содержание   ..  1  2  3  4  5  6  7  8  9    ..

Глава 5. Сигнальная трансдукция

5.1.  Онковирусы, онкогены и раковые супрессорные гены

     Многие типы рака возникают как результат множественных событий: активаций 

протоонкогенов (ПО) и инактиваций раковых супрессорных генов (РСГ). Так как нормальная 

клетка имеет множественные механизмы регуляции клеточного роста, необходимо несколько 

изменений для нарушения его контроля. Доказательством этого является обнаружение в 

раковых клетках генов с мутациями. На сегодняшний день найдены гены, мутация в которых 

строго вызывает предрасположенность к раку, то есть они предоставляют одно из 

необходимых событий канцерогенеза. Активация протоонкогенов с трансформационным 

потенциалом может не быть достаточной для появления рака, однако их изучение помогает 

понять природу этих событий. Редко образование раковой опухоли связано с активацией 

одного онкогена. Как правило, необходимо совместное действие нескольких генов. Так, 

например, среди трансгенных мышей несущих v-myc рак развивается лишь у 10% особей, 

среди трансгенных мышей несущих v-ras - у 40% особей, а у трансгенных мышей несущих оба 

активных гена – у всех особей. 

     Среди протоонкогенов довольно часто встречаются белки, регулирующие клеточную 

дифференцировку. Остановка дифференцировки ведет к продолжению пролиферации, что дает 

большие возможности для появления мутаций в онкогенах. Во многих случаях существует 

строгая корреляция между активацией онкогенов и ростом опухоли, но природа 

инициирующего события остается неизвестной. Можно надеяться, что изучение клеточных 

онкогенов поможет ее понять.

     Основное свойство высших эукариот – определенное время жизни организма. Это 

свойство поддерживается в индивидуальных соматических клетках, чей рост и деление 

строго регулируемый процесс. Исключение из этого правила составляет рак, который 

возникает при потере контроля роста.

     При перерождении нормальной клетки в раковую может проявляться 3 типа изменений:

        1. Увековечивание или иммортализация – свойство неопределенного роста без 

           изменений в фенотипе клетки, связанное с изменениями в контроле роста, 

           которые не описаны в терминах молекулярной биологии.

        2. Трансформация  – потеря контроля роста, например, трансформированная клетка 

           становится независимой от факторов, которые ей обычно необходимы. Причины, 

           которые вызывают трансформацию, довольно неплохо описаны молекулярными и 

           клеточными терминами.

        3. Метастазирование – поражение раковыми клетками нормальных тканей, появление 

           новых колоний раковых клеток в различных частях тела. Молекулярные события, 

           вовлеченные в метастазирование, такие как секреция протеаз, только сейчас 

           начинают описываться в терминах молекулярной биологии.

     Чтобы охарактеризовать абберантные события, которые приводят к потере контроля 

роста и возникновению опухоли, нужно сравнить характеристики роста нормальных и 

трансформированных клеток in vitro. Трансформированные клетки в культуре могут расти 

постоянно, тогда как для нормальной клетки это практически не возможно. В культуре 

клетки растут около 50 делений (число Хейфлика), затем наступает кризис, когда 

большинство клеток погибает. Выживают лишь иммортализованные клетки, то есть клетки, 

способные делиться неопределенно, но их свойства изменились в результате кризиса. 

Природа этого явления остается непонятной, в частности, природа молекулярных изменений, 

которые адаптируют клетку к росту в культуре. 

     Ограниченность времени жизни клеток кризисом ставит нас перед двумя направлениями 

для изучения нетрансформированных клеток.

       1. Первичные клетки, взятые сразу в культуру, которые имитируют жизнь in vivo до 

          кризиса.

       2. Клетки, которые прошли через кризис и достигли формирования клеточной 

          культуры (нераковые клетки). Их свойства изменены и будут изменяться во время 

          адаптации к культуре. Эти изменения могут частично напоминать образование 

          опухоли. 

     Сформировавшиеся последним образом клетки по определению становятся 

иммортализованными, но не раковыми. Такие линии остаются под клеточным контролем. Их 

свойства близки к первичной культуре, то есть:

   - им необходим носитель, с которым они соприкасаются

   - необходимо наличие факторов роста в среде

   - плотность расположения клеток контролируется межклеточными  

     контактами

   - клетки растут монослоем и разветвлены

     При росте клеток в культуре существует лишь приближение к условиям in vivo. Изучая 

факторы роста на таких линиях, нужно помнить, что в культурах есть изменения в 

комплементарности хромосом, то есть клетки, как правило, не диплоидные, а анеуплоидные. 

Трансформированные клетки растут в не столь строгой манере: им не нужен твердый 

носитель, вместо монослойного расположения они складываются в тонкую массу клеток, 

называемую фокусом. И, наконец, они способны индуцировать образование опухоли, когда 

вводятся животным. Не существует единого механизма, описывающего переход клетки от 

нормального фенотипа к злокачественному. К образованию опухоли может привести большое 

число изменений в клетке. Объединение процессов иммортализации и трансформации клеток в 

культуре может обеспечить парадигму образования опухоли in vivо. Можно надеяться, что 

при сравнении трансформированных клеток с нормальными удастся идентифицировать 

генетическую основу образования опухоли и найти понимание фенотипических изменений, 

происходящих при конверсии.

     Определенные события конвертируют нормальные клетки в трансформированные. Эти 

события могут запускаться факторами внешней среды (канцерогены) или генетическими 

изменениями. Возникновение рака у человека в зависимости от возраста предполагает 6-7 

молекулярных событий в течение 20-40 лет. Агентами, увеличивающими частоту конверсии 

нормальных клеток в трансформированные, являются канцерогены. В зависимости от стадии 

развития рака их делят на инициаторы и промоторы. К настоящему времени известно два 

класса генов, мутации в которых вызывают трансформацию: протоонкогены и раковые 

супрессорные гены. Впервые онкогены были обнаружены в вирусах, вызывающих рак. Позднее 

оказалось, что основная часть из них имеет клеточных двойников, которые выполняют 

обычные клеточные функции. Клеточные гены называются протоонкогенами и в определенных 

случаях мутации в них вызывают развитие опухоли. К настоящему времени идентифицировано 

более ста протоонкогенов. Они разделены на несколько групп, от генов, кодирующих 

трансмембранные белки, до генов, кодирующих факторы транскрипции. Онкогены могут 

изменять свои свойства следующим образом:

     1. Постоянной активацией их функции, которая в норме должна быть подавлена.

     2. Экспрессия гена в клетке, в которой он обычно не экспрессируется

     3. Переэкспрессия в обычной ткани, что может быть результатом мутации 

     Раковые супрессорные гены выявлены в форме делеций или других инактивирующих 

мутаций. Наиболее ярким доказательством их онкогенности являются некоторые 

разновидности рака, возникающие при потере обоих аллелей этих генов. Известно несколько 

десятков РСГ. Их функцией является сдерживание клеточного цикла и роста клеток.

5. 2. Вирусы, вызывающие рак

     Одной из причин, вызывающей трансформацию клеток, может быть вирусная инфекция. 

Существует множество раковых вирусов, содержащих как ДНК, так и РНК. Примеры 

трансформирующих вирусов и их свойства представлены в таблице 7:

     В зависимости от ответа на вирусную инфекцию клетки делятся на два класса:

      1. Пермиссионные (позволяющие) клетки продуктивно инфицируются, то есть в них 

         происходит полный жизненный цикл вируса, сопровождающийся репликацией вируса, 

         лизисом клетки и выходом наружу вирусных частиц.

      2. Непермиссионные клетки подавляют репликацию вируса. При этом может 

         происходить интеграция вирусного генома в клеточный, что может 

         сопровождаться трансформацией. 

    Трансформацию клеток онкогенными вирусами объединяет общий механизм. Рассмотрим их 

более подробно. 

     Вирус полиомы – малый ДНК-содержащий вирус, найденный у мышей. Его аналоги 

найдены у макаки резус (вирус SV40) и человека (вирусы BK и JC). В пермиссионных 

клетках естественных хозяев они не вызывают трансформации. Например, вирусы ВК и JC 

онкогенны для грызунов, но не человека. Геном вирусов разделен на две части – раннюю и 

позднюю в соответствии со временем ее активной экспрессии в жизненном цикле вируса. В 

ранней области закодированы два белка – большой и малый Т-антиген (Tumor), 

транскрибируемые с одного гена в результате альтернативного сплайсинга. В пермиссионных 

клетках они инициируют репликацию вирусной ДНК и стимулируют синтез ДНК и экспрессию 

генов хозяина, в том числе и контролирующих пролиферацию. В непермиссионных клетках, 

где репликация вируса подавлена, повышенная пролиферация может приводить к 

трансформации.

     Вирус папилломы – малый ДНК вирус, вызывающий эпителиальные опухоли. 

Известно  75 видов вируса HPV (Human Papilloma Virus), многие из которых связаны с 

доброкачественным ростом, например, возникновением бородавок. Некоторые же из этих 

вирусов вызывают рак. В частности, цервикальный рак может быть связан с экспрессией 

вирусных белков Е6 и Е7, иммортализующих клетку путем подавления активности Rb и р53 

соответственно.

     Аденовирус человека был изолирован из аденоидов. Сходные вирусы найдены у 

других млекопитающих. Это большая группа близкородственных вирусов, состоящая из более 

80 индивидуальных членов. Наиболее охарактеризованы аденовирусы человека, так как они 

вызывают простудные заболевания. Эти вирусы способны инфицировать большое число клеток. 

Клетки человека являются пермиссионным, и, следовательно, продуктивно инфицируются. Все 

аденовирусы способны трансформировать лишь непермиссионные клетки, к которым относятся 

клетки некоторых грызунов. Наиболее эффективно трансформирующее действие аденовируса 

проявляется на новорожденных грызунах. Трансформирующее действие аденовируса аналогично 

действию вируса полиомы и связано с подавлением действия Rb и р53 продуктами ранних 

генов Е1А и Е1В.

     Вирус Эпштейна-Барра (EBV) – один из представителей семейства вирусов 

герпеса, связанный со многими болезнями человека (мононуклеозис, назофарингальная 

карцинома, лимфома Беркита и другие лимфопролиферативные болезни). В-лимфоциты человека 

инфицируются этим вирусом  in vitro и становятся иммортализованными. Вирусную ДНК 

находят и в трансформированных клетках. Остается до конца неизвестным, какие гены EBV 

вызывают трансформацию. Идентифицирован белок BNLF-1, который, видимо, активирует 

определенные клеточные гены. 

     Ретровирусы кардинально отличаются от вирусов, упомянутых ранее, по их 

способности переносить генетическую информацию не только горизонтально, но и 

вертикально. Горизонтальный перенос – это нормальный процесс вирусной инфекции, при 

котором увеличивается число пораженных клеток у одного хозяина. Вертикальный перенос 

связан с интеграцией вируса в половые клетки в качестве эндогенного провируса. Он 

наследуется по законам Менделя. Жизненный цикл вируса осуществляется при помощи 

обратной транскрипции: РНК- оцДНК-дцДНК – интеграция в геном- инфекционная РНК. 

Интеграция в геном приводит к вертикальной трансмиссии провируса. Экспрессия провируса 

может генерировать ретровирусные частицы, которые передают генетическую информацию 

горизонтально.

     По способности вызывать рак опухолевые ретровирусы делятся на две большие группы: 

          1. Недефективные вирусы, которые имеют обычный для ретровирусов жизненный 

цикл. Они имеют длинный латентный период и часто связаны с возникновением лейкемий. 

Существует две классические модели: FeLV (Feline leukemia virus) и MMTV (mouse mammary 

tumor virus). Опухолеобразование не связано с определенными вирусными ПО, а со 

способностью вируса активировать клеточные ПО.

          2.   Быстро трансформирующие вирусы передают новую для клетки генетическую 

информацию в виде ПО. Если в вирусе не содержится онкоген, то вирус не представляет 

опасности. ПО становится оригинальным клеточным геном. Быстро трансформирующие вирусы 

быстро вызывают рак и могут трансформировать клетки in vitro. 

     Ретровирус захватывает клеточный ген путем обмена своей собственной 

последовательности на клеточную. Такая трансдукция вируса имеет два очень важных 

свойства:

          1.   Такой вирус, содержащий клеточный ген, обычно не может сам 

реплицироваться, так как вирусным генам для репродукции не нужен обмен с клеточным 

геном. Все такие вирусы дефектны, но они могут инфицировать с помощью «помощника» – 

вируса дикого типа, который обеспечивает функции, потерянные при рекомбинации.

          2. Во время инфекции трансдуцирующий вирус несет клеточные гены, которые 

получены им в результате рекомбинантных событий и их экспрессия может повреждать 

фенотип инфицированной клетки. Вирус, несущий информацию о росте клетки, имеет 

преимущество в будущем цикле инфекции. После захвата вирусом клеточного гена, в нем 

может случиться мутация и его влияние на фенотип клетки усилится.

     Конечно, трансфекция не является единственным механизмом влияния ретровируса на 

клетку хозяина. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1 или HIV-1) инфицирует и убивает Т -

лимфоциты, снижая таким образом активность иммунной системы и индуцируя СПИД. ВИЧ не 

трансформирует клетки, однако больные часто страдают некоторыми видами рака, в 

частности лимфомами и саркомой Капоши. В вирусах идентифицировано более 30 клеточных 

онкогенов. Обычно вирусы несут один онкоген. Вирусный онкоген обозначают как v-onc, а 

клеточный – c-onc. Существует две модели, объясняющие различие между вирусными и 

клеточными онкогенами. Количественная модель предполагает, что вирусные онкогены 

качественно не отличаются от клеточных, но их экспрессия повышена или ее не возможно 

выключить. Качественная модель предполагает, что клеточные онкогены действительно 

теряют онкогенные свойства, но могут быть конвертированы мутацией в онкоген. Каждый 

онкоген может вести себя в соответствии с какой-либо из этих двух моделей.

     Об онкогенном потенциале трансформирующих вирусов свидетельствуют следующие 

факторы:

         1. Мутации в вирусных онкогенах понижают их трансформационную активность

         2.   Обнаружены события, при которых клеточный онкоген становится онкогеным. 

Например, это происходит при изменении последовательности клеточного онкогена. Прямые 

доказательства того, что экспрессия вирусных онкогенов сопровождается трансформацией, 

получены на примере вируса саркомы Рауса. Чувствительные к температуре мутации в v-src 

при повышении температуры возвращали клетки от трансформированного фетотипа к 

нормальному, тогда как понижение температуры реверсировало трансформированный фенотип. 

Src – пример гена, свойства которого напоминают c-onc. V-src онкогенен при низких 

уровнях экспрессии белка, c-src – при высоких (более 10 от нормы). Некоторые ПО слабо 

онкогенны при повышении их экспрессии, но найденные изменения в v-onc или появляющиеся 

изменения в c-onc обладают более эффективной трансформирующей способностью (Например, 

ras и myc). В некоторых случаях v-onc образуются при потере последовательностей, 

кодирующих С-конец или N-конец (или оба), вероятно, в результате рекомбинантных 

процессов. Потеря этих областей может устранять регуляторный контроль над v-onc, 

который в норме лимитирует активность c-onc. Такие изменения в последовательности 

необходимы для src. V-src – онкоген при низкой концентрации, c-src – не онкоген даже 

при относительно высоком содержании белка (в десять раз больше нормы). Концепция, что 

ОГ активируются от ПОГ – важная парадигма для рака животных. У человека в большинство 

событий вирусные интермедиаты не вовлечены в процесс трансформации. 

5. 3. Протоонкогены и онкогены

     Можно исследовать c-onc в опухолях. Если есть специфический 

ген, то он должен трансформировать клетки. Часто в модельных 

экспериментах используется культура фибробластов мыши 3Т3. При их 

трансформации появляется фокус. Трансформирующая сила гена может 

характеризоваться эффективностью появления фокусов. 

Высокоэффективный ген – больше 100 фокусов/нг ДНК/106 клеток. 

Низкоэффективный – меньше 10 фокусов/нг ДНК/106 клеток. 

Трансформирующая ДНК изолируется лишь из опухолей. Рассмотрим 

некоторые примеры. В семейство c-ras входят три гена H-ras, K-ras, 

N-ras и один псевдоген. Они отличаются от вирусного гена по трем-

семи аминокислотам. У человека наиболее часты мутации в 12 и 61 

кодоне, причем в с-H-ras и с-K-ras генах в 12 позиции часто 

обнаруживается мутация. Это предполагает, что Ras белки имеют 

высокий потенциал конвертировать в опухолеродные формы через 

мутацию в одном или нескольких кодонах у крысы и у человека. 

Следует заметить, что нахождение этих мутаций в опухоли еще не 

доказательство их причастности к ее возникновению. Во многих 

случаях работает общий принцип – аминокислотная замена может 

конвертировать клеточный ПО в ОГ. Практически любая мутация в 12 и 

61 кодоне может конвертировать ras ПО в активный онкоген. Все три 

гена ras в 12-ой позиции имеют глицин. Если in vitro его

заменить на любую аминокислоту кроме пролина, то клеточная 

культура будет трансформироваться. В 61-ой позиции находится 

глютамин. Его замена приводит к аналогичному результату (кроме 

замены на пролин и глютамат). Некоторые c-ras имеют мутацию в 

интроне, в результате  скорость процессинга мРНК возрастает в 

десять раз. Есть раковые культуры с амплифицированным ras геном. 

Ras белки могут трансформировать клетки, но количественный эффект 

их действия до сих пор не описан. Не всегда трансформация связана 

со структурной частью онкогена. Есть примеры, связанные со 

вставкой ретровируса в клеточный геном рядом с c-myc геном. Ген c-

myc состоит из трех экзонов и длинного транслирующего участка. 

Элемент LTR вируса работает как промотор, и транскрипция гена c-

myc может многократно усилиться. В этом случае кодирующая 

последовательность c-myc не изменяется, а онкогенные свойства 

появляются из-за увеличения экспрессии и потери контроля над ней. 

Другим механизмом активации ПО является транслокация, 

сопровождающаяся повреждением ПО в точке разрыва. Подобное 

происходит при лимфоме Беркита – появлении недифференцированных В-

лимфоцитов. В этом случае чаще всего c-myc из хромосомы 8 

переносится в IgH локус хромосомы 14. Такая комбинация 

вызывает усиление экспрессии c-myc, так как клетка активно 

производит иммуноглобулины, что и приводит к задержке лимфоцитов в 

незрелом состоянии. У трансгенных мышей с c-myc геном, находящимся 

под контролем энхансера IgH, развивается лимфома. Трансгенные 

мыши, несущие c-myc под контролем LTR ретровируса, имеют опухоли и 

в других органах. Это предполагает, что при увеличении экспрессии 

c-myc трансформируется тот тип клеток, в которых этот эффект 

присутствует. То есть трансформирующая активность c-myc зависит от 

механизма его активации, а не от его внутренних свойств. 

     Нужно отметить, что транслокация не всегда приводит к тому, 

что поврежденный ген становится онкогенным. Транслокация может 

действовать как энхансер, активирующий другие гены по соседству.  

Найдено множество трансформаций в Т и В-лимфоцитах, в которых 

идентифицированы другие онкогены. В некоторых случаях транслокация 

генерирует гибридные гены, в которых активная единица транскрипции 

разрушается. В результате экзоны первого гена могут быть связаны с 

другими генами. В таких случаях существуют две потенциальные 

причины онкогенности: 

     1. Онкогенная часть белка может активироваться независимо от 

другой части. Переэкспрессия под новым управлением – это модель c-

myc.

     2. Другой партнер в гибридном гене может иметь усиливающий 

эффект, который вызывает выход из функции в части белка, 

кодируемого ПО.

     Примером такой транслокации может служить Филадельфийская 

хромосома, которую находят при хронической миелогенной лейкемии 

(CML). Это транслокация 5000 kb области от конца хромосомы 9, 

несущей c-abl, на область bcr (break-point claster region) 

хромосомы 22. Последний обнаруживается при другой болезни – острой 

лимфобластной лейкемии (ALL), когда в транслокацию вовлечен ген 

bcr. При CML образуется смешанный белок массой 210 кДа, из них 

часть bcr составляет 70 кДа. При ALL, соответственно, 185кДа и 

45кДа. Остальную часть этих белков составляет c-abl с потеряной N-

концевой частью. Часть белка bcr, закодированная в первом экзоне, 

обладает серин/треонин киназной активностью. Белок фосфорилирует 

сам себя, и фосфорилированная часть обладает способностью 

взаимодействовать с SH2 доменом c-abl. Возможно, происходит 

изменение конформации abl и активация его онкогенного потенциала. 

Изменения в N-концевой области вызывают онкогенность v-abl, 

трансформирующей версии гена, найденной в ретровирусах. С-abl 

кодирует тирозин киназу, активность которой необходима для 

трансформирующего потенциала в онкогенных вариантах. Делеция или 

замена N-конца усиливает как киназную активность, так и 

трансформирующие способности. Таким образом, N-концевой домен 

регулирует киназную активность, а его потеря вызывает ее 

активацию. 

     Приведем примеры других протоонкогенов, экспрессия которых 

увеличивается при трансформации. Белок v-rel идентифицирован как 

трансформирующий фактор вируса птичьего (индюк) 

ретикулоэндотелиоза. Он высоко онкогенен для цыплят и вызывает В-

клеточную лимфому. V-rel является укороченной версией c-rel, 

потерявшей 100 аминокислотных остатков на С-конце и имеет малое 

число точечных мутаций в оставшейся последовательности. Семейство 

генов rel регулирует транскрипцию при созревании лимфоцитов. NF-

kB – фактор транскрипции, представляющий собой димер субъединиц 

р65 и р50. Его регуляция осуществляется I-kB. Когда I-kB 

фосфорилируется, происходит освобождение NF-kB, который идет в 

ядро и активирует гены, в промоторе или энхансере которых имеется 

kB мотив. 

5. 4. Основные пути сигнальной трансдукции.

     К настоящему времени известно три основных сигнальных каскада. Первый каскад 

стимулируется митогенами и факторами роста : Ras-Raf-MEK-ERK.

     Второй и третий каскад стимулируются цитокинами, гормонами и различными факторами 

стресса - белками из Rho семейства (Rho, Rac, CDC42). Как их различить? МАР киназный 

компонент, который фосфорилируется уникальными киназами по тирозину и треонину в одном 

трех мотивов Thr-Glu-Thr, Thr-Phe-Tyr или Thr-Glu-Tyr, что зависит от трех путей. Для 

активации одного из этих путей инициирующий стимул может также мобилизовать другие 

сигнальные молекулы: изоформы протеин киназы C, киназы фосфолипидов, альфа- и бетта- 

субъединицы G-белков, фосфолипазы, внутриклеточный Са2+.

               Сигнал завершается двумя путями:

   1.         Фосфорилирование ниже стоящих молекул верх стоящими киназами.

   2.         Компоненты возвращаются в дефосфорилированное состояние.

        Все три пути могут пересекаться.

5.4.1. Факторы роста и их рецепторы

     Эпидермальный фактор роста (EGF) и тромбоцитарный фоктор роста (PDGF ) 

представляют собой небольшие полипептиды, стимулирующие рост особого типа клеток. Они 

вызывают множество эффектов, в том числе инициируют или стимулируют клеточный цикл. 

Рецепторы этих лигандов имеют общее строение - большой экстраклеточный домен и 

цитоплазматический домен. Рецепторы EGF и PDGF состоят из одной полипептидной цепи. 

Рецептор инсулина - димер. Эти рецепторы являются протеин киназами. 

     Поиск специфических молекул-мишеней для токсических соединений в конечном счете 

свел все к изучению рецепторов. Обычно рецептор - это протеин, связывающий лиганд, в 

результате чего меняется его функция вместе с сигнальной трансдукцией. Важная 

особенность рецептора - высокая специфичность естественного лиганда. Это особенно важно 

для ответа рецептора на нужный лиганд и никакой другой. Это помогает связать две клетки 

в разных частях организма. Было показано, что даже нонамолярная концентрация гормона 

оказывает нужное влияние на клетку- мишень. Еще одно важное свойство - обратимость 

связи рецептора и лиганда. 

     В животной клетке присутствует три основные категории рецепторов. Рецептор 

функционирует как одна из частей сигнального механизма. Первая группа рецепторов 

находится на поверхности клетки и связывается с крупными лигандами, которые не могут 

проникнуть в клетку (полипептидные гормоны). Второй вид рецепторов - стероидные, 

которые являются факторами транскрипции, чья способность влиять на экспрессию генов 

изменяется после связи с лигандом. Третья категория рецепторов состоит из ионных 

каналов. Они находятся на поверхности клетки, что позволяет ионам двигаться по 

градиенту концентрации, после того как рецептор свяжется с лигандом. Например, хорошо 

изученный G-белок стимулирует аденилат-циклазу, которая превращает АТР в АМР. Другой G-

белок ингибирует аденилат- циклазу. Этот процесс очень важен, так как АМР влияет на 

многие функции клеток. Многие токсичные агенты повреждают рецепторы, так, например, 

доказано, что токсин холеры связывается со стимулирующим G-белком и необратимо 

активизирует его. Это приводит к неспособности всасывать воду эпителием кишечника, что, 

в конечном итоге, приводит к смерти от обезвоживания.

5.4.2. Механизм действия ras белка

     Ras принадлежит к большому семейству малых GTP-связывающих белков и регулирует 

клеточный рост и дифференцировку. В активном состоянии Ras связан с молекулой GTP, а в 

неактивном - с GDP. Обмен GDP на GTP стимулируется белковым фактором обмена гуанин 

нуклеотида (GEF, guanine nucleotide exchange factor). Гидролиз связанного с ras GTP до 

GDP осуществляется GTPаза активирующим белком (GAP, GTPase activating protein). Кроме 

того, белковый ингибитор диссоциации гуанин нуклеотида (GDI, guanine nucleotide 

dissociation inhibitor) способен поддерживать Ras в неактивном состоянии, ингибируя 

обмен гуанин нуклеотидов. 

     Активация Ras опосредуется рецепторной тирозин киназой. После связывания ее 

рецепторной экстраклеточной части тирозин киназы с фактором роста и ее димеризации 

происходит взаимное фосфорилирование ее внутриклеточных доменов. Фосфорилирование 

создает благоприятную конформацию киназы для связывания с цитозольным белком Grb2 

содержащим SH2 домен. Посредством этого домена Grb2 связан с GEF. Таким образом, GEF 

оказывается у внутренней поверхности клеточной мембраны, с которой связан Ras 

посредством гидрофобного остатка фарнезила. Происходит образование активного комплекса 

ras-GTP. Этот комплекс взаимодействует с серин/треонин киназой raf. Интересно, что Ras-

GTP не повышает каталитическую активность raf, а просто привлекает ее из цитозоля к 

мембране, где она фосфорилирует другие связанные с мембраной белки. Эти события 

вызывают активацию ERK.

     При процессинге белка ras происходит его фарназилирование по аминокислотному 

остатку Cys-186, отщепление следующей после Cys-186 C-концевой части. Cys-186 

становится C-концевым остатком ras и метилируется. Обратимое пальмитилирование других 

остатков цистеина ближе к С-концу ras повышает его сродство к мембране. Наиболее 

частыми онкогенными мутациями ras являются мутации в 12 и 61 кодонах. Мутация в 12 

кодоне затрагивает GTP-связывающий сайт. 61 кодон входит в состав L4 домена, который 

изменяет свою конформациюпри гидролизе GTP.

     Белок ras фосфорилирует Raf белок, который в свою очередь активирует МЕК. 

Последний обладает двоякой специфичностью - фосфорилирует треонин и тирозин. Его 

мишень - ERK МАР киназа. Оба типа необходимы для активации МАР киназ. 

5.4.3. МАР киназы

     Митоген активированные белки или МАР киназы играют важную роль в клеточных 

ответах, включая пролиферацию, генную экспрессию, ответ на гипертермию, УФ-излучение, 

повышение осмомолярности и т.д. МАР киназы являются серин/треонин киназами. 

Классические МАР киназы проходят в ядро где фосфорилируют свои мишени - факторы 

транскрипции. Альтернативеым путем является фосфорилирование цитоплазматических 

факторов. У дрожжей имеется четыре МАР киназных пути, которые функционально не зависят 

и регулируются разными каскадами киназ. Каждый из них регулируется уникальной киназой 

МАР киназы (МКК или МЕК). Кроме того, существуют и киназы киназы МАР киназы МЕКК. 

     МАР киназы разделены на три подсемейства:

     1. Внеклеточные сигнал регулируемые киназы ERK - осуществляют передачу сигнала 

внутрь клетки.

     2. Стресс-активируемые протеин киназы или c-Jun NH2 терминальные киназы SAPK/JNK.

     3.   р38 киназа -  играет критическую роль в воспалительном ответе.

     МАР киназы активируют работу многих генов, включая клеточный рост и 

дифференцировку. ERKs фосфорилируют и регулируют активность определенных ферментов, 

включая фосфолипазу A2 и р90 и ядерных факторов р62FCF и Elk-1, контролирующего 

несколько генов, включая c-fos. Белки JNKs фосфорилируют аминотерминальный 

трансактивированный домен c-Jun и ATF2. Они активируются различными стимулами, 

отличными от ERKs сигналов: тепловой шок, повышение осмомолярности, УФ-излучение. JNKs 

также могут активироваться агентами, взаимодействующими с рецепторами на клеточной 

поверхности: ФНОа, интерлейкин-1 или EGF. Более того, существуют доказательства того, 

что в то время как Ras контролирует активацию ERKs, члены Rho семейства (небольшие GTP-

связывающие белки) - Rac1 и Cdc42 регулируют активность JNKs.

     Свойством Ras/MAPK пути является то, что они активируются под действием различных 

сигналов, но результат может быть различным. Когда клетки РС12 обрабатывали NGF 

(фактором роста нервов), то они дифференцировались, становились нейроноподобными и 

останавливали деление. После обработки EGF они получали сигнал для продолжения 

пролиферации. В обоих случаях в сигнальную трансдукцию вовлечены ERK MAPK. Различия, 

которые наблюдались в результате, можно объяснить еще не открытыми сигнальными путями. 

Однако основным различием является то, что NGF вызывает пролонгированное повышение Ras-

GTP, тогда как EGF стимулирует только транзитный эффект. Но все же главная роль 

принадлежит ERK-MAPK мутации, при которой конститутивно активированные MEK вызывают 

дифференцировку клеток РС12.

     В последние годы был достигнут значительный прогресс в исследовании сигнальной 

трансдукции при развитии, где объектом исследования служили нематоды С.elegans и 

дрозофила. Для анализа формирования вульвы C.elegans и фоторецепторных клеток глаз 

дрозофилы была использована комбинация биохимических и генетических методов. Эти 

системы были изучены так подробно, что считалось, что больше в них нельзя обнаружить 

ничего нового. Но в 1995 была открыта система KSR-1. Потеря функции Ras или другого 

компонента вызывает потерю вульвы при формировании гермафродитных червей, тогда как 

увеличение функции приводит к формированию избыточных вульв (мультивульварный фенотип). 

Этот Ras путь не единственный, но малейшие его нарушения меняют развитие вульвы. Найден 

новый белок - супрессор KSR-1, который действует параллельно или ниже. KSR (киназный 

супрессор Ras) - новая протеин киназа, необходимая для Ras сигнальной трансдукции. У 

дрозофилы обнаружено два гена, чьи продукты необходимы для активации Ras в сигнал с 

нормальной эффективностью. Первый кодирует бетта-субъединицу геранил- трансферазы типа 

I в плазматической мембране. Деффект в этом гене блокирует Ras-изопренизацию. Второй 

ген кодирует протеинкиназу, которую назвали киназный супрессор Ras (KSR). Она 

функционирует во многих рецепторных тирозин киназных путях. KSR был обнаружен и у 

млекопитающих. 

     Основные пути сигнальной трансдукции у разных организмов представлены в табл. 8

     На их регуляцию могут влиять непосредственно вирусные онкогены, такие как v-rel. 

Его продукт идентифицирован как высоко онкогенный белок, вызывающий ретикулоэндотелиоз 

у индюков.р50 и c-rel имеют 60% гомологии.

     NF-kB - один из плейотропных факторов транскрипции - генеральный вторичный 

мессенджер. Его активируют многие стимулы. Как же действует v-rel? По одной из гипотез 

v-rel формирует димер с клеточным аналогом c-rel. Этот димер неактивен, что 

предотвращает NF-kB или другие ФТ от функционирования. V-rel - исключительно ядерный 

белок, так как он потерял участок, необходимый для его транспорта в цитоплазму.

    AP1 отвечает на промоторы ТРА. АР1-связывающий сайт индуцируется ТРА в гене-мишени. 

Канонический AP1 - димер c-Jun и c-Fos. Мутации в них понижают ДНК связывающую 

активность и понижают онкогенный потенциал.

5.5. Оксидативный стресс

     Генерация кислородных радикалов (ROS) изучена слабо за исключением некоторых 

специализированных клеток. В фагоцитах под действием различных факторов активируется 

НАДФН-оксидазный комплекс, состоящий из четырех белков. Этот комплекс ответственен за 

перенос электронов с НАДФН на O2 c последующей генерацией супероксиданиона О2-, который 

спонтанно или ферментативно дисмутирует в Н2О2. В нейтрофилах активность НАДФН-

оксидазного комплекса регулируется G-белком (GTP связывающим белком) Rac2, а в 

макрофагах - Rac1. Таким образом, Rac белки регулируют уровень активных форм кислорода 

(ROS) в клетке. Генерация ROS играет существенную роль в стимуляции факторов роста и 

цитокинов. Перекись водорода может участвовать в сигнальной трансдукции. Она активирует 

МАРК и c-Jun- стресс-активируемую протеин киназу (JNK/SAPK), а МАРК регулируется Ras 

белками. Rac1 регулирует JNK/SAPK.

      Принято считать, что эффекты ROS осуществляются посредством ковалентной 

модификации сульфгидрильных остатков критических белков. Если это так, то спектр их 

регуляторной деятельности широк: от активации тирозиновых фосфатаз до ФТ.

     Существует два пути действия ROS:

   1.         Модификация функции белка через фосфорилирование тирозиновых остатков

   2.         Модификация функции белка окислительно-восстановительными реакциями цистеиновых 

        остатков

5.6. Теломераза

      Теломераза представляет собой рибонуклеопротеин, который синтезирует GC-богатые 

теломерные повторы (TTAGGC) на концах хромосом. Она компенсирует постепенное укорочение 

5'концов линейной молекулы ДНК при репликации. Укорочение происходит из-за того, что 

РНК-затравку на 5' конце невозможно заменить на ДНК, так как ДНКполимераза обладает 

лишь 5'>3' полимеразной активностью. Таким образом, теломераза вносит вклад в 

стабильность хромосом. Было предположено, что укорочение теломер может лежать в основе 

работы митотических часов, которые регулируют лимит нормальных клеточных делений и 

старение. Реактивация теломеразы может быть критической для пролиферации опухоли, 

позволяющая клеткам избежать старения.

     Современная модель клеточного старения предполагает, что теломеры соматических 

клеток укорачиваются до тех пор, пока они достигнут стадии М1, в которой длина теломеры 

препятствует дальнейшему клеточному делению, а теломераза больше не активна. 

Митотическое старение во многих клетках опосредована р53 и Rb генами. Когда пройден М1 

барьер, дальнейшая пролиферация приводит к укорочению хромосом, что в конце концов 

приводит к хромосомной нестабильности, р53-зависимой остановке клеточного цикла и 

клеточной смерти (М2).

5.7. Раковые супрессорные гены.

     Эти гены обычно доминантны по отношению к ПО. Мутация, которая инактивирует один 

аллель, может привести к трансформации. Опухоли могут образовываться по другому 

механизму: потери двух аллелей в локусе онкогенности. Мутации могут наследоваться через 

половые клетки, либо быть результатом соматических изменений. Развитие рака происходит 

из-за потери функции РСГ. Наиболее охарактеризованными РСГ являются р53 и Rb. 

5.7.1. RB белок

     Ретинабластома - рак сетчатки, встречающийся у детей. Он передается по наследству, 

либо возникает спорадически. Заболевание связано с инактивацией обеих копий гена Rb и, 

как следствие, с отсутствием в клетке белкового продукта. Инактивация происходит в 

результате делеции локуса q14 тринадцатой хромосомы, несущего данный ген. Признак 

является рецессивным и проявляется в потомстве, если оба родителя несут хотя бы по 

одной инактивированной копии гена. Ненаследственная форма ретинобластомы крайне редка, 

так как для ее возникновения необходимо произойти мутациям в обеих копиях гена Rb. 

Кроме ретинобластомы инактивация Rb вызывает многие опухоли легких, мочевого пузыря и 

молочной железы. Как уже упоминалось выше, инактивация Rb на белковом уровне может 

осуществляться продуктами генов раковых вирусов, таких как SV40, аденовирус и вирус 

папилломы.

Rb является фосфопротеином, играющим важную роль в регуляции перехода клетки из G1 в S 

фазу (Рис. 31 ). 

Рис. 31.  Белок RB в регуляции клеточного деления

Центральную роль в этом переходе играет E2F, фактор транскрипции некоторых генов, 

необходимых для синтеза ДНК в S фазе. Он так же стимулирует транскрипцию генов циклина 

А, циклина Е и своего собственного гена. Белок pRb ингибирует E2F, связываясь с 

последним в G1 фазе. Факторы роста стимулируют транскрипцию циклина D. Происходит 

накопление комплексов циклин D - Cdk4, которые начинают фосфорилировать Rb, что 

приводит к его диссоциации от E2F. Высвободившийся E2F стимулирует транскрипцию своего 

гена и гена циклина Е. Образующийся вследствие этого комплекс CDK2-цЕ, еще активнее 

фосфорилирует pRb. Таким образом, сеть эффектов через петлю положительной обратной 

связи приводит к быстрому возрастанию E2F зависимой транскрипции и переходу клетки в 

начало S фазы. В конце митоза рRb дефосфорилируется. Переэкспрессия Rb препятствует 

клеточному росту. Это продемонстрировано на примере клеточной линии остеосаркомы, 

которая потеряла этот ген. При внесении гена Rb в культуру ее рост прекращается. Были 

обнаружены сходные с Rb белки, способные взаимодействовать с другими представителями 

семейства факторов транскрипции E2F.

5.7.2.Белок р53

Р53 - раковый супрессорный ген. Он получил свое название по молекулярной массе 

белкового продукта. Ген наследуется как аутосомная доминанта при синдроме Ли-Фраумени - 

редкой форме наследственного рака. У больных этим синдромом развивается рак различных 

органов, что связано с мутациями в гене р53. Изучение этих мутаций открыло новые 

свойства р53 и объяснило его связь с возникновением рака.

P53 - ядерный фосфопротеин, который открыли в SV40 трансформированных клетках, в 

которых он связан с Т-антигеном. Повышенная экспрессия р53 была обнаружена во многих 

раковых клеточных линиях. В ранних экспериментах вставка клонированного р53 была 

найдена в иммортализованных клетках, в связи с чем его назвали онкогеном с обычной 

доминантной функцией. Но все трансформирующие формы р53 выключались в мутантных формах 

белка. И тогда они попали в категорию доминантных негативных мутантов, которые 

функционируют через подавление функции в диком типе. Наиболее общее формой доминантного 

негативного мутанта является та, которая формирует гетеродимерный белок, объединяющий 

субъединицу мутировавшего и дикого типа, в котором субъединица дикого типа не 

функционирует. Вероятно, р53 существует как тетрамер.

Трансформированный фенотип образуется либо делецией обоих аллелей или точечной мутацией 

в одном из аллелей, которая продуцирует доминантный негативный фенотип . Обе ситуации 

найдены в раковых опухолях человека. Мутации р53 накапливаются во многих во многих 

типах рака человека, вероятно из за того, что потеря р53 стимулирует рост клетки, а для 

остановки роста нужен дикий тип р53. Многообразие видов рака дает основания 

предполагать, что р53 не тканеспецифичен, то есть он вовлечен в общий контроль 

пролиферации и потеря этого контроля может быть вторичным событием, которое стимулирует 

рост многих опухолей. Такая интерпретация предполагает, что нормальные клетки растут в 

сдержанной манере, которая обычно ингибируется р53. 

Какова функция р53 на молекулярном уровне? 

р53 был открыт как белок, связывающийся с большим Т-антигеном вируса SV40. В отличие от 

дикого типа, мутантные формы белка не способны связывать Т- антиген. Связывание дикого 

типа р53 с Т-антигеном коррелирует с его способностью стимулировать репликацию вируса. 

Одна возможность - р53 дикого типа связывается с клеточными аналогами Т-антигена, при 

этом ингибируется  активность последнего. У мутантных форм такая способность теряется. 

Белок р53 является ДНК связывающим белком, узнающим специфичный мотив из 10 п.о. в 

активном промоторе, который содержит этот мотив. Для некотоых генов р53 может быть 

супрессором. р53 также регулирует экспрессию генов, контролирующих клеточный цикл. Этот 

белок связывается с последовательностью ДНК PuPuPuC(A/T)(T/A)GpyPyPy, которая 

содержится в некоторых промоторах. 

Сам белок р53, состоящий из 392 аминокислот, состоит из шести доменов:

 1.N-концевой домен (1-50 амк.) вовлечен в транскрипционную активацию генов-мишеней 

(р21- ингибитор Cdk и другие гены, участвующие в остановке клеточного цикла, GADD45, 14-

3-3-d, Bax). Он же ответственен за взаимодействие с Mdm2 - ингибитором р53. В этом 

участке находятся 7 остатков серина и треонина, являющиеся мишенями для киназ.

 2.Дополнительный транскрипционный домен (43-73 амк.) для активации генов-мишеней.

 3. Гибкий пролин-богатый домен (73-97амк.), в котором выявлены элементы РххР, важен 

для полного проявления супрессорной активности. Участвует в запуске апоптоза. Мишени - 

TBP, TFIID, SpII, HIF-1, STAT-5, Bcl-2, MDR-1, рецептор тироидного гормона.

 4. Центральный домен (100-300 амк.), который узнает специфические последовательности 

ДНК. Именно в этом районе обнаружено большинство мутаций в раковых опухолях.

 5. Участок, отвечающий за ядерную локализацию р53 (305-323амк.).

альфа-спираль - участок, отвечающий за тетрамеризацию (323-356амк.).

 6. Основный домен (363-392амк.) является мишенью для модифицирующих ферментов (киназ, 

ацетилаз, гликозилаз). В немодифицированной форме он препятствует образованию комплекса 

с ДНК. Кроме того, С-конец может может неспецифически связываться с одноцепочечной ДНК, 

непарными основаниями и концама ДНК, что указывает на его участие в узнавании 

повреждений ДНК и запуске репарации.

Р53 называют "стражем генома". Он активируется в ответ на различные виды стресса и 

останавливает пролиферацию, а вслучае более серьезных повреждений запускает программу 

апоптоза - гибели клетки. Около 50% опухолей человека имеют дефектный р53. Большинство 

мутаций р53 возникает в позициях, где аминокислоты высококонсервативны. Это 

предполагает, что эти мутации связаны с консервативными функциями. Охарактеризованные 

мутации р53 вызывают эффекты, связанные с изменениями свойств белка, включая его время 

полужизни от 20 минут до нескольких часов, изменения его конформации, изменения его 

клеточной локализации от ядерной к цитоплазматической, изменения способности 

связываться с ДНК или Т-антигеном. Такая плейотропность делает затруднительным 

определить, какой из них связан с супрессией рака.  

 Кроме Rb и р53 существует множество других генов супрессоров опухолей. В частности, к 

ним относятся р21, p16 и р27 - ингибиторы Cdk, которые будут рассмотренные в следующей 

главе, WT1 - супрессор транскрипции некоторых факторов роста и онкогенов bcl-2 и c-myc, 

NF1 - подавляет активность ras за счет активации ГТФаз. 

содержание   ..  1  2  3  4  5  6  7  8  9    ..