Глава седьмая

НАСЛЕДСТВЕННЫЙ МАТЕРИАЛ, ДНК

 

С самых первых научных исследований механизма наследственности ученых не переставал интересовать главный вопрос: «Что представляет собой наследственный материал?» В начале XX века гипотеза Саттона—Бовери о том, что гены находятся в хромосомах, стала общепризнанным мнением. Но какое химическое вещество в хромосомах служит переносчиком генетической информации? Еще на заре биохимии ученые предполагали, что на роль носителя информации подходят два основных вида химических веществ клетки — белки и нуклеиновые кислоты. И хотя об их строении было известно мало, белки, как более сложные, казались наиболее подходящим кандидатом. Поэтому считалось, что гены состоят из белков. Вместе с тем некоторые опыты свидетельствовали о том, что не стоит сбрасывать со счетов и нуклеиновые кислоты. Когда Э. Б. Уилсон публиковал свой классический труд «Клетка и ее роль в наследственности и эволюции», в одном издании он написал, что наиболее важный материал — белки, а в другом издании назвал нуклеиновые кислоты. Однако никто ничего не знал наверняка.

Ответ на этот ключевой вопрос дали исследования бактерий и поражающих их вирусов. В небольшой промежуток времени, в 1952—1953 годы стало окончательно ясно: наследственное вещество — это дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), и ее физическая структура определяет все основные феномены наследственности. Отождествление ДНК с генетическим материалом и открытие ее структуры — одно из величайших научных достижений XX века. Смысл этого открытия поистине грандиозен. Структура молекул ДНК в огромной степени определяет наши физические черты, включая строение нервной системы, поэтому можно предположить, что от ДНК во многом зависит наше поведение и даже наша личность. Знание структуры ДНК дает возможность проникнуть в тайны человеческой природы. История о том, как человек получил это знание и как были собраны воедино по кусочкам все детали сложной картины, служит замечательным примером изобретательности и гениальности человека.

Бактерии

Вспомним, что бактерии отличаются от других организмов тем, что они прокариоты, то есть не имеют окруженного мембраной ядра, в отличие от эукариот, в том числе растений и животных, в клетках которых имеется настоящее ядро. Кроме того, бактерии настолько малы, что разглядеть их можно лишь в очень хороший микроскоп (с увеличением 1000), и даже тогда их строение можно подробно рассмотреть лишь с помощью электронного микроскопа. На рис. 7.1 показаны относительные размеры некоторых наиболее распространенных бактерий и относительные размеры некоторых вирусов, которые еще меньше бактерий и которые также играют очень важную роль в изучении генетики.

 

Рис. 7.1. Большая бактерия Clostridium welchii имеет приблизительные размеры 4 х 1 мкм (микрометров). 1000 мкм = = 1 мм; 1000 нм (нанометров) = 1 мкм. Мелкие бактерии, такие как Escherichia coli и Serratia, могли бы вполне поместиться внутри нее вместе с другими, еще более мелкими бактериями и вирусами; TMV — вирус табачной мозаики

Хотя мы обычно вспоминаем о бактериях исключительно в связи с болезнями, подавляющее их большинство — «добропорядочные» существа, обитающие в естественных водоемах, почве или в других организмах. Самая изученная бактерия Escherichia coli {E. coli)¹ наряду с другими бактериями обитает в толстом кишечнике человека и входит в состав фекалий. (Эти бактерии помогают работе кишечника, а также обеспечивают нас некоторыми витаминами.) Бактерии часто изучают для того, чтобы научиться контролировать их патогенные (болезнетворные) виды, но они представляют интерес и с чисто научной точки зрения, потому что это относительно несложные одноклеточные организмы, быстро растущие в простой питательной среде. Организмы вроде Е. coli растут в растворе сахара, из которого они черпают энергию и получают атомы углерода, а также некоторых солей вроде сульфата магния и хлористого аммония, которые обеспечивают их другими строительными материалами. После стерилизации чашечки с такой питательной средой посредством нагревания в нее помещают бактерии.

Каждая клетка получает из внешней среды питательные вещества, материалы и превращает их в свои внутренние вещества при помощи большого количества ферментов. При этом она растет. (Следует заметить, что больше всего клетка производит ферментов, которые и помогают ей расти дальше.) После небольшого промежутка времени (около 30 минут) клетка делится пополам. Каждая из дочерних клеток в свою очередь продолжает расти и делиться: получаются четыре клетки, затем восемь, шестнадцать и т. д. Такая схема роста называется экспоненциальным ростом, и в чем-то она похожа на схему роста процентов капитала, при котором полученные за определенный период проценты включаются в общую сумму и учитываются при исчислении последующих процентов. (В случае с бактериями «процентные ставки» настолько велики, что достигают 100% за полчаса.) Несколько бактерий могут дать неисчислимое потомство, и их рост прекратится, когда в среде исчерпаются питательные вещества, кончится кислород или накопится слишком много отходов.

Питательная смесь агар (вещество, получаемое из водорослей и применяемое, в частности, как уплотнитель для мороженого) при остывании приобретает студенистую консистенцию, и на такой плотной основе легко выращивать и изучать бактерии. При помощи стерильной пипетки или проволочной петли на поверхность агара наносят бактерии и распределяют их стерильной стеклянной палочкой. Эта процедура называется посевом бактерий. Каждая клетка растет и размножается там, куда ее поместили, поэтому все дочерние клетки концентрируются в одном месте. Через некоторое время клеток становится так много, что появляются видимые колонии (рис. 7.2) определенного цвета и формы.

Рис. 7.2. Если раствор с бактериями нанести на поверхность питательной среды в чашке Петри, то каждая клетка вырастет в заметную для глаза колонию и образует клон бактерий

По форме и цвету колоний можно опознавать разные бактерии и изучать их свойства. Каждая колония называется также клоном. Этот термин, который в современной молекулярной генетике приобрел специфические значения, обозначает прежде всего группу особей или клеток, произошедших от общего предка путем бесполого размножения. Земляника, например, может размножаться посредством отростков, которые пускают корни, и все получившиеся растения — это тоже клон. Отдельные клетки многих видов растений и животных можно выращивать также в чашках с питательной средой, где они в течение некоторого времени растут и делятся. Популяция клеток, полученных подобным способом от одной единственной клетки, также образует клон.

Первые шаги

В 1928 году Фредерик Гриффит обнаружил, что вещество умерших клеток одного штамма бактерий может переносить свои характеристики живым клеткам другого штамма. Например, было известно, что штамм IIIS бактерий Diplococcus pneumoniae может вызывать летальную пневмонию у мышей, тогда как штамм IIIR относительно безвреден. Гриффит нагрел раствор с клетками IIIS до высокой температуры, тем самым убив их, и перемешал остатки клеток с живыми клетками IIIR, после чего ввел мышам полученную смесь. Мыши погибли. По всей видимости, живые клетки вобрали в себя из мертвых клеток какой-то материал, который трансформировал их и передал им характеристики штамма IIIS. В 1944 году Освальд Т. Эйвери и его коллеги по Центру Рокфеллера в Нью-Йорке на опытах доказали, что трансформирующим фактором служит ДНК. Они разрушали белки и другие вещества клеток, но трансформация при этом продолжалась, но когда они разрушили ДНК, трансформация прекратилась.

Так был сделан первый важный шаг в исследовании генетического материала — его отождествили с нуклеиновой кислотой. Правда, подобные опыты ученую общественность особо не убеждали. Они расходились с данными, согласно которым молекула ДНК относительно проста по своей структуре. Многие биологи считали, что сложную генетическую информацию могут передавать только белки, имеющие сложную структуру, и это убеждение помешало им признать результаты опытов. Более убедительное подтверждение было получено в 1952 году в результате классического эксперимента иного рода.

 

Вирусы В отличие от организмов, состоящих из одной или нескольких клеток, существуют особые биологические неклеточные образования, способные размножаться только внутри живой клетки. Такие частицы называются вирусами. Еще древние римляне знали, что некоторые заболевания могут передаваться людям от животных, и слово virus по-латыни означает «яд». Болезни, передаваемые ядами, назывались вирулентными. Конечно, римляне не могли разглядеть невооруженным глазом, что именно вызывает болезни, и, на их взгляд, химические отравления (вроде ботулизма), инфекци

онные бактериальные болезни (вроде тифа) или вирусные заболевания (вроде полиомиелита) были одинаковы. В эпоху Возрождения болезни делили на заразные и незаразные, причем словом «вирус» обозначали заразные болезни. В XIX веке после опытов Пастера ученые узнали о существовании бактерий, которых они назвали «вирусами болезней». Но к началу XX века выяснилось, что многие заболевания вызывают какие-то неизвестные агенты, которых невозможно выращивать в питательном растворе подобно бактериям и которые настолько малы, что проходят через все фильтры для бактерий. Поэтому словом «вирус» (поначапу «фильтрующийся вирус») стали называть именно такие частицы. С внедрением в научный обиход электронного микроскопа стало возможно изучать строение вирусов во всех подробностях. В 1915 году Фредерик Творт обнаружил, что поверхность чашек с бактериями (Micrococcus) часто становится водянистой или стекловидной. На таких участках поверхности уже не было живых бактерий, но зато содержался некий фактор, поражавший другие бактерии. Открытие Творта не вызвало особого интереса биологов, но в 1917 году Феликс Д'Эрелль сообщил о «невидимых микробных антагонистах дизентерийных бацилл». Позже он написал о том, что в 1910 году при изучении бактерий, вызывающих диарею у мексиканской саранчи, он пришел к мысли, что и у бактерий бывают свои «заболевания». В толстом слое бактериальной культуры можно было разглядеть участки с мертвыми бактериями. Такое наблюдение убедило его, что с бактериями можно бороться при помощи бактериальных вирусов. В 1915 году он решил найти вирусы, убивающие дизентерийные бактерии Shigella. Свое открытие Творт описывал следующим образом: «На следующее утро, открыв инкубатор, я испытал одно из тех редких мгновений сильногодушевного подъема, которые вознаграждают исследователя за все невзгоды: с первого взгляда я заметил, что бульон с культурой, который накануне ночью был мутным, стал ясным и чистым; все бактерии исчезли, растворились, словно сахар в воде. Там, где я сделал мазки на агаре, не было заметно роста, и душевное волнение я испытал в тот момент, когда понял: причиной появления всех чистых участков был невидимый микроб — микроб, не проходящий через фильтры, нефильтрующийся вирус, паразитирующий на бактериях. И тут же я подумал: "Если это верно, то, по всей видимости, то же самое произошло за ночь и с больным, который вечером накануне находился в критическом состоянии. В его кишечнике, как и в моей пробирке, дизентерийные бациллы должны были раствориться под действием своего паразита. Теперь его можно излечить". Я тут же бросился в больницу. И действительно, за ночь его общее состояние чрезвычайно улучшилось, и началось выздоровление»2. Д'Эрелль назвал вирусы бактерий бактериофагами («пожирателями бактерий»). Благодаря его упорному стремлению найти мощное антибактериальное средство были открыты фаги, специфические для возбудителей сибирской язвы, бронхита, диареи, скарлатины, бубонной чумы и остеомиелита. Вдохновленный примером Д'Эрелля, писатель Синклер Льюис написал роман об ученом Мартине Эрроу-смите, который открыл Х-принцип, подобный бактериофагам Д'Эрелля. В течение последующих десятилетий во многих странах о терапевтических свойствах бактериофагов

особо не вспоминали, в основном благодаря тому, что антибиотики, широко распространившиеся во время Второй мировой войны, позволяли легко излечивать инфекционные заболевания. Однако в Восточной Европе, особенно в Польше и Советском Союзе, фаговой терапии продолжали уделять важное внимание. В течение последних нескольких лет о ней вновь заговорили, потому что многие патогенные бактерии выработали иммунитет ко всем применявшимся против них антибиотикам. Так фаговая терапия снова входит в моду. Но это совсем другая история, и она еще ждет своего продолжения.

Бактериофаги

В 1915 году англичанин Фредерик Творт и канадец Феликс Д'Эрелль независимо друг от друга открыли бактериофаги, которые вызывают инфекции среди бактерий. Сама идея об инфекциях среди бактерий может показаться на первый взгляд странной, поскольку мы уверены, что инфекции вызывают сами бактерии. Однако биологам хорошо известно, что у многих паразитирующих организмов имеются свои, более мелкие паразиты. Бактериофаги, или, как еще их называют, фаги, представляют собой вирусы, растущие внутри бактерий, подобно тому как другие вирусы размножаются внутри клеток растений или животных. На их примере можно исследовать общие особенности поведения вирусов.

Прежде всего, вирусы — это не организмы. Каждый организм состоит из одной или нескольких клеток, но полностью сформированные вирусные частицы, вирионы, гораздо меньше любой клетки.

 

Рис. 7.3. Общее строение вирусных частиц, или вирионов, вирусов бактерий и вирусов животных

Они состоят из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), заключенной в защитную белковую оболочку (рис. 7.3). Большинство вирионов имеют сферическую или вытянутую форму. Вирусы животных обычно попадают внутрь клеток, где присоединяются к поверхности клетки и поглощаются (подобно питательным веществам); вирусы растений обычно проникают через порезы, сделанные насекомыми или червями. Многие фаги, как тот, что показан на рис. 7.3, прикрепляются к бактериям при помощи «хвоста», или отростка. Это можно было увидеть еще на первых электронных микрофотографиях, сделанных до 1945 года. Тогда же выяснили, что фаги приблизительно наполовину состоят из белка и наполовину из ДНК. И хотя больше почти ничего о вирусах не знали, они оказались прекрасным материалом для генетических исследований.

Рис. 7.4. Фаги выращивают в чашках Петри, смешивая их образец с бактериями, в которых они могут размножаться, и с агаром. Эту смесь наливают поверх питательного агара в чашку. За несколько часов бактерии размножаются и равномерно распределяются по всему верхнему слою. Чистые участки, или бляшки, указывают на те места, где началась инфекция фагов, убивших бактерии

С фагами удобно работать еще и потому, что они очень быстро размножаются, и за полчаса образуется 100—200 новых фагов. Их также легко выращивать в чашках Петри (рис. 7.4); немного фагов смешивают с теплым агаром и бактериями, и эту смесь наливают поверх слоя питательного агара. Бактерии растут тонким равномерным слоем, который называется газоном, а деятельность фагов приводит к образованию стерильных участков, или бляшек, в центре которых начиналась инфекция, погубившая клетки вокруг. Определить количество фагов в любом материале можно по количеству бляшек в образце. Кроме того, размер и форма бляшек обычно указывают на те или иные особенности фага. Исследования размножения фагов в начале 1940-х годов проводили Макс Дельбрюк, Сальвадор Лу-рия и Альфред Д. Херши, которых неформально называли американской фаговой группой. Их ученики и последователи изучили размножение фагов во всех подробностях, сконцентрировавшись на нескольких типах — от Т1 до Т7, паразитирующих на Е. coli. Открыть структуру и принципы функционирования генов удалось во многом благодаря именно этим исследователям.

Эксперимент Херши—Чейз

Зная, что фаги приблизительно наполовину состоят из ДНК и наполовину из белков, Альфред Херши и Марта Чейз решили исследовать функции этих двух компонентов, пометив их, то есть включив в их состав радиоактивные атомы, чтобы можно было следить за ними. Было известно, что белки содержат серу, но не имеют фосфора, в то время как в ДНК много фосфора, но нет серы. Поэтому одну часть фагов они вырастили на питательной смеси с радиоактивной серой (³⁵S) и, следовательно, пометили радиоактивными атомами их белки, а другую часть — на питательной среде с радиоактивным фосфором (³²Р), пометив их ДНК.

Электронные микрофотографии показывали, что по меньшей мере часть вирионов остается прикрепленной к поверхности инфицированных фагом клеток. Поэтому Херши и Чейз помещали инфицированные клетки в смеситель и сильно встряхивали их, чтобы «срезать» с них вирионы. Затем они помещали пробирки в центрифугу, после чего бактерии оседали на дно, измеряли радиоактивность осадка и надосадочной жидкости. Клетки, зараженные фагом ³²Р, оказались очень радиоактивными, а клетки, зараженные фагом ³⁵S, были радиоактивными в гораздо меньшей степени, причем основная часть радиоактивной серы оставалась в надосадочной жидкости. Этот эксперимент доказывал, что ДНК вируса внедряется в клетку, откуда ее невозможно выделить, тогда как оставшиеся на поверхности и состоящие из белка вирионы можно «стряхнуть» с клеток.

Затем Херши и Чейз доказали, что потомство фагов, образовавшееся в этих клетках, содержит большую часть радиоактивной ДНК, но почти или совсем не содержит радиоактивного белка. Поскольку развитие новых фагов определяет материал, внедряемый внутрь клетки, то следовал логичный вывод: ДНК и есть тот самый генетический материал. Возвращаясь к трансформации бактерий, можно утверждать, что живые клетки подбирают ДНК разрушенных клеток и замещают свои гены некоторыми генами из чужих ДНК.

Эксперимент Херши—Чейз подводил ученых к одному очень важному следствию. Фаги состоят исключительно из ДНК и белка. В клетку поступает только ДНК, которая и вызывает инфекцию. Через полчаса из клетки выходят новые фаги, состоящие из ДНК и белка. Следовательно, функция ДНК состоит в том, чтобы переносить информацию о постройке этих белков.

Многочисленные эксперименты с фагами помогли выявить схему их размножения, показанную на рис. 7.5. Когда фаг вроде Т2 или Т4 присоединяется к поверхности клетки при помощи отростка, его ДНК переходит в клетку-хозяина.

Рис. 7.5. Схема протекания фаговой инфекции: А — инфицирующий фаг внедряет свою ДНК в клетку, и эта ДНК начинает преображать клетку в фабрику по производству очередных фагов; ферменты, производимые фаговой ДНК, разрушают ДНК клетки-хозяина и останавливают действие ее генов; В — фаговая ДНК многократно реплицируется; происходит синтез новых фаговых капсидов; С — новые белки капсидов объединяются с ДНК и образуют новые фаговые частицы; D — новые фаговые частицы выходят после разрушения клетки

Через несколько минут фаговая ДНК начинает синтезировать новые фаговые белки. Вначале создаются белки, отключающие функции клетки-хозяина; некоторые из них прекращают синтез белков хозяина, а другие являются ферментами, расщепляющими ДНК хозяина. Ряд других ферментов начинает репликацию ДНК фага. Вскоре синтез этих ферментов прекращается. Затем включаются новые гены, которые руководят строительством белков для капсида — белковой оболочки вируса. Эти белки самопроизвольно собираются в новые куски капсидов — головки, отростки и нити. Другие ферменты упаковывают вирусную ДНК в головку. Примерно через 30 минут после заражения клетку обычно заполняет две сотни новых вирионов, после чего происходит ее разрушение, или лизис, под действием других ферментов фага.

Строение ДНК

Вспомним, что основными строительными компонентами организма служат полимеры. Нуклеиновые кислоты — это тоже полимеры, хотя они сильно отличаются по своему строению от белков. Их еще называют полинуклеотидами, потому что они состоят из мономеров — нуклеотидов. Нуклеотид состоит из трех частей: основания, связанного с сахаром, который, в свою очередь, связан с фосфатом (РО₄). Нуклеиновая кислота называется по сахару, который входит в ее состав; рибонуклеиновая кислота (РНК) содержит рибозу, а дезоксирибо-нуклеиновая кислота (ДНК) содержит дезоксири-бозу (в которой кислорода на один атом меньше). Основания представляют собой большие кольцевые молекулы с атомами азота; нуклеотиды ДНК имеют одно из четырех оснований: аденин, гуанин, ци-тозин и тимин (обозначаются A, G, С и Т; в РНК тимин заменяет урацил — U). Цитозин, тимин и урацил имеют по одному кольцу атомов и называются пиримидиновыми основаниями; аденин и гуанин имеют по два кольца и называются пуриновыми основаниями. Атомы углерода и азота в кольцах для удобства обозначают порядковыми номерами; атомы углерода сахара — от 1' до 5'.

 

Полинуклеотид (ДНК или РНК) образуется посредством связывания фосфата одного нуклеотида с сахаром другого именно так, что атом углерода 3' одного нуклеотида связывается через фосфатную группу с атомом углерода 5' следующего нуклеотида:

Поэтому каждая молекула ДНК имеет полярность 3'→5', подобно тому как белковая цепь имеет полярность от аминного конца до карбоксильного. Сами основания присоединены к одной стороне сахарофосфатного остова молекулы.

До 1952 года обычно предполагалось, что молекулы ДНК состоят из четырех видов нуклеотидов, чередующихся в регулярном порядке, поэтому казалось, что все молекулы более или менее одинаковы и не могут переносить информацию. Но когда Эрвин Чаргафф тщательно проанализировал состав ДНК различных организмов, обнаружилось, что нуклеотиды содержатся в них не в равной пропорции, а наблюдается следующее соотношение:

1)    общее количество пуринов (А + G) почти точно соответствует общему количеству пиримидинов (С + Т);

2)    количество А почти равно количеству Т, а количество G — количеству С (А = Т, G = С);

3)    отношение (А + Т) : (G + С) сильно варьируется у разных организмов.

В 1953 году Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик окончательно установили структуру ДНК. Уотсон был учеником Лурии, членом «фаговой группы» и прекрасно знал об экспериментах Херши—Чейз. Крик был физиком, разрабатывавшим мощный аналитический метод рентгеноструктурного анализа. С помощью рентгеновских лучей можно определить структуру молекул, даже если нельзя сфокусироваться на них, как фокусируются световые лучи в микроскопе. Посылаемые на материал рентгеновские лучи отклоняются на своем пути от атомов, и по изображению, оставленному ими на фотопленке, можно предполагать, как расположены атомы в кристалле. При помощи этой техники биофизики Морис Уилкинс и Розалинда Франклин из лондонского Королевского колледжа получили рентгенограммы, указывающие на то, что ДНК имеет спиралевидную структуру — нечто вроде штопора. Уотсон и Крик попытались построить модель ДНК при помощи атомных моделей нуклеотидов. Им это удалось, потому что они объединили данные Уил-кинса и Франклин с данными Чаргаффа и общей гипотезой о роли ДНК в наследственности. Уотсон рассказывает историю открытия в автобиографической книге «Двойная спираль». Чтобы получить более объективную информацию о ходе работ, эту книгу, пожалуй, лучше читать вместе с книгой Анны Сейр «Розалинда Франклин и ДНК».

Основная догадка Уотсона и Крика заключалась в том, что главная роль в структуре ДНК принадлежит основаниям, и надо как-то учитывать правило Чаргаффа: А = Т, G = С. Они предположили, что молекула ДНК состоит из двух полинуклеотид-ных цепей с противоположной полярностью, закрученных друг относительно друга по спирали (рис. 7.6). Между собой эти цепи удерживаются посредством оснований, соединенных попарно, при

Рис. 7.6. Форма двойной спирали ДНК, по Уотсону и Крику

чем аденин может соединяться только с тимином, а гуанин — только с цитозином:

Между основаниями существуют слабые водородные связи, в которых слегка отрицательно заряженные атомы О и N связаны между собой посредством водорода (имеющим небольшой положительный заряд). Основания, которые связываются друг с другом, называются комплементарными друг другу; это значит, что их форма соответствует друг другу, как рука соответствует перчатке или ключ — замку. Именно комплементарность оснований определяет механизм наследственности, а через него и все основные законы биологии. Модель Уотсона и Крика объясняла правило Чаргаффа, и благодаря ей стало возможным понять, каким образом ДНК переносит генетическую информацию. Короткая заметка Уотсона и Крика в журнале «Nature» за 1953 год скромно обещала некоторые перспективы в исследовании ДНК, но в действительности произвела грандиозную революцию в науке.

Модель ДНК и генетика

В отличие от работы Менделя, статья Уотсона и Крика сразу же привлекла внимание научного сообщества, поскольку она объясняла механизм наследственности. Сразу становилось понятно, что последовательность оснований ДНК может передавать информацию, то есть служить генетическим кодом. Информация обычно представляет собой последовательность, например последовательность букв и знаков препинания на письме или последовательность точек и тире в азбуке Морзе. Кроме того, генетический код должен как-то передаваться от одной копии ДНК другой в ходе деления клетки. Процесс получения двух копий (или реплик) изначальной молекулы ДНК называется репликацией, и модель Уотсона—Крика объясняет, как это возможно.

В каждой молекуле ДНК одному нуклеотиду соответствует комплементарный ему нуклеотид, и одна цепь ДНК целиком комплементарна другой. Репликацию выполняет сложный фермент ДНК-полимераза, которая начинает разрывать двойную спираль, словно застежку-молнию, оставляя по одному основанию на каждой цепи (рис. 7.7). Здесь мы приведем лишь крайне упрощенное описание процесса.

 

Рис. 7.7. При репликации ДНК комплекс ферментов разъединяет цепи двойной молекулы, и каждое открытое основание привлекает к себе комплементарный нуклеотид. Этот процесс продолжается, пока из двух цепей не вырастут две идентичные молекулы

В действительности все происходит гораздо сложнее, особенно если учитывать, что цепи ДНК могут расти только с 3'-конца. Суть процесса сводится к тому, что молекулы ДНК-полимеразы движутся вдоль каждой цепи и синтезируют комплементарные цепи, образуя таким образом двойную спираль вместо одинарной. Каждое свободное основание связывается исключительно с комплементарным нуклеотидом. Например, открытый цитозин привлекает к себе новый гуанин, а открытый аденин — тимин. В клетке содержится достаточно свободных нуклеотидов, потому что в процессе метаболизма они образуются постоянно, и полимераза связывает парные основания вместе. Так, каждая цепь определяет формирование комплементарной ей цепи с последовательностью, идентичной последовательности прежней парной цепи. В конечном счете получаются две спирали, идентичные начальной молекуле.

Нуклеотидная последовательность ДНК должна хранить генетическую информацию, и последнее предположение, вытекающее из модели Уотсона— Крика, состоит в том, что мутации происходят в тех случаях, когда одно основание заменяется на другое или когда цепь рвется и перестраивается. Такое случается редко, но если происходит, то в клетке имеются механизмы исправления некоторых ошибок. Тем не менее в каждом организме содержится огромное количество ДНК, и если вероятность вставки ошибочного основания равна только одной миллионной, то на каждые 10 миллионов оснований будет приходиться 10 ошибок, и мутация становится силой, с которой следует считаться. Природа мутаций более подробно описана в гл. 14.

Проверка модели

Настоящая научная ценность модели измеряется тем, что можно на практике проверить все выводы, к которым она приводит. Модель Уотсона— Крика не только вобрала в себя все известные факты о ДНК и наследственности, но и позволила высказать ряд новых предположений.

Рассмотрим репликацию ДНК с общей точки зрения. Каждая цепь остается нетронутой, но две цепи одной молекулы расходятся, и к каждой старой цепи пристраивается новая. Это называется полуконсервативной репликацией ДНК, потому что вся родительская ДНК целиком не сохраняется, но остается каждая из ее цепей. Предположим, что начальная молекула окрашена в красный цвет, а новые нуклеотиды — в зеленый. Тогда после репликации каждая дочерняя молекула будет наполовину красной и наполовину зеленой. Если они снова подвергнутся репликации, то из получившихся молекул две по-прежнему будут наполовину красными и наполовину зелеными, а две — полностью зелеными. Обозначим изначальную молекулу сплошными линиями, а новые — прерывистыми. Получается следующая схема:

В 1954 году Мэтью Меселсон и Франклин Сталь из «Калтека» придумали способ проверить эти выводы. В совместной работе с Джеромом Виноградом они открыли, что густой раствор хлорида цезия (CsCl) при центрифугировании на большой скорости образует градиент плотности. Инструмент, называемый ультрацентрифуга, может развивать скорость до 60 тыс. оборотов в минуту, то есть до 1000 оборотов в секунду. Судя по тем относительно медленным центрифугам, которые бывают в парках развлечений, можно представить, какая центробежная сила образуется в мощной центрифуге! Под воздействием этой силы довольно тяжелые ионы цезия начинают перемещаться ко дну центрифужной пробирки. После нескольких часов центрифугирования в растворе CsCl образуется непрерывный градиент плотности, то есть ближе к дну плотность увеличивается, а к поверхности уменьшается. В таком растворе молекулы ДНК останавливаются в том месте раствора, плотность которого равна их плотности.

Меселсон и Сталь выращивали бактерии в среде с содержанием тяжелых изотопов азота (¹⁵N в отличие от обычного ¹⁴N). Клетки включали этот азот в свои ДНК, то есть их ДНК становились плотнее обычных ДНК. Таким образом, эти ДНК становились мечеными («красными» в нашем примере). Потом исследователи переносили бактерии в среду с обычной концентрацией азота, и поэтому все новые ДНК, образовавшиеся после этого, имели обычную плотность (в нашем примере «зеленые»). Через различные интервалы времени исследователи подвергали пробы ДНК центрифугированию в растворе CsCl и определяли их плотность (в ультрацентрифуге были оптическая система и фотокамера). Сначала все ДНК были плотными. После первого деления они стали наполовину плотными. После второго деления половина ДНК была наполовину плотной и половина ДНК была легкой. Именно так и должна была вести себя ДНК согласно модели Уотсона—Крика.

Второй вывод заключался в том, что при репликации ДНК должна наблюдаться «развилка». Две цепи не могут разделяться сразу по всей длине; они разрываются с какого-то конца, и к разъединившимся участкам пристраиваются новые цепи. Молекулы ДНК можно разглядеть при помощи авторадиографии — метода, при котором регистрируют распределение радиоактивных изотопов в молекуле. При этом часто используют тритий (³Н), изотоп водорода, потому что его атомы при распаде испускают электроны с малой энергией, которые легко поглощаются многими веществами. Если такой электрон попадает на фотографическую пленку или гель, то на ней остается темное пятно, указывающее на местоположение атома трития. Изображение, полученное от распада многих атомов, называется авторадиографией, потому что радиоактивное вещество как бы само себя фотографирует.

Авторадиографии ДНК получают, выращивая некоторые клетки (такие как бактерии или быстро растущие корни растений) в среде, содержащей тимидин (один из нуклеотидов ДНК с пиримидиновым основанием — тимин), помеченный тритием. Тритий, таким образом, включается во все вновь образующиеся ДНК. Затем материал тонким равномерным слоем располагают на пленке (корне растений, к примеру), тщательно раздавливают и распределяют. После промывки и удаления тимидина пленку покрывают фотоэмульсией и оставляют в темном месте, иногда на несколько месяцев. При проявлении эмульсии на пленке возникают темные зерна серебра в тех местах, где распадались атомы трития. Так на фотографии можно опознавать меченые клетки и их части.

В ряде опытов в среде с тритием выращивали бактерии Е. coli и после осторожно выделяли из них молекулы ДНК, растворяли их в воде, заставляя распрямляться на поверхности, и медленно осаждали раствор на фильтровальной бумаге. Такая техника показала, что молекула представляет собой кольцо с длиной окружности более 1 мм, то есть в тысячу раз больше клетки, в которой она обычно упакована. Хромосомы, как правило, оказывались в процессе репликации, и на авторадиографиях видны две точки ветвления, там, где ДНК-полимера-зы движутся в противоположных направлениях. Так модель Уотсона—Крика была подтверждена экспериментальными наблюдениями, хотя практика преподнесла и свои неожиданности.

Единственная хромосома Е. coli составляет весь без исключения геном этого организма. Это относительно маленький геном, хотя в нем и содержится около 3,8х10⁶ нуклеотидных пар. Следует, кстати, упомянуть о том, что молекулярные генетики часто не слишком аккуратно подходят к измерению молекул ДНК. Собственно говоря, основная единица — это нуклеотидная пара (н.п.), но ее отождествляют с основанием (базой) и измеряют длину ДНК в базах или килобазах (kb), то есть в тысячах баз, или нуклеотидных пар.