СТРОЕНИЕ ГЕНА

Глава восьмая

СТРОЕНИЕ ГЕНА

Итак, мы уже знаем, что ген — это фрагмент ДНК, расположенный на хромосоме и определяющий структуру полипептидной цепи. В гене могут происходить мутации, и о том, что гены существуют, мы узнали во многом именно благодаря мутациям. Мутации часто приводят к потере фермента, поэтому мы знаем, что существуют нормальные гены и нормальные ферменты, а также то, что гены передают информацию о постройке ферментов следующему поколению организмов. Остается только выяснить, как устроены сами гены и как они функционируют. В этой главе мы покажем, как с помощью генетического анализа можно подробно изучить строение генов и понять, как с их помощью в клетке создаются белки.

Распределение генов

То, что гены расположены в хромосомах, казалось бы, не соответствует тому факту, что у людей только 23 пары хромосом и вместе с тем тысячи различных признаков, которым должны соответствовать тысячи различных генов. Одних только признаков, сцепленных с Х-хромосомой, несколько сотен, а на самой короткой аутосоме расположены также сотни генов. Как это согласуется с менделевским законом независимого распределения признаков? Это значит, что закон независимого распределения признаков применим только для генов, расположенных на разных хромосомах; сначала ученым необходимо было определить основные законы и выяснить природу наследственности на примере простейших признаков. На самом деле многие гены расположены на одной и той же хромосоме, поэтому они, как правило, наследуются вместе. Такие гены называются сцепленными. Одно из достижений современной генетики и заключается в том, что созданы карты сцепления для многих признаков. На этих картах показано также относительное положение генов на хромосомах, и мы увидим, что эти карты имеют не только теоретическое, но и практическое значение.

Место, которое ген занимает на хромосоме, называется локусом. За исключением тех редких случаев, когда происходит перестройка хромосомы, у всех представителей отдельного биологического вида каждый ген имеет строго определенный локус. Мы уже говорили, что о существовании генов узнали по мутациям, которые обычно изменяют гены, делая их дефектными или необычными. Большинство наследственных признаков известны по таким наследственным заболеваниям, как гемофилия, дальтонизм и фенилкетонурия. Нормальные аллели гена называются дикими, хотя, как правило, этот термин применим только для некоторых организмов, с которыми проводят опыты. Гены, определяющие такие признаки человека, как цвет глаз или группу крови, обычно дикими не называются. В естественной популяции имеется много аллелей одного гена. Мутантный аллель можно использовать как маркер, помогающий определить местоположение гена. Например, дефектный ген гемоглобина, который вызывает серповидноклеточную анемию, можно использовать как маркер для определения локуса генов гемоглобина вообще. Без такого варианта гена у нас бы было мало возможностей исследовать эти гены.

Генетическая карта хромосомы представляет собой линию, на которой отмечены локусы генов и относительные расстояния между ними, измеряемые в единицах карты. Хотя некоторые методы с использованием микроскопа позволяют ученым непосредственно определить локус гена на хромосоме, обычно устанавливают локус гена относительно других генов. Для этого требуются организмы, гетерозиготные по двум генам, чтобы две маркированные хромосомы могли взаимодействовать друг с другом. Распределение аллелей в этих организмах называется родительской комбинацией. Гены обозначаются буквами на двух линиях хромосом, иногда схему упрощают до одной линии:

Маркеры, обозначенные буквами сверху, располагаются на одной гомологичной хромосоме, а обозначенные буквами снизу — на другой гомологичной хромосоме. Для удобства при печати линии могут обозначаться косыми чертами, например ЛВ/аb. Поясним принцип составления карт на конкретном примере. Допустим, два гена — ген дальтонизма и гемофилии — располагаются на Х-хромосо-ме: с — аллель дальтонизма, С — аллель нормального зрения, h — аллель гемофилии, Н — аллель нормального свертывания крови. Поскольку мы не можем скрещивать людей по своему выбору, нужно собрать данные о тех семьях, в которых жены были гетерозиготны по обоим генам. Маркеры могут находиться в состоянии сопряжения, когда доминантные аллели располагаются на одной хромосоме, а рецессивные — на другой, или же в состоянии отталкивания, когда на каждой хромосоме располагаются доминантный и рецессивный аллели. Для начала рассмотрим случай, когда женщины переносят аллели в состоянии отталкивания, С h/c H. Это значит, что у них на одной Х-хромосоме аллели С и h, а на другой — с и Н. Так как сыновья получают Х-хромосому только от матери, фенотип сыновей сразу же указывает, какую хромосому они унаследовали. В данном случае можно ожидать, что половина сыновей получит ген дальтонизма, но без гена гемофилии (Н с/У), а другая половина — ген гемофилии, но без гена дальтонизма (h C/Y). В действительности же наблюдается следующее распределение:

9 С h/Y : 1 С H/Y : 1 с h/Y : 9 с H/Y.

Получается, что 10% сыновей, которых мы называем рекомбинантами, получили иную комбинацию генов, отличающуюся от комбинации их матерей.

В профазе мейоза гомологичные пары выстраиваются напротив друг друга и удерживаются вместе в хиазмах, то есть в точках, где их хроматиды переплетаются друг с другом. Иногда в точке хиазмы хроматиды разрываются и обмениваются друг с другом сегментами. Такой процесс называется кроссин-говером. Если кроссинговер происходит между локусами двух генов, то аллели этих генов перераспределяются между хромосомами.

Кроссинговер приводит к рекомбинации, и число R, равное отношению числа рекомбинантов к общему числу потомков, называется частотой рекомбинации. Данные гены рекомбинируют с частотой 10% (два рекомбинанта из 20), то есть R — 0,1.

Так как рекомбинация происходит случайным образом, R зависит от вероятности того, что кроссинговер произойдет между двумя генами. Если это расстояние очень короткое, то вероятность рекомбинации будет крайне низка, и два аллеля, скорее всего, останутся на одной хромосоме. Если расстояние между генами большое, то вероятность того, что кроссинговер произойдет в точке, расположенной между ними, повышается и как следствие повышается частота рекомбинации. Таким образом, число R можно принимать за меру расстояния между двумя генами на одной хромосоме. За единицу карты условно принимают 1% рекомбинаций, поэтому, если частота рекомбинации между С и Я равна 10%, то расстояние между этими генами равно 10 единицам. Можно доказать, что частота рекомбинации определяется только расстоянием между генами, а не начальным распределением аллелей на другом примере, где аллели находятся в состоянии сопряжения. Для такого случая имеем следующие данные:

9 С H/Y : 1 С h/Y : 1 с H/Y : 9 с h/Y.

Этого и следовало ожидать: 90% начального расположения аллелей и 10% рекомбинаций.

Определить расстояние между генами человека — достаточно сложно. У большинства организмов, скрещивать которые можно по выбору, весь процесс состоит из двух стадий. Сначала скрещиваются между собой гомозиготы с нужными аллелями и получается гетерозиготное потомство, у которого могут происходить рекомбинации; затем скрещиваются особи второго поколения, и изучается их потомство. У людей первая и вторая стадии соответствуют браку, над которым мы не властны, и поэтому остается только изучать потомков от таких браков.

Установив расстояние между двумя генами, можно по одному добавлять и другие гены. Возьмем для примера ген, маркированный по аллелям Аи а и сцепленный с геном С. Исследуем распределение аллелей у сыновей от женщин с генотипом А с/а С:

43 A c/Y, 7 A C/Y, 8 a c/Y, 42 a C/Y.

Всего получается 15 (7 + 8) рекомбинаций из сотни, то есть 15%. Поэтому ген А можно поместить на хромосомной карте в 15 единицах от гена С. Однако три гена могут располагаться в последовательности Н С А, и в таком случае расстояние между A и H будет равно 25 (10 + 15) единицам, либо они могут располагаться в последовательности А Н С, и в таком случае А и H будут находиться всего в 5 (15 — 10) единицах друг от друга. Для уточнения положения третьего гена следует учесть данные скрещиваний по генам А и Н.

Легче всего определять положение генов, сцепленных с полом, потому что расположение аллелей как минимум одной из Х-хромосом женщины можно определить по Х-хромосоме ее отца, а генотип Х-хромосомы ее сыновей также определяется непосредственно. Построить карту аутосомных хромосом труднее. В наше время созданы превосходные карты для некоторых лабораторных и культурных растений и животных (рис. 8.1), но определить точный генотип человека или хотя бы расположение аллелей (сопряжение или отталкивание) нелегко.

Карты сцепления хромосом человека оказали бы неоценимую помощь генетическому консультанту. Например, одной аутосомной доминантной мутацией Ht вызывается наследственное заболевание — хорея Гентингтона. Для этого заболевания характерно ослабление со временем функционирования нервной системы, особенно после среднего возраста. Если человек болен хореей Гентингтона, то вероятность передать своему ребенку аллель Ht составляет 50%. Можно ли уменьшить вероятность?

Предположим, что существует другой ген с двумя аллелями А и а, расположенный в 5 единицах от Ht, и что определить аллели у каждого человека легко. Допустим, у больного отца будущего ребенка Генотип A Ht/a ht, а у нормальной матери генотип ht a/ht а

Рис. 8.1. Генетическая карта плодовой мушки Drosophila melanogaster

. На основании этих данных можно уточнить вероятность передачи дефектного гена. Ребенок, гомозиготный по а, с вероятностью в 95% не будет иметь Ht, потому что Ht у больного родителя связан с А и может отделиться лишь в 5% случаев. Точно так же и для ребенка с аллелем А существует вероятность 95%, что он унаследует Ht. Конечно, родителям было бы полезно узнать, переносят ли они еще не проявивший себя аллель Ht и с какой вероятностью передадут его своим детям.

Но здесь мы опять подходим к неизбежному вопросу, какую ценность имеет знание, что человек переносит ген, способный вызвать умственную отсталость у его детей или даже послужить причиной их ранней смерти. Многие предпочли бы не знать этого и в свободном обществе они имеют полное на то право. (Право на незнание стали рассматривать в недавнее время, в связи с развитием современной науки.) Однако некоторые люди были бы этому рады; такое знание избавило бы их от пугающей неопределенности и помогло бы оценить шансы завести здоровое потомство. Кроме того, медицина постоянно развивается, и появляются новые методы лечения наследственных нарушений, которые могут проявиться в более позднем возрасте, так что со временем ценность знания, что человек является переносчиком того или иного аллеля, будет только повышаться.

Аллель, который мы обозначили как а, мог быть либо геном с определенной функцией, выражаемой фенотипически, либо участком нейтральной вариации ДНК, таким, как полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (см. далее). В обоих случаях фрагменты ДНК помогают определить наличие дефектного аллеля, но нейтральные участки встречаются чаще и потому они, как правило, более полезны.

Кроссинговер внутри генов

До середины 1940-х годов ученые полагали, что гены, скорее всего, представляют собой хромомеры, то есть крохотные комочки вдоль хромосом, благодаря которым хромосомы похожи на цепочки бус, и что кроссинговер происходит только между генами. Но некоторые опыты на плодовой мушке Drosophila melanogaster показали, что кроссинговер может происходить и внутри гена. Предположим, что в каком-то локусе двух гомологичных хромосом располагаются два явно выраженных мутантных аллеля; у мушки могут быть разные аллели, так что мушка гетерозиготна по этим аллелям. У таких мух мутантный фенотип, потому что обе копии гена мутировали. Но иногда такие мушки дают нормальное, «дикое», потомство, которое могло бы появиться только в результате рекомбинации. Это значит, что ген представляет собой не неделимый кусок хромосомы, а линейную последовательность вдоль хромосомы и что различные аллели гена могут возникать в результате мутаций во многих местах этой последовательности, а между различными участками гена возможны рекомбинации. Обозначим два аллеля цифрами / и 2, а их нормальные («дикие») участки — знаком плюс. Для наглядности каждый «дикий» участок расположим напротив мутантного. Гетерозиготные по обоим аллелям мушки имеют следующий генотип:

с промежутком между двумя участками одного гена, где может происходить кроссинговер (очень редко). В результате внутреннего кроссинговера получается одна копия полностью дикого гена и одна копия гена с обоими мутантными участками, то есть мутантного вдвойне:

В результате у мутантных мушек очень редко может появляться потомство с диким генотипом.

На примере таких редких событий можно составлять карту аллелей внутри гена. Но внутригенный кроссинговер настолько редок (порядка одного на 5000—10 000 мейозов), что для составления таких карт потребуется пересчитать очень много мушек. Кроме того, необходим особый метод, чтобы легко рассекать на части гены любой особи.

Такой метод составления генных карт — весьма мощное средство, позволившее в подробностях исследовать гены многих организмов и вирусов. В сочетании с биохимическими технологиями, о которых мы расскажем далее, он помог ученым исследовать полную структуру генома многих вирусов, хотя о функциях некоторых генов известно еще мало. Далее мы расскажем, как исследовать структуру гена помогают фаги.

Генетика фагов

Макс Дельбрюк выбрал для своих исследований фаги, потому что они представляют собой очень простую биологическую систему: крохотные частички, которые могут воспроизводить себе подобных в других клетках и, как предполагалось, переносить некий генетический материал. Первый серьезный эксперимент с фагами провел Херши, доказав, что различные штаммы фага Т2 могут рекомбиниро-вать. Для этого ему, конечно, необходимо было выделить генетически разные штаммы, и первые обнаруженные им мутанты отличались формой стерильных пятен. Например, один из мутантов образует крупные пятна с четкими краями, и Херши обозначил его буквой r (от англ. rapid — быстрый, то есть быстро лизирующий мутант); мутанты tu {turbid — мутный) образуют мутные пятна; а мутанты mi {minute — мелкий) — очень маленькие пятна. Все эти мутанты имеют отчетливо выраженный фенотип, то есть легко обнаружить образованные ими пятна, выделить их и вырастить штамм фагов с генотипом, отличающимся от дикого.

Бактерии можно заразить несколькими фагами одновременно. Херши заражал клетки мутантами r и tu, взятыми в достаточном количестве, чтобы почти каждая клетка была заражена фагами обоих типов. Большая часть потомства этих фагов принадлежала к типам r или tu, но появлялось также некоторое количество двойных мутантов r, tu и диких фагов. Таким образом, взаимодействовать могут даже ДНК вирусов, образуя в процессе кроссинговера рекомбинации. Херши использовал в своих экспериментах несколько независимых мутантов и, приняв частоту рекомбинаций между ними за условное относительное расстояние (как в классической генетике), смог расположить участки их мутаций на генетической карте. С тех пор эта карта была дополнена и расширена.

Тонкая структура гена

Сеймур Бензер исследовал тонкую структуру гена с помощью фагов Т4, среди которых ему удалось выделить редкие внутригенные рекомбинанты. Бензер сосредоточил внимание на классе мутантов r — rII. Они растут и образуют большие стерильные пятна на штамме Е. coli В, но не растут на штамме Е. coli К. В отличие от них дикие формы rII⁺ растут и на В, и на К. Бензер обнаружил сотни новых мутантов rII,, которые оказались полезными не только для составления карты, но и для уточнения того, что же, собственно, представляет собой ген.

В типичном эксперименте по составлению карты штамм В бактерий заражают двумя различными мутантами rII и получают потомство, состоящее в основном из тех же двух типов мутантов, как и родители, но и, кроме того, из нескольких рекомби-нантов. Общее число фагов определяется в результате подсчета стерильных пятен на штамме В. Если выращивать потомство на штамме бактерий К, то мутан-тные типы вымирают и остаются только рекомби-нантные, так что появляется возможность установить более точное их соотношение¹. Бензер доказал, что рекомбинации происходят в основном между аллелями внутри локуса rII, и смог определить генетическое расстояние между каждыми двумя му-тантными участками (сайтами) и даже составить карту этих аллелей. Небольшая часть этой карты выглядит следующим образом:

Каждый квадратик на карте означает аллель, отдельный от других аллелей; квадратики один над другим означают аллели, которые невозможно разделить, и, следовательно, они представляют собой мутации, возникающие в одной и той же позиции. Отсюда ясно, что Бензер создал карту, на которой ген можно поделить на различные участки, и каждый участок, по всей видимости, соответствует отдельной нуклеотидной паре ДНК.

Предложенная Бензером схема подтверждает также важное предположение о строении генов. Так как гены находятся в ДНК, было высказано предположение, что при синтезе белка последовательность оснований ДНК просто читается по порядку друг за другом. Но можно было предположить и другое: ген представляет собой отдельный «узел» ДНК, кодирующий белок каким-то более сложным способом. Результаты, полученные Бензером, доказывают, что ген обладает простой, линейной структурой, и это согласуется с самой простой гипотезой о функционировании ДНК.

Комплементация и определение границ гена

Эксперименты по составлению карт показали, что область rII состоит из многих мелких участков, или сайтов, в которых могут происходить разные мутации. Но такие карты дают представление только о строении гена и ничего не говорят о его функции. Даже неизвестно, состоит ли область rII из одного гена или нескольких. Для определения границ гена необходимы другие опыты, не имеющие ничего общего с кроссинговером и составлением карт даже если внешне эти опыты выглядят как эксперименты по составлению карт. Такие опыты называются комплементационными тестами, и их лучше всего объяснить при помощи модели.

Предположим, что мутации rII затрагивают два различных гена, которые расположены рядом, и что при мутации они оба дают одинаковый фенотип. Так как предполагается, что отдельный ген кодирует информацию о синтезе отдельного полипептида, то эти два гена должны кодировать синтез двух отдельных полипептидов, которые мы назовем А и В. Предположим, что оба гена необходимы для нормального функционирования в клетках К (для штамма В они несущественны). Тогда, если смешать клетки К с двумя различными мутантами, можно узнать, производятся ли оба белка. На рис. 8.2 показано, как различные мутации могут воздействовать на эти гены. Допустим, обе мутации происходят в гене А. Так как функциональный белок А не производится, то фаг расти не может. Теперь предположим, что одна мутация затрагивает ген А, а другая — ген В. Теперь в одном фаге имеется функциональный ген В, а в другом — функциональный ген А. Если клетку одновременно заразить этими двумя фагами, то они могут дополнить друг друга (то есть быть комплементарными друг другу): каждый выполняет функцию, отсутствующую у другого, и оба они могут расти. (Еще раз заметим, что эти тесты проверяют только функции генов, они не учитывают кроссинговер и рекомбинации.)

Когда Бензер заразил бактерии Е. coli К смесью мутантов rII, он получил именно те результаты, которые и предсказывала модель. Мутационные участки расположены вдоль линии и разделены на две группы.

Рис. 8.2. С помощью комплементационного теста можно определить, происходят ли две мутации внутри одного гена или нет. Бактерии одновременно заражают двумя фагами с двумя различными мутациями, которые затрагивают либо один ген (слева), либо два гена (справа). Если мутации затрагивают один ген, то ни в одном фаге не создается нормальной копии гена, поэтому фаги не могут размножаться. Но если мутации затрагивают оба гена, то один фаг имеет нормальный ген А, а другой — нормальный ген В, и оба гена дополняют друг друга. Обратите внимание, что этот тест не имеет ничего общего с кроссинговером

Ни один из мутантов по левой группе не дополнял мутантов по этой же группе, и то же самое было с правой частью. В то же время любой мутант из левой группы оказывался комплементарным к любому мутанту из правой группы. Эти результаты доказывают, что область rII действительно включает в себя два гена. (Хотя Бензер называл отдельную функциональную единицу цистроном, сейчас цистроном называют то же, что и ген.) Комплементационные тесты, подобные этому, в наши дни применяют ко всем организмам, чтобы узнать, происходят ли две мутации внутри одного гена или нет, и определить таким образом границу между генами.

Что же такое ген!

Вернемся к определению гена. В классической генетике словом «ген» обозначалась единица генетического материала, выделяемая по трем критериям: по функции, мутации и рекомбинации. Изначально предполагалось, что ген — это функциональная единица, то есть нечто, определяющее отдельный признак. Такое представление сохранилось и до сих пор, но сейчас нам известно, что на один и тот же признак могут воздействовать различные гены и что при мутации гены могут давать один и тот же фенотип. Кроме того, ген определяли как единицу мутации. Эксперименты Бензера показали, что ген представляет собой линейную последовательность многих участков, в которых возможны разные мутации, и мы только что показали, как в комплементационных тестах можно выделять гены на основе происходящих в них мутаций. При этом ген понимается как последовательность, кодирующая синтез отдельной полипептидной цепи, и это представление основано на концепции Бидла и Тэй-тема «один ген — один фермент». Гены они определяли и как единицы рекомбинаций, хотя сейчас известно, что гены не представляют собой неделимые «бусины» на цепи, а рекомбинации происходят и внутри генов. Это и следовало ожидать, если предположить, что ген представляет собой всего лишь участок ДНК, любые нуклеотидные пары которой могут изменяться, в результате мутации и рекомбинаций.

В свете последних исследований, особенно секве-нирования (определения последовательности ДНК), приходится по-новому прдходить к вопросу о том что представляет собой ген. Так, оказалось, что в ДНК эукариот последовательности, кодирующие синтез белков, прерываются некодирующими последовательностями, называемыми интронами, которые удаляются непосредственно перед синтезом белка. Иногда на протяжении одного участка ДНК кодирующие последовательности, прерываемые интронами, сочетаются по-разному и кодируют разные белки. Если отождествлять отдельный ген с производством отдельного белка, то приходится признать, что одна и та же последовательность ДНК в таких случаях содержит несколько генов. Это только одна из трудностей. Другая состоит в том, что экспрессию, или «включенность», генов контролируют последовательности на участках ДНК, примыкающих к кодирующей последовательности, но не входящих в нее. Мутации в контролирующих участках могут привести к утрате геном функции, точно так же как и мутации внутри кодирующей последовательности. Поэтому, если выделять ген по критерию мутации, приходится признать, что контролирующие участки тоже относятся к гену. И наконец, подробный анализ ДНК-последовательностей целых геномов, включая и геном человека, предоставляют возможность опознать гены (по крайней мере, нечто вроде генов) на основании последовательности, а не мутаций. Белки со схожими функциями даже в очень отличающихся друг от друга организмах имеют много общего в строении. В настоящее время собраны обширные базы данных о ДНК-последовательностях, кодирующих белки; компьютерные программы могут просматривать все вновь определяемые последовательности и устанавливать возможные гены, предположительно кодирующие белки с теми или иными функциями. Даже если новая последовательность оказывается совсем не похожей на те, что уже имеются в базе, ученые все равно могут сделать вывод, что это ген, на основании хорошо известных признаков, общих для всех генов. Исходя из самого поверхностного анализа человеческого генома возможно предположить, что он содержит 30 000—50 000 генов, но если одна последовательность может включать более одного гена, то количество генов будет гораздо больше.

Генетические эксперименты Бензера и других ученых помогли составить представление о строении гена. Однако для любой науки характерно, что очередное открытие в отдельной области или технологии способно изменить основные ее положения. Для того чтобы функция генов стала более понятной, прочтите гл. 9, в которой более подробно объясняется, каким образом код ДНК преобразуется в структуру белка. Но прежде мы перенесемся через несколько лет и расскажем о другой процедуре составления карт, основанной на современном биохимическом анализе ДНК.

Рестрикционные ферменты и палиндромы

Бактерии и фаги, которые их атакуют, находятся в состоянии непрерывной химической войны. Бактерии, оказывающие сопротивление фаговой инфекции, получают преимущество в борьбе за существование, и они выживают с большей вероятностью. Точно так же фаги, преодолевающие защитные барьеры бактерий, получают определенное преимущество. Бактерии производят рестрикционные ферменты — эндонуклеазы (рестриктазы), которые атакуют молекулы ДНК, разрезая их фосфодиэфир-ные связи (эндо- означает, что они разрезают молекулу изнутри, а не по краям). Эти ферменты образуют рестрикционную систему, которая разрушает фаговые ДНК. Сейчас разработаны простые и быстрые методы определения последовательности молекул ДНК. Секвенирование ДНК показывает, что каждая эндонкулеаза очень специфична и что она разрезает только очень короткую последовательность ДНК, чаще всего так называемый палиндром. Палиндром — это последовательность букв, которая одинаково читается как обычным способом, так и задом наперед подобно известным фразам: «А роза упала на лапу Азора» или «А кит на море — романтика!» Молекулярный палиндром — это последовательность оснований, которая также читается одинаково в любом направлении, например:

3'-GAATTC-5' или 5'-CTTAAG-3'.

Фермент, атакующий именно эту последовательность, синтезируется штаммом Е. coli RY13, так что если фаг с такой последовательностью попытается атаковать бактерию, фермент разрежет его ДНК на фрагменты и остановит инфекцию. На рис. 8.3 указаны последовательности, которые подвергаются атаке со стороны ферментов, выделенных из различных типов бактерий. (Источник каждого фермента обозначен трехбуквенным сокращением по названию бактерии, например, фермент, выделенный из Е. coli RY13, называется EcoRI.)

Почему в таком случае бактерии не разрушают собственную ДНК? В них параллельно рестрикци-онной включается модификационная система, ферменты которой добавляют метиловую группу (СН₃) к аденинам последовательности, блокируя тем самым действие рестрикционной эндонуклеазы. Некоторые фаги добавляют метиловую группу к своей ДНК и становятся невосприимчивыми к такой эн-донуклеазе.

Секвенирование ДНК

ДНК можно поделить на фрагменты во время электрофореза (рис. 8.3). При этом используют вещество агарозу, похожее на агар, который используют в качестве питательной смеси. Смесь молекул ДНК помещают на гель агарозы. Когда через гель пропускают электрический ток, отрицательно заряженные молекулы ДК устремляются к положительному полюсу и более мелкие молекулы движутся быстрее. Этот метод настолько чувствителен, что с его помощью можно определить длину молекулы

Рис. 8.3. Молекулы ДНК можно легко разделить электрофорезом в геле арагозы. Чем меньше фрагмент, тем быстрее он перемещается

вплоть до отдельного основания. Увидеть распределение молекул можно, нанеся на гель краситель, который связывается исключительно с ДНК. Основной принцип определения последовательности, или секвенирования, ДНК исходит из двух главных положений. Во-первых, синтез цепи ДНК начинается с короткого участка-лраймера (затравки) и продолжается в направлении 5'—>3'; во-вторых, очередной нукпеотид добавляется к цепи, только если у рибозы на конце имеется атом кислорода в позиции 3'. Однако можно синтезировать дидезоксинуклеотиды (ddN) без этого атома кислорода; их можно включать в растущую цепь, но только после них другие нуклеотиды включаться не будут и рост цепи прекратится. Поэтому ученые начинают с отдельной цепи ДНК, к которой добавляют короткую комплементарную затравку, ДНК-полимеразу и смесь четырех нуклеотидов, необходимых для синтеза ДНК. (В смеси содержится достаточное количество каждого рода вещества.) Обычно конец 5' помечается ³²Р, поэтому можно определить местонахождение ДНК с помощью авторадиографии. Затем эту смесь разделяют на четыре пробирки. В одну добавляют немного ddA, в другую — ddC, в третью — ddG, в четвертую ddT. Синтез комплементарной цепи ДНК происходит в каждой пробирке, удлиняя начальные цепочки-затравки, но рост каждой молекулы заканчивается тогда, когда к ней случайным образом присоединяется дидезоксинуклеотид. Поэтому если в последовательности имеется, например, десять положений для ти-мина Т, то в большинстве из них окажется обычный тимин dT, при этом добавленного ddT хватит, чтобы создать молекулы десяти различных размеров, каждая из которых заканчивается тимином. Если вещество из пробирки ddT поместить в гель, то при электрофорезе молекулы ДНК разделятся на десять частей и образуют десять полосок. То же самое произойдет и с молекулами ДНК из других пробирок. Полную последовательность ДНК можно прочитать, начиная непосредственно с самой дальней полоски и заканчивая самой ближней (рис. 8.4).