Биологическая химия - часть 23

гомогенизации биоматериал обрабатывают крепкими солевыми раство-

рами (10% раствор хлорида натрия) с последующим осаждением нуклеино-

вых кислот этанолом. В настоящее время для выделения нуклеиновых

кислот в нативном состоянии пользуются более «мягким» фенольным

методом, основанным на обработке нейтрального забуференного раствора

нуклеопротеинов фенолом. Обычно эту процедуру проводят в присутствии

веществ, вызывающих денатурацию белкового компонента, например до-

децилсульфата (ДСН) или салицилата натрия, затем смесь подвергают

центрифугированию. При этом денатурированный белок попадает в фе-

нольную фазу, а нуклеиновые кислоты остаются в водной среде, из которой

их осаждают на холоде добавлением 2–3 объемов этанола. Этим методом

удается получить достаточно очищенные препараты нуклеиновых кислот.

В настоящее время применяют ряд усовершенствованных методов

разделения нуклеиновых кислот на фракции из суммарного препарата,

полученного описанным методом. Это прежде всего хроматография на геле

фосфата кальция, ионообменная хроматография (в качестве адсорбентов

используют ДЭАЭ-целлюлозу, ДЭАЭ-сефадекс и др.), ультрацентрифуги-

рование в градиенте плотности сахарозы, хроматография по сродству на

белковых носителях, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, гель-

электрофорез и др.

После получения нуклеиновых кислот в чистом виде их подвергают

гидролизу для изучения химического состава. Для этих целей используют

ферментативные методы (экзо- и эндонуклеазы), а также чисто химические

методы гидролиза, в частности нагревание нуклеиновых кислот с хлорной

кислотой.

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) относятся к сложным высокомолеку-

лярным соединениям, состоят из небольшого числа индивидуальных хи-

мических компонентов более простого строения. Так, при полном гидро-

лизе нуклеиновых кислот (нагревание в присутствии хлорной кислоты)

в гидролизате обнаруживают пуриновые и пиримидиновые основания,

углеводы (рибоза и дезоксирибоза) и фосфорную кислоту *:

В молекуле ДНК углевод представлен дезоксирибозой, а в молекуле

РНК – рибозой, отсюда их названия: дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и ри-

бонуклеиновая (РНК) кислоты. Кроме того, они содержат фосфорную

кислоту, по два пуриновых и по два пиримидиновых основания; различия

только в пиримидиновых основаниях: в ДНК содержится тимин, а в РНК –

урацил. В составе ДНК и РНК открыты так называемые минорные

* В составе ДНК открыт также кремний в количестве 0,26–0,31%, поэтому предполагают,

что он в нуклеиновых кислотах изоформен фосфору и способен включаться в полинуклсотид-

ную последовательность.

97

ДНК

Н

3

РO

4

Дезоксирибоза

Аденин

Гуанин

Цитозин

Тимин

РНК

Н

3

РO

4

Рибоза

Аденин

Гуанин

Цитозин

Урацил

(экзотические) азотистые основания (строение некоторых из них приводится

далее).

Углеводы (рибоза и дезоксирибоза) в молекулах ДНК и РНК находятся

в β-D-рибофуранозной форме:

В составе некоторых фаговых ДНК обнаружена молекула глюкозы,

которая соединяется гликозидной связью с 5-оксиметилцитозином.

Основу структуры пуриновых и пиримидиновых оснований составляют

два ароматических гетероциклических соединения – пиримидин и пурин *:

Молекула пурина состоит из двух конденсированных колец: пиримидина

и имидазола.

В составе нуклеиновых кислот встречаются три главных пиримидиновых

основания: цитозин, урацил и тимин.

Помимо главных пиримидиновых оснований, в составе нуклеиновых

кислот открыты минорные пиримидиновые основания, 5-метил- и 5-окси-

метилцитозин, дигидроурацил, псевдоурацил, 1-метилурацил, оротовая

кислота, 5-карбоксиурацил, 4-тиоурацил и др. Забегая несколько вперед,

укажем, что только для тРНК список минорных оснований приближается

к 50. На долю минорных оснований приходится до 10% всех нуклеотидов

тРНК, что имеет, очевидно, важный физиологический смысл (защита

* Для удобства представления структурных формул азотистых оснований и углеводов

в дальнейшем в структуре колец опущены атомы С и Н.

98

D-рибоза

β-D-рибофураноза

D-2-дезоксири-

боза

β-D-2-дезокси-

рибофураноза

Пиримидин

Пурин

Цитозин

Урацил

Тимин

молекулы РНК от действия гидролитических ферментов). Структурные

формулы ряда минорных пиримидиновых оснований представлены в форме

нуклеозидов – соединений с углеводным компонентом:

Два пуриновых основания, постоянно встречающихся в гидролизатах

нуклеиновых кислот, имеют следующее строение:

К минорным нуклеозидам пуринового ряда, обнаруживаемым в составе

ДНК и РНК, относятся инозин, N

6

-метиладенозин, N

2

-метилгуанозин,

ксантин, гипоксантин, 7-метилгуанозин и др.

Одним из важных свойств свободных азотистых оснований (содержащих

оксигруппы) является возможность их существования в двух таутомерных

формах, в частности лактим- и лактамной формах, в зависимости от

значения рН среды: при рН 7,0 они представлены в лактамной форме, при

снижении величины рН – в лактимной форме. Таутомерные превращения

можно представить на примере урацила.

99

Рибоза

Дигидроуридин

Рибоза

Риботимидин

Псевдоуридин

Рибоза

Рибоза

Тиоуридин

(тиопиримидин)

Аденин

Гуанин

Рибоза

Инозин

Рибоза

N

6

-метиладенозин

Рибоза

N

2

-метилгуанозин

Лактим

Лактам

Оказалось, что в составе природных нуклеиновых кислот все оксипроиз-

водные пуринов и пиримидинов находятся в лактамной форме.

О локализации и количественном содержании нуклеиновых кислот

в клетках получены определенные данные. Доказано, что количественное

содержание ДНК в клетках одного и того же организма отличается

удивительным постоянством и исчисляется несколькими пикограммами,

однако в клетках разных видов живых организмов имеются существенные

количественные различия в содержании ДНК. Хорошо известно также, что

ДНК преимущественно сосредоточена в ядре, а в митохондриях и хлоро-

пластах содержится только небольшой процент клеточной ДНК. О коли-

честве РНК нет точных данных, поскольку содержание ее в разных клетках

в значительной степени определяется интенсивностью синтеза белка. На

долю РНК приходится около 5–10% от общей массы клетки. Современная

классификация различных типов клеточной РНК основывается на данных

топографии, функции и молекулярной массы. Выделяют три главных вида

РНК: матричную (информационную) – мРНК, которая составляет 2–3% от

всей клеточной РНК; рибосомную – рРНК, составляющую 80–85% и транс-

портную – тРНК, которой около 16%. Эти 3 вида различаются нуклеотид-

ным составом и функциями (табл. 3.1).

Таблица3.1. Свойства РНК у Е.coli (по А. Ленинджеру)

Тип

РНК

мРНК
тРНК
рРНК
рРНК
рРНК

Скорость

седиментации,

ед. Сведберга (S)

6–25

4

5

16

23

Молекулярная

масса

250000–1000000

23000–30000

~ 35000

~ 550000

~ 1100000

Число нуклеотид-

ных остатков

75–3000

75–90

% от общей

РНК

2

16

82

Матричная РНК (мРНК) синтезируется в ядре на матрице ДНК, затем

поступает в рибосому, выполняя матричную функцию при синтезе белка

(см. главу 14). По предположению акад. А.С. Спирина, часто мРНК при

поступлении из ядра в цитоплазму образует со специфическими РНК-свя-

зывающими белками комплексы – так называемые информосомы, способ-

ные к обратимой диссоциации. Информосомы рассматриваются как транс-

портная форма мРНК, способствующая образованию полирибосом в цито-

плазме. Транспортные РНК (тРНК) имеют небольшую молекулярную

массу и содержатся в растворимой фракции цитоплазмы, выполняя функ-

цию переноса аминокислот к месту белкового синтеза – рибосоме. Рибосом-

ные РНК (рРНК), как видно из данных табл. 3.1, имеют разную и значи-

тельно большую молекулярную массу. Они локализуются в двух суб-

частицах рибосом 50S и 30S у Е.coli и 60S и 40S в клетках животных

(табл. 3.2).

Субчастица 60S содержит три разных рРНК (5S, 5,8S и 28S рРНК), в то

время как субчастица 40S – одну молекулу 18S рPHK. Детально роль рРНК

в белковом синтезе пока не выяснена (см. главы 13, 14).

100