кинетике реассоциации

ДНК (метод позволяет выяснить наличие в молекуле повторяющихся

последовательностей нуклеотидов). О первичной структуре ДНК судят,

кроме того, по распределению минорных оснований (имеются данные

о существовании подобной закономерности) и обнаружению в ДНК и оп-

ределению последовательности  п а л и н д р о м о в («обратно бегущие» после-

довательности, или перевертыши), которые обнаруживаются главным об-

разом в местах рестрикции (см. главу 13). Большие надежды в определении

первичной структуры ДНК исследователи возлагают на физические, хими-

ческие (синтез генов), генетические и другие методы, а также на методы

выделения некоторых генов (или их фрагментов) из природных источников

и синтеза генов на мРНК при участии фермента обратной транскриптазы.

Для установления первичной структуры ДНК недавно предложен экспресс-

метод, включающий применение двух ДНК-полимераз (из E.coli и из

бактериофага Т4). Однако во всех этих случаях определяется структура

небольшого участка ДНК, поэтому полная расшифровка первичной струк-

туры ДНК генома человека ждет своего решения.

Вторичная структура нуклеиновых кислот

В соответствии с моделью Дж. Уотсона и Ф. Крика, предложенной в 1953 г.

на основании ряда аналитических данных, а также рентгеноструктурного

анализа молекула ДНК состоит из двух цепей, образуя правовращающую

спираль, в которую обе полинуклеотидные цепи закручены вокруг одной

и той же оси. Удерживаются цепи благодаря водородным связям, обра-

зующимся между их азотистыми основаниями (рис. 3.1). Обе цепи поли-

нуклеотидов в биспиральной молекуле ДНК имеют строго определенное

пространственное расположение, при котором азотистые основания нахо-

дятся внутри, а фосфорильные и углеводные компоненты – снаружи *.

Детальный анализ всевозможных вариантов образования водородных

связей между основаниями показал, что в биспиральной молекуле ДНК

основания уложены парами: пурин из одной цепи и пиримидин из другой

в соответствии с правилами Чаргаффа. Поскольку ориентация оснований на

плоскости не является, очевидно, произвольной, и основания в поли-

нуклеотидах представлены в лактамной форме, наиболее вероятными были

признаны пары аденин–тимин и гуанин–цитозин. Этот способ спаривания

получил в дальнейшем экспериментальное подтверждение. Избиратель-

ность взаимодействия пар А–Т и Г–Ц принято выражать термином

« к о м п л е м е н т а р н о с т ь » , а соответствующие азотистые основания на-

зывают  к о м п л е м е н т а р н ы м и . Стабильность А–Т оснований обеспе-

чивается двумя водородными связями, а пар Г–Ц – тремя, что в свою

очередь определяется особенностями расположения функциональных групп

азотистых оснований. Длина водородных связей между основаниями со-

ставляет около 0,3 нм. Таким образом, комплементарными оказываются не

только отдельные основания, но и дезоксирибонуклеотидные цепи ДНК

* За это открытие Дж. Уотсон и Ф. Крик вместе с М. Уилкинсом получили Нобелевскую

премию в 1962 г.

108