Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция

пассивных

механизмов,

например,

форсирование

образования

физических  и  химических  барьеров  на  пути  патогена) [Андреев,
Талиева, 1991]. Активные механизмы устойчивости чаще всего связаны
с  изменениями  в  спектре  экспрессируемых  генов,  кодирующих  белки,
обеспечивающие  защиту  от патогенов [Dixon, Palva, 1995; Тарчевский,
2000].  Период  активации  защитных  механизмов  в  растениях  при
воздействии  биотического  стресса  представляется  наиболее  важным  в
связи  с  проблемой  повышения  устойчивости,  поэтому  целесообразно
остановиться на нем более подробно.

Инфицирование возбудителями разных болезней является

распространенным  стрессовым  воздействием,  вызывающим  обычно
каскад  метаболических  изменений,  которые  можно  суммировать  как
мультикомпонентные  ответы.  Они  включают  накопление  полисахаров,
фенолов, лигнина, суберина, фитоалексинов и фитонцидов и ферментов,
участвующих  в  их  синтезе,  гидроксипролинбогатых  белков,  индукцию
синтеза  и  увеличения  уровня  так  называемых «pathogenesis-related»
(PR)-белков,  в  частности,  хитиназ,  глюканаз,  ингибиторов  протеиназ,
других  стрессовых  белков,  например,  пероксидаз  и  т.д. [Чигрин, 1986;
Cавич, 1989; Kiraly et al.,1991; Kolattukudy et al., 1995; Дьяков, 1994;
Dixon, Palva, 1995; Hammond-Kosack, Gones, 1996; Mauch-Mani,
Metraux, 1998; Ryan, 2000].

Довольно сложно бывает оценить долю вклада тех или иных

механизмов  в  защите  растений,  понять  их  сущность,  вычленяя  для
изучения  изменение  скорости  какого-либо  процесса  или  содержания
конкретного соединения, поскольку тот или иной исход взаимодействия
«партнеров»,  относящихся  к  различным  таксонам,  базируется  на
сложном  и  динамичном  взаимодействии  многих  факторов  как  со
стороны растения-хозяина, так и патогена [Чигрин, 1986; Дьяков, 1994;
Knogge, 1996]. Поэтому неудивительно, что один признак недостаточен,
чтобы  судить  об  уровне  устойчивости  растений  к  патогену,  который
достигается

совокупным

или

последовательным

включением

нескольких механизмов, часто разных в зависимости от природы
фитопатогена и растения-хозяина [Чкаников, 1996].

Тем не менее следует специально отметить, что изменение

интенсивности  синтеза  и  уровня  большинства  перечисленных
компонентов  целой  системы  ответов  скорее  всего  можно  отнести  к
неспецифическим  реакциям,  поскольку  они  индуцируются  патогенами
разной  природы  (грибы,  бактерии,  вирусы  и  т.д.)  и  не  только
патогенами,  но  часто  и  поранением  (правда,  поранение,  как  правило,
является

необходимым

условием

проникновения

патогенов),

элиситорами,

химическими

агентами,

температурным

шоком,

эндогенными регуляторами роста, что и обсуждается в большинстве
процитированных

выше

работ.

Следовательно,

рассматривая

механизмы  активных  защитных  реакций  растений,  вовлекающихся  в
формирование  устойчивости  к  заражению,  скорее  всего,  можно
говорить  о  развитии  устойчивости  к  фитопатогенам  как  к  частному
случаю из разнообразных стрессовых факторов [Dixon, Palva, 1995].

Центральным звеном в регуляции формирования ответных

реакций  растительных  организмов  на  инфицирование,  вероятно,
является  гормональная  система,  причем  в  этом  случае  имеет  место
сложная  картина  активного  взаимовлияния  гормональных  систем  двух
партнеров,  определяющего  характер  развития  защитных  механизмов
растений  к  фитопатогенам  и  развития  механизмов  фитопатогенов  для
обеспечения их успешного паразитирования. Об этом свидетельствуют,
с  одной  стороны,  исследования  по  анализу  баланса  эндогенных
гормонов  больного  растения  и  влиянию  экзогенных  фитогормонов  на
различные процессы метаболизма растительных клеток, вовлекающихся
в  защиту  от  патогенов,  работы  по  оценке  способности  грибных
патогенов  синтезировать  вещества  фитогормональной  природы  и
динамики  их  содержания  в  процессе  жизненного  цикла,  с  другой
стороны [Чигрин, 1986; Чкаников и др., 1990; Bosqet et al., 1990; Hughes,
Dickerson, 1990; Poupet et

al., 1990; Li, Heath, 1990; Талиева,

Филимонова, 1992; Проценко и др., 1993; Волынец и др., 1993а,б;
Андреев, Талиева, 1996; Максимов и др., 1996, 2000].

Вопросы, касающиеся значения изменений гормонального статуса

больного растения при инфицировании грибными патогенами,
различающимися по типу питания, будут специально рассмотрены в
главе 4.

Чаще всего активация механизмов устойчивости связана с

индукцией или усилением экспрессии генов белков, задействованных в
системе  ответа  растений  на  патоген  [Дьяков, 1994; Dixon, Palva, 1995;
Hammond-Kosack, Gones, 1996; Bent, 1996; Тарчевский, 2000]. Одной из
наиболее  изученных  систем  защиты  растений  является  синтез  и
накопление  фитоалексинов,  образующихся  в  ответ  на  заражение
фитопатогенами,  механическое  поранение  и  действие  элиситоров
[Горбачева и др., 1991; Ильинская и др., 1991; Hammond-Kosack, Gones,
1996;

Озерецковская, 1999]. Это

производные

метаболизма

фенилпропаноидов [Collinge, Slusarenko, 1987; Dixon, Palva, 1995]. К
этой  группе  соединений  относятся  сесквитерпеноиды,  изофлавоноиды,
дигидрофенантрены  и  др.  Вероятно,  основным  механизмом  контроля
синтеза  и  содержания  фитоалексинов  является  регуляция  их  биогенеза
за счет индукции или подавления активности ферментов, участвующих

в  нем,  например  фенилаланинаммонийлиазы  (ФАЛ) [Collinge,
Slusarenko, 1987; Hammond-Kosack, Gones, 1996]. Фитоалекcины
ингибируют  рост  грибных  клеток,  возможно,  за  счет  нарушения
целостности  их  цитоплазматических  мембран [Mauch-Mani, Slusarenko,
1996].

Инфицирование, обработка этиленом и элиситорами также

вызывают

усиление

активности

ферментов,

участвующих

модификации  клеточных  стенок  растений – ФАЛ,  пероксидаз,
полифенол-оксидаз.  Они  участвуют  в  образовании  фенолов  и
полифенолов, которые, связываясь со структурными белками клеточных
стенок растений, укрепляют их [Горбачева и др., 1991]. Важная роль в
укреплении  барьерных  свойств  клеточных  стенок  принадлежит
ассоциированным  с  растительными  клеточными  стенками  анионным
пероксидазам,  которые  задействованы  в  синтезе  лигнина  и  суберина
[Kolattukudy et al., 1995; Хайруллин и др., 2000].

До 10 % клеточно-стеночных структурных белков приходится на

долю  оксипролинбогатых  белков,  из  которых  наиболее  изучен
картофельный  белок  экстенсин,  относящийся  к  классу  β-лектинов,
[Showalter, 1993], уровень  которого  существенно  повышается  при
инфицировании [Mazau, Esquerre-Tugaye, 1986]. Содержание экстенсина
регулируется  экстенсин  пероксидазой [Brownleader et

al., 2000].

Интересно,  что  единичная  копия  гена  экстенсина  выделена  из
арабидопсиса,  и  этот  ген  кодирует  белок  с  необычным  мотивом,  а
уровень  его  экспрессии  активируется  в  ответ  на  поранение,  обработку
метилжасмонатом, АБК и салициловой кислотой [Merkouropoulos et al.,
1999]. Вероятно, экстенсин также вносит важный вклад в архитектонику
клеточных  стенок,  и,  следовательно,  регуляцию  растяжения  клеток,
поскольку сшивание его молекул через тирозин с участием пероксидазы
образует  матрикс  для  связывания  с  полисахаридами,  целлюлозой  и
пектином,  и  полифенолами,  лигнином  и  суберином,  что  способствует
утолщению  клеточных  стенок  растений  и  затруднению  проникновения
патогена  в  клетки  [Горбачева  и  др., 1991; Проценко, 1996; Dey et al.,
1997]. В укреплении клеточных стенок важную роль отводят и глицин-
богатым  белкам  благодаря  наличию  тирозиновых  остатков  внутри
глицин-богатых  повторяющихся  мотивов  в  полипептидах,  синтез
которых  индуцируется  при  грибном  инфицировании [Cornels et al.,
2000].

Белки, связанные с патогенезом

К настоящему времени накоплен большой фактический материал

об  индукции  в  различных  растительных  объектах  в  ответ  на
инфицирование вирусами, бактериями и грибами синтеза многих новых
белков, PR-белков [Van Loon, 1985; Carr, Klessing, 1989; Едрева, 1991;
Колесник, 1991]. На  основании  значений  их  молекулярной  массы,
серологических  характеристик,  аминокислотных  последовательностей
они  подразделяются  на  несколько  семейств,  включающих, например, в
растениях  табака  от 20 до 25 различных  белков,  в  состав  которых
входят

β-1,3-глюканазы, хитиназы, пероксидазы, тауматин-подобные

белки, белки класса PR-1, белки, подобные ингибиторам протеиназ [Van
der Bulcke et al., 1990]. Среди них есть кислые и щелочные белки,
проявляющие или непроявляющие ферментативную активность
[Ильинская и др., 1991].

Особое внимание в связи с изучением механизмов защиты от

фитопатогенов  уделяют  гидролитическим  ферментам  хитиназам  и
β-1,3-глюканазам,  защитная  роль  которых  при  патогенезе  не  вызывает
сомнения [Schlumbaum et al., 1986; Mauch et al., 1988; Van der Bulcke
et al., 1990; Ward et al., 1991; Hammond-Kosack, Gones, 1996], поэтому
они составляют важную часть в семействах PR-белков. Однако помимо
участия  в  гидролизе  клеточных  стенок  грибов,  основными
компонентами  которых  являются  хитин  и  глюкан [Bartinicki-Garcia,
1968],  они  могут  способствовать  индукции  других  защитных  реакций.
Так,  олигосахаридные  фрагменты  грибных  клеточных  стенок  и
продукты  их  гидролиза  выступают  в  качестве  элиситоров,
индуцирующих  защитные  реакции  в  неинфицированных  тканях
[Озерецковская,

Роменская, 1996; Creelman, Mullet, 1997;

Озерецковская, 1999]: синтез фитоалексинов [Woloshuk et al., 1991] или
экспрессию генов других PR-белков, например ингибиторов протеиназ
[Van der Bulcke et al., 1990; Ryan et al., 1994].

Ингибиторы протеиназ обладают высокой специфичностью к

связыванию  протеиназ  патогенов,  в  силу  чего  последние  теряют  свою
активность.  В  этом  и  заключается  их  важное  значение  в  защите
растений  от  фитопатогенов  [Мосолов, 1983; Ryan et al., 1994; Ryan,
2000].  Синтез PR-белков,  в  том  числе  ингибиторов  протеиназ,  и
повышение  их  активности  индуцируется  не  только  при  обработке
растений  элиситорами,  но  и  салициловой  и  жасмоновой  кислотами,
этиленом,  а  также  при  раневом  стрессе,  причем  последний  вызывает
синтез гормоноподобного пептида системина, играющего центральную
роль в сигнальной регуляции экспрессии защитных генов [Ryan, 2000].

Как правило, в здоровых растениях уровень синтеза многих

PR-белков  крайне  низкий,  обнаруживаются  следовые  количества  этих
белков.  Хотя  некоторые  их  изоформы  могут  накапливаться
конститутивно,  но  при  заражении  фитопатогенами  уровень  экспрессии
генов PR-белков  возрастает  в  десятки  и  сотни  раз [Lui et al., 1994],
причем  экспрессия,  например  генов  хитиназ  и  глюканаз,  обычно
индуцируется  координировано [Vogeli-Lange et al., 1988; Ward et al.,
1991],  что  составляет  важную  часть  защитной  стратегии  растений,
направленной  на  лимитирование  роста  клеток  многих  грибов [Mauch
et al., 1988; Caruso et al., 1999].

Однако важно еще раз подчеркнуть, что экспрессия генов

PR-белков  может  происходить  не  только  в  условиях  инфицирования
или  под  влиянием  элиситоров,  но  и  в  ходе  нормального  онтогенеза –
прорастания  семян,  при  цветении  и  старении  тканей,  а  также
повреждений,  вызванных  поранением,  воздействием  солей  бария,
магния, ртути, ультрафиолетового облучения, в условиях осмотического
шока,  переувлажнения,  обработки  химическими  препаратами, [Van der
Bulcke et al., 1990; Ильинская и др., 1991; Едрева, 1991; Колесник, 1991;
Ponstein et al., 1994; Kauss, Jeblick, 1996; Creelman, Mullet, 1997; 1997a;
Caruso et al., 1999; Morris et al., 2000].

Вместе с тем индуцирование абиотическими факторами среды

синтеза,  казалось  бы,  таких  специфических  по  отношению  к
фитопатогенам  защитных  молекул,  как PR-белки,  по-видимому,  может
рассматриваться  как  запуск  механизма  предадаптации  растений  к
возможному  инфицированию,  поскольку  эти  стрессовые  факторы,
безусловно,  существенно  снижают  жизненный  и  энергетический
потенциал растений, что делает их более уязвимыми при последующей
патогенной агрессии.

Имеются данные об индукции экспрессии отдельных генов

PR-белков  фитогормонами  АБК [Chalupkova, Smart, 1994; Moons et al.,
1997], цитокининами [Pupet et al., 1990; Simmons et al., 1992; Yuko et al.,
1995], этиленом [Ishige et al., 1991; Simmons et al., 1992; Xu et al., 1994;
O'Donnell et al., 1996], жасмонатом [Xu et al., 1994; Doares et al., 1995;
O'Donnell et al., 1996; Ильинская  и  др., 1996; Creelman, Mullet, 1997;
Ryan, 2000]. Очень  много  данных  в  отношении  индукции  экспрессии
большой  группы PR-белков  салициловой  кислотой  (СК),  на  анализе
которых  мы  остановимся  подробно  в  специальной  главе,  посвященной
участию СК в развитии стресс-устойчивости растений.

Таким образом, большое семейство PR-белков может вовлекаться

в формирование устойчивости растений не только к фитопатогенам, но
и к широкому кругу факторов и стрессовых ситуаций. Поэтому белки,

названные в момент их открытия как «pathogenesis-related», в частности
связанные  с  формированием  реакции  гиперчувствительности  в  тканях
табака  при  заражении  вирусом  табачной  мозаики  (ВТМ) [Van Loon,
1985], хотя и продолжают носить это имя, скорее принадлежат к стресс-
индуцируемым  или  стрессовым  [Едрева, 1991; Jung et al., 1993] и
защитным белкам [Ryan, 2000].

Эта группа белков также, как и другие, имеющиеся в арсенале

растений  механизмы  защиты  от  грибных  болезней,  вызывает
несомненный  интерес  у  исследователей,  о  чем  свидетельствуют
многочисленные  публикации,  касающиеся  всестороннего  изучения
проблемы

взаимоотношения

растения-патогена

позиции

устойчивости, знание которых может позволить целенаправленно
управлять ею [Jouanin et al., 1998].

Лектины в защитных реакциях при инфицировании растений

В формировании реакций между растением-хозяином и патогеном

важная роль отводится фитолектинам [Королев, 1984; Метлицкий,
Озерецковская, 1985; Лахтин, 1987; Cammue et al., 1990; Chrispeels,
Raikhel, 1991; Любимова, 1991; Peumans, Van Damme, 1995; Jouanin
et al., 1998; Espinosa et al., 2000].

Лектины – это особый класс белков или гликопротеидов,

разнообразных  по  своей  структуре  и  биохимическим  особенностям,
обладающих  замечательной  способностью  специфически  и  обратимо
связывать  углеводы,  не  вызывая  их  химического  превращения.  Общим
свойством  лектинов  является  их  способность  агглютинировать
эритроциты  крови,  из-за  чего  их  называют  агглютининами,  причем
агглютинация  подавляется  специфическими  углеводными  гаптенами.
Несмотря

на

детальное

исследование

физико-химических

биологических

свойств

многих

растительных

лектинов,

их

физиологическая

значимость

для

растений

все

еще

носит

предположительный  характер,  хотя  решающую  роль  в  выполнении
предполагаемых функций отводят наличию в них углеводсвязывающих
доменов,  благодаря  которым  лектины  могут  взаимодействовать  как  со
свободными  моно-  и  олигосахаридами,  так  и  с  остатками  углеводов  в
составе  полисахаридов,  гликолипидов  и  гликопротеидов  [Луцик  и  др.,
1981;  Королев, 1984; Chrispeels, Raikhel, 1991; Peumans, Van Damme,
1995; Roy, 1997; Jouanin et al., 1998; Espinosa et al., 2000].

Поскольку в состав клеточных стенок фитопатогенов входят

углеводные компоненты, то это свойство лектинов может обеспечивать

растениям способность распознавать целый ряд фитопатогенов даже по
слабым

различиям

углеводной

структуре

поверхностей

микроорганизмов. Имеющаяся на сегодняшний день огромная масса
экспериментальных данных позволяет рассматривать лектины в
качестве

рецептора

межклеточных

взаимодействиях,

что

анализировалось подробно в системе бобовых с бактериями-
симбионтами рода Rhizobium [Etzler, 1986; Lis, Sharon, 1986; Kiraly
et al., 1991; Баймиев, 1999; Etzler et al., 1999].

Однако в процессах взаимодействия с азотфиксирующими

бактериями могут участвовать и другие лектины. Так, имеются данные
о

вовлечении

лектина

пшеницы

во

взаимоотношение

со

свободноживущими бактериями родов Azotobacter, Spirillum и особенно
сильное  взаимодействие  лектина  с  ассоциативным  для  злаковых
культур  азотфиксирующим  микроорганизмом  Azospirillum brasilense  и
усиление под его влиянием азотфиксирующей активности [Никитина и
др., 1987; Иосипенко и др., 1996]. С другой стороны, показано участие
лектинов  клеточной  поверхности  A. brasilense  и  A. lipoferum  в
специфической  адгезии  бактерий  на  корнях  пшеницы,  а  также
способность  лектина  этих  бактерий  к  взаимодействию  с  пшеничным
лектином [Никитина и др., 1996].

Участие эндогенных лектинов в рекогниции и связывании

азотфиксирующих бактерий очень привлекательно для исследователей,
однако оно должно быть тщательно подтверждено функционированием
in vivo в этой сложной системе взаимоотношений между партнерами
[Peumans, Van Damme, 1995; Van Ejisden et al., 1995; Long, 1996;
Rudiger, 1997; Etzler et al., 1999].

Следует подчеркнуть, что лектины бывают не только в форме

свободных

цитоплазматических

белков,

локализованных

цитоплазматических  компартментах,  вакуолях,  или  связанных  с
цитоплазматическими  мембранами  и  клеточной  плазмалеммой (это так
называемые «классические» лектины). Имеются также прочносвязанные
с  клеточными  стенками  лектины,  или

β-лектины, которые, хотя и

обладают доменами углеводной специфичности, но не способны
агглютинировать эритроциты или агглютинируют их очень слабо
[Cellier et al., 1978; Dey et al., 1997]. К

β-лектинам относится, например,

вышеупомянутый  экстенсин  [Королев, 1984; Etzler, 1986; Любимова,
Салькова, 1988]. Вероятно,  именно  последним  принадлежит  важная
роль  в  межклеточном  взаимодействии,  лежащем  в  основе  узнавания
патогенов  растениями-хозяевами.  Прочносвязанный  с  клеточными
стенками  экстенсин  агглютинирует  большое  количество  авирулентных
штаммов

Pseudomonas solanacearum,

вероятно,

посредством

взаимодействия с мембранным липополисахаридом бактерий (ЛПС), но
практически не связывает вирулентные штаммы [Leach et al., 1982]. Это,
по-видимому, обусловлено тем, что вирулентные штаммы продуцируют
экстрацеллюлярный

полисахарид

(ЭПС),

препятствующий

взаимодействию  лектина  с  ЛПС,  тогда  как  при  удалении  ЭПС
вирулентные  клетки  приобретают  способность  связываться  с  лектином
[Любимова, Салькова, 1988]. Слабую рецепцию вирулентных штаммов
Erwinia stewartii  лектином  кукурузы  также  связывают  с  выделением
ими в окружающую среду ЭПС [Bradshaw-Rouse et al., 1981].

Наряду с экстенсином в картофеле существует очень близкий к

нему по химической структуре, составу и свойствам водорастворимый,
связанный  с  плазмалеммой  лектин,  который  может  рассматриваться  в
качестве  предшественника  экстенсина,  и  он,  если  и  не  участвует  в
создании  прочного  комплекса  клеток  в  системе  растение – патоген,
поскольку не встроен в структуру клеточной стенки, то реально может
участвовать  в  становлении  взаимоотношений  между  картофелем  и
возбудителем  фитофтороза  [Любимова,  Салькова, 1988; Любимова,
1991].

Взаимодействие

лектинов

углеводными

гаптенами

фитопатогенов может запускать в ответ на микробную инфекцию цепь
защитных реакций в растении-хозяине, в том числе задействованных в
образовании реакции сверхчувствительности (СВЧ) [Leach et al., 1982;
Mazau, Esquerre-Tugaye, 1986; Etzler, 1986; Любимова, Салькова, 1988;
Showalter, 1993; Brownleader et al., 2000].

Таким образом, первым этапом взаимоотношения растения-

хозяина  и  патогена  является  межклеточное  узнавание  партнеров
[Любимова,  Щербухин, 1991], которое  может  определять  дальнейшую
судьбу  развития  этих  отношений,  и  роль  рецепторов  в  распознавании
чужеродных инфекционных структур могут выполнять

β-лектины.

Однако существует немало данных о вероятном участии в

межклеточном  узнавании  растениями  как  авирулентных,  так  и
вирулентных  штаммов  фитопатогенов  и  вовлечении  в  формирование
защитных  реакций  растений  растворимых  «классических»  лектинов,
которое  заключается  в  их  связывании  со  спорами  фитопатогенных
грибов и другими инфекционными структурами патогенов и, вследствие
этого,  подавлении  роста  и  развития  последних [Brambl, Gade, 1985;
Метлицкий,  Озерецковская, 1985; Chrispeels, Raikhel, 1991; Любимова,
1991; Peumans, Van Damme, 1995; Ciopraga et al., 1999].

В литературе имеются данные об индукции под влиянием

различных лектинов двудольных растений (гороха, клещевины, арахиса,
фасоли)

образования

фитоалексина

гороха – пизатина,

свидетельствующие о возможности действия растворимых лектинов в
качестве элиситоров [Toyoda et al., 1995].

Хитинсвязывающие лектины благодаря своей специфичности к

N-ацетил-D-глюкозамину (GlcNAc) и  олигомерам  хитина  являются
наиболее  вероятными  кандидатами  для  выполнения  защитной  роли  в
растениях  от  хитинсодержащих  насекомых  и  грибных  патогенов
[Chrispeels, Raikhel, 1991; Paumans, van Damme, 1995; Oka et al., 1997;
Jouanin et al., 1998], так  как  большинство  фитопатогенных  грибов –
хитинсодержащие [Peberdy, 1989]. К таким белкам относятся, например,
вышеупомянутый  растворимый  связанный  с  плазмалеммой  лектин
картофеля  [Любимова,  Салькова, 1988; Любимова, 1991], лектин
корневища  крапивы [Broecaert et

al., 1989], а также агглютинин

зародыша пшеницы (АЗП) [Allen et al., 1973].

Возможность выполнения антифунгальной роли АЗП впервые

показана в работе Mirelman et al. [1975] в опытах in vitro, в которых АЗП
ингибировал прорастание спор Trichoderma viridе и Fusarium solani,
давших

основание

предположить,

что

АЗП,

обладающий

специфическим сродством к GlcNAc – структурному компоненту
хитина, подавляет его синтез и, таким образом, может выполнять
защитную

роль

растениях

при

болезнях,

вызываемых

хитинсодержащими  фитопатогенными  грибами.  Позднее  было
показано,  что  АЗП  взаимодействует  с  грибными  патогенами  пшеницы
Tilletia caries,  Puccinia graminis,  подавляя  прорастание  их  спор
[Barragueta-Egea, Schauz, 1983], с  гифами  грибов  Helminthosporia
sativum  [Лахтин,  Яковлева, 1987], с  гаусториями  Erysiphae graminis
[Ebrachim-Nesbat et al., 1982], с клеточными стенками F. graminearum и
F. oxysporum [Ciopraga et

al., 1999], причем микроскопические

исследования влияния АЗП на ранние стадии развития двух последних
грибов

выявили

различные

модификации

ростовых

трубок,

опухолеобразование, вакуоляцию клеток и лизис грибных клеточных
стенок [Ciopraga et al., 1999].

Поскольку приведенные выше результаты были получены с

применением  экзогенного  АЗП,  у  некоторых  исследователей  возникли
сомнения  в  чистоте  препарата  АЗП,  так  как  даже  очень  маленькие
примеси  хитиназы  в  препарате  могут  вызывать  ингибирование  роста
грибов [Schlumbaum et al., 1986; Dixon, 1986]. В ответ на это возражение
Broekaert  с  cоавт. [1989] были  проделаны  специальные  опыты  по
тщательной  термической  очистке  лектина  корневища  крапивы,
обладающего,  также,  как  и  АЗП,  специфичностью  к GlcNAc, от
возможных  примесей  хитиназы  с  одновременной  проверкой  препарата
на хитиназную активность. Несмотря на то, что препарат лектина после

дополнительной очистки терял хитиназную активность, он тем не менее
подавлял рост Вotrytis cinerea, Trichoderma hamatum, Phycomyces
blakesleeanus [Broekaert et al., 1989]. Проверка чистоты от хитиназ была
проведена и в отношении препарата АЗП [Ciopraga et al., 1999].

Следует подчеркнуть, что прямых доказательств вовлечения АЗП

в  формирование  защитных  реакций  в  системе  растение – гриб (in vivo)
пока не получено, хотя в пользу его участия в ответе на инфицирование
могут  свидетельствовать  данные  о 2–3-кратном  увеличении  уровня
этого  белка  в  зараженных  корневой  гнилью  и  септориозом  растениях
пшеницы  [Шакирова  и  др., 1990; 1994], а  также  при  обработке
элиситорами [Cammue et al., 1990] и  препаратами,  повышающими
устойчивость пшеницы к возбудителям грибных болезней [Хайруллин и
др., 1992; Шакирова, 1999].

Данные, касающиеся участия разнообразных лектинов в защите

растений  от  патогенов,  со  всей  убедительностью  свидетельствуют  о
том,  что  эти  белки,  благодаря  специфичности  к  углеводным
компонентам  клеточных  поверхностей  фитопатогенов,  могут  играть
важную  роль  в  цепи  формирования  защитных  реакций  растений  при
инфицировании,  при  этом,  видимо,  самой  интригующей  является
возможность  их  участия  в  первой  стадии  взаимоотношения  растение –
патоген – в межклеточном узнавании патогена растением-хозяином.

Очевидно, в защите растений от хитинсодержащих фитопатогенов

лектины  тесно  взаимодействуют  с  хитиназами,  более  того,  например,
обнаружено  сродство N-терминального  хитинсвязывающего  домена
хитиназ класса I табака с таковым у некоторых растительных лектинов
[Ponstein et al., 1994], а  эксперименты  с  мутациями  в  потенциально
каталитических  последовательностях  хитиназы А  табака  показали,  что
замена  глютаматов  в  положениях 122 и 144 на  аланин  и  глицин
приводит  к  потере  каталитической  (гидролитической)  активности
домена  хитиназы  с  превращением  его  в  хитинсвязывающий  лектин
[Iseli-Gamboni et al., 1998]. Интересна  работа  по  созданию  химерной
конструкции  белка,  собранного  из  лектина  корневища  крапивы  и
каталитического домена хитиназы I табака [Does, Cornelissen, 1999].

Вместе с тем, наряду с участием в защитных реакциях к

фитопатогенам,  лектины  вовлекаются  в  формирование  ответных
реакций  к  абиотическим  стрессовым  факторам  среды.  Имеется
достаточное  количество  данных,  свидетельствующих  о  повышении
гемагглютинирующей  активности  разных  лектинов  (в  том  числе  и
клеточно-стеночных)  при  поранении  [Любимова, 1991], воздействии
низких  температур  [Комарова  и  др., 1999; Тимофеева  и  др., 1999],
усилении  синтеза  и  повышении  их  уровня  при  гипертермии [Spadoro-

Tank, Etzler, 1988; Шакирова и др., 1995; Shakirova et al., 1996], засухе и
осмотическом шоке [Cammue et al., 1989], засолении среды [Шакирова и
др., 1993], а также об индукции экспрессии генов лектинов при
дефиците влаги [Singh et al., 2000], раневом [Zhu-Salzman et al., 1998; s
et al., 1999] и солевом [Zhang et al., 2000] стрессах. Интересны сведения
о

возможных

механизмах

криопротекторного

эффекта

галактозоспецифичных

лектинов

семян

ряда

растений

на

изолированные  тилакоидные  мембраны  листьев [Hincha et al., 1993].
Благодаря  относительной  гидрофобности  этих  лектинов  они  могут
связываться  с  гликолипидами  мембран,  что  может  способствовать
укреплению  мембранных  структур  тилакоидов  и  снижению  их
повреждения  в  ходе  промораживания.  Анализ  сезонных  изменений  в
уровнях  лектинов  листьев  омелы  (максимальные  в  зимние  месяцы),
наряду  с  их  четким  защитным  эффектом  на  изолированные
тилакоидные  мембраны  шпината,  позволяет  предполагать  их
вовлечение  в  связывание  с  гликолипидами,  присутствующими  в
большинстве  клеточных  мембран,  и,  таким  образом,  в  стабилизацию
мембранных структур листьев омелы in vivo при замораживании [Hincha
et al., 1997].

Все эти данные свидетельствуют о возможной роли лектинов в

адаптации  растений  к  разнообразным  по  природе  стрессовым
воздействиям  и  вовлечении  их  в  формирование  неспецифических
защитных реакций, что еще раз подчеркивает, как мы обсуждали выше,
существование  универсальных  механизмов  защиты  растений  к
разнообразным по природе воздействиям.

Итак, физиолого-биохимические взаимоотношения патогена и

растения-хозяина  в  ходе  инфицирования  представляют  собой  сложные
регуляторные  взаимосвязи  между  двумя  организмами.  Изучение  этих
взаимосвязей  на  разных  уровнях,  от  организменного  до  клеточного,
свидетельствует  о  том,  что  на  разных  этапах  развития  болезни
включаются  различные  механизмы  нападения  патогена  и  защитные
реакции  растения,  которые  регулируются  внутренними  и  внешними
факторами.

Суммируя данные, касающиеся анализа механизмов естественной

устойчивости  растений  к  природным  стрессовым  воздействиям,
выявляются универсальные неспецифические механизмы, к которым, в
первую  очередь,  можно  отнести  изменения  в  балансе  фитогормонов,
связанные,  например,  с  накоплением  АБК,  продукцией  этилена  и
снижением  содержания  фитогормонов  «активаторного»  типа  действия.
Повреждающие  воздействия  окружающей  среды  приводят  в  целом  к
снижению  интенсивности  синтетических  процессов  в  клетках,  на  фоне

которого  индуцируется  синтез  стрессовых  белков,  в  том  числе  и
PR-белков,  а  также  ряда  присущих  норме  белков,  например
гидролитических ферментов, ферментов дыхательной цепи, пероксидаз
и  отдельных  конститутивных  белков.  Наряду  с  этим  усиливается
образование соединений фенольной природы, играющих важную роль в
защите растений при атаке патогенов или раневом стрессе и т.д.

Таким образом, формирование устойчивости у растений к

стрессовым  факторам  разной  природы  зависит  от  эффективного
взаимодействия в живой системе общего (неспецифического) с частным
(специфическим),  и  в  этом  заложена  возможность  активного
реагирования  организмов  на  неблагоприятные  условия  среды  живых
систем  и  развитие  этой  способности  в  процессе  длительной  эволюции.
Поэтому,  по-видимому,  нет  единой  устойчивости,  а  есть  устойчивость
единого – одного  и  того  же  растения  с  одним  и  тем  же  генотипом,
реализующего  различные  генетические  подпрограммы  и  тем  самым
различные  физиолого-биохимические  и  молекулярно-генетические
механизмы устойчивости в ответ на действие различных стрессоров.

Известная неспецифичность (общность) и специфичность

(особенность)  ответных  реакций  растений  на  действие  различных
стрессоров  говорит  об  определенной  корреляции  (сопряжении)  частей
различных  генетических  подпрограмм  [Урманцев,  Пронина, 1986;
Титов  и  др., 1987; Кузнецов,  Старостенко, 1993; Дьяков, 1994;
Пахомова, 1995; Конарев, 1998; Миркин и др., 1999; Тарчевский, 2000].
Вся  совокупность  протекающих  в  ответ  на  стрессовые  воздействия
реакций, из которых многие еще, вероятно, неизвестны, а из известных
еще  у  многих  предстоит  выяснить  их  функциональную  значимость,
сводится  к  поддержанию  гомеостаза  растительного  организма  в
экстремальных  условиях,  направленного  на  преодоление,  ослабление
или устранение повреждающего действия стрессора на растение.

Мы сознательно сделали в этом разделе акцент на разнообразии

универсальных механизмов устойчивости растений, поскольку знание
ключевых звеньев неспецифической устойчивости необходимы
исследователям

для

реализации

способов

целенаправленного

практического повышения устойчивости растений к разнообразным
неблагоприятным воздействиям, которым растения систематически
подвергаются в естественных условиях произрастания.

В связи с этой проблемой отводят значительное место в

современном  растениеводстве  использованию  фитогормонов  и  других
эндогенных  регуляторов  роста,  а  также  созданных  на  их  основе
синтетических  препаратов.  На  способность  экзогенной  обработки  АБК
повышать  устойчивость  растений  к  дефициту  влаги,  экстремальным

температурам,  засолению  среды  мы  уже  указывали  в  разделе,
посвященном этому гормону. Вместе с тем необходимо отметить, что в
спектрах  физиологического  действия  представителей  других  классов
фитогормонов – цитокининов, брассиностероидов, а также эндогенного
регулятора  роста  фенольной  природы – салициловой  кислоты,
являющихся,  в  отличие  от  АБК,  активаторами  ростовых  процессов
растений, заметное место занимает и защитный эффект по отношению к
действию разнообразных по природе неблагоприятных факторов среды.

Соответственно исследование механизмов, лежащих в основе их

антистрессового

эффекта

способствующих

повышению

неспецифической  устойчивости,  является  очень  актуальным  в  связи  с
возможностью  целенаправленного  управления  этими  механизмами  с
целью  повышения  устойчивости  и  продуктивности  растений.
Рассмотрению роли цитокининов, а также соединений, созданных на их
основе  или  имитирующих  цитокинины  в  специфических  для  них  тест-
системах,  в  повышении  стресс-устойчивости  растений  и  посвящена
следующая глава данной работы.

ЛАВА

2. РОЛЬ БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩЕГО АППАРАТА

В ПОВЫШЕНИИ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ
ПОД ВЛИЯНИЕМ ЦИТОКИНИНА
И ДРУГИХ СОЕДИНЕНИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ
ЦИТОКИНИНОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Физиологическая роль цитокининов в клетках растений

разнообразна  и  включает  регуляцию  многих  процессов,  лежащих  в
основе  жизнедеятельности  растений  на  протяжении  всего  онтогенеза.
Механизмам  действия  этих  фитогормонов  и  системам  восприятия  и
трансдукции  цитокининовых  сигналов  посвящено  немало  работ
[Кулаева, 1973; 1982; 1984; 1987; Клячко, 1985; Муромцев и др., 1987;
Полевой, 1989; Binns, 1994; Jackson, 1993; 1997; Schmulling et al, 1997;
Kakimoto, 1998].

В широком спектре физиологического действия цитокининов

выявляется  четко  выраженный  защитный  эффект  на  растения  при
воздействии разных по природе таких стрессовых факторов, как засуха,
гипо-  и  гипертермия,  засоление,  возбудители  болезней,  тяжелые
металлы  и  др. [Кулаева, 1973; Poupet et al., 1990; Angra et al., 1990;
Чернядьев, 1997; Зауралов, 1997; 2000; Пустовойтова  и  др., 1997;
Barciszewski et al., 1999; Веселов, 2000; Kobayashi et a., 2000], что дает
основание  рассматривать  природные  цитокинины,  а  также  их
синтетические  аналоги  в  качестве  перспективных  соединений  для
практического  растениеводства.  Защитное  действие  представителей
этого  класса  фитогормонов,  по-видимому,  связано  с  характерной  для
них особенностью оказывать омолаживающий эффект на растительные
организмы,  который  особенно  ярко  проявляется  на  изолированных
органах.  Поэтому  их  часто  используют  для  изучения  тонких
регуляторных механизмов антистрессового действия цитокининов.

Изолированные семядоли являются одной из распространенных

модельных  систем  благодаря  их  высокой  чувствительности  к
экзогенной обработке фитогормонами. Действительно, внесение в среду
инкубации  изолированных  семядолей  тыквы  синтетического  аналога
зеатина, 6-бензиламинопурина  (БАП),  приводит  к  существенной
активации  их  роста,  тогда  как  АБК,  напротив, – к  его ингибированию.
Различие  в  действии  этой  пары  фитогормонов  на  рост,  вероятно,
связано

их

противоположным

влиянием

на

состояние

трансляционного аппарата: БАП индуцирует сборку активных в синтезе
белка полисом из моносом, а АБК вызывает деградацию

белоксинтезирующего аппарата, существенно увеличивая долю
неактивных в трансляции моносом в препарате рибосом [Klyachko et al.,
1979; Ананиев и др., 1980; Кулаева, 1982; Шакирова и др., 1982; 1983;
Клячко, 1985], что особенно ярко проявляется в условиях голодания
семядолей тыквы в течение нескольких суток после изоляции на воде в
темноте.

Следует заметить, что анализ состояния трансляционного

аппарата имеет важное значение в оценке интенсивности синтеза белка
в клетках, который в значительной мере определяется уровнем
активных в синтезе белка полисом. В свою очередь, уровень активных в
синтезе белка полисом является производным двух показателей: общего
содержания рибосом в клетках и соотношения полисом и моносом в
выделенном препарате рибосом.

Влияние голодания и цитокинина на динамику роста и кинетику
сборки полисом в изолированных семядолях

Данные, приведенные на рис. 1, демонстрируют, что скорость

роста  изолированных  от 4-суточных  проростков  тыквы  семядолей  в
ходе  голодания  на  воде  в  темноте  на  протяжении 4-х  суток  довольно
низкая.  Инкубирование  семядолей  сразу  после  изоляции  на  растворе
БАП  приводит  к  немедленному  увеличению  скорости  их  роста.

Рис. 1.  Динамика  роста  изолированных  семядолей  тыквы  при  их
инкубации в темноте на воде (контроль) или 50 мкМ БАП после различного
времени  голодания  их  на  воде  после  изоляции.  Стрелкой  указан  момент
внесения  семядолям  БАП.  Сплошная  линия – вес  семядолей  на  БАП,
прерывистая – на воде

Внесение же цитокинина семядолям, голодавшим в течение 1–3-х суток
после  изоляции  на  воде  в  темноте,  индуцирует  их  рост  с  некоторой
задержкой,  так  что  у  голодавших  в  течение 3-х  суток  семядолей
наблюдается даже 3-х часовой лаг-период. Вместе с тем в последующий
после добавление БАП период, напротив, скорость их роста становится
выше,  чем  при  его  внесении  к  свежеизолированным  семядолям,  о  чем
можно судить по увеличению угла наклона кривых роста.

В процессе голодания происходит постепенная деградация

белоксинтезирующего аппарата в семядолях, так что у голодавших в
течение 3-х суток семядолей доля полисом в препарате рибосом
составляет лишь 50 % (рис. 2).

Рис. 2.  Влияние  БАП  на  кинетику  сборки  полисом  в  изолированных
семядолях  тыквы:  А – сплошная  линия – на  растворе 50 мкМ  БАП,
прерывистая – на  воде.  Время  добавления  БАП  указано  стрелкой.
Б – изменение скорости формирования полисом (V) под действием БАП от
исходного  процента  моносом (%). Размерность V – % сформированных
полисом за 1 ч

Добавление БАП семядолям, голодавшим в течение разного

времени, индуцирует сборку полисом, причем скорость этого процесса
находится в линейной зависимости от количества свободных моносом в
препарате  рибосом  (рис. 2Б).  Наибольшей  белоксинтезирующей
активностью  характеризуются,  как  видно,  свежеизолированные
семядоли.  Поскольку  доля  полисом  в  выделенном  из  них  препарате
рибосом  самая  высокая  и  составляет  более 90

%, скорость

БАП-индуцированного формирования полисом у этих семядолей самая
низкая. Вместе с тем в ходе голодания семядолей происходит

Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция - часть 2