Том 3. Справочник по кожным болезням - часть 418

ее генома, используя только данные молекулярно-биологических методов. В этом случае при исследовании 
клинического материала с помощью культурального метода микробные клетки, потерявшие эти важные с 
клинической точки зрения свойства, не дадут роста в клеточной культуре.

    Для транспортировки и хранения клинического материала используют специальную питательную среду 
(транспортная среда). Она разливается в пенициллиновые флаконы по 1 мл и хранится при температуре + 
4

0

C в течение 2-х месяцев. Состав транспортной среды: среда МЕМ с добавлением 10% сыворотки крупного

рогатого скота и антибиотика гентамицина концентрации 50 мкг/мл , чаще используется среда 2SP.

    Клинический материал после перенесения в транспортную среду хранится при температуре + 4 

0

 С и в 

течение двух суток должен быть доставлен в лабораторию.

Процедура заражения клеток

1. Обработка однодневной клеточной культуры McCoy 1% раствором ДЕАЕ 

декстраном в течение 30 минут. 

2. Заражение обработанных клеток материалом, полученным от больных. 
3. Центрифугирование зараженных клеток при 2500 g в течение 60 минут. 
4. Отмывка клеток питательной средой. 
5. Добавление к клеткам ростовой среды, cодержащей циклогексимид. 
6. Инкубирование клеток в течение двух суток при +36 

0

 C. 

7. Обнаружение хламидий в клетках методом прямой иммунофлюоресценции или 

ПЦР. 

    Реальный срок получения результатов этим методом – семь дней.

    В настоящее время в литературе растет число сообщений о случаях резистентности хламидий к 
антибактериальным препаратам (эритромицину, тетрациклину, доксициклину, фторхинолонам). Ценность 
культурального метода состоит в том, что он является пока единственным методом, позволяющим выбрать 
антибактериальный препарат для лечения хламидийной инфекции и оценить эффективность 
антибактериальной терапии.

Схема метода выявления устойчивости хламидии трахоматис к антибактериальным препаратам

1. Хламидийным изолятом, выделенным от больного при посеве заражают 

чувствительные клетки. 

2. К зараженным клеткам добавляют ростовую среду, содержащую антибиотик в 

различных дозах. 

3. Зараженные клетки инкубируют 5 дней при температуре + 36 

0 

C. 

4. Чувствительность хламидий к антибиотику определяется по подавлению инфекции

в зараженных клетках, то есть по снижению числа клеток с внутриклеточными 
включениями. Процедура длительная, занимает по времени две недели. 

Диагностика Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции

    Дороговизна, длительность и трудоемкость микробиологического выделения хламидий в культуре 
существенно затрудняет использование этой процедуры в рутинной лабораторной диагностике. В 
литературе накоплен обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода ПЦР для выявления 
хламидии трахоматис. Особое внимание при его использовании следует уделять, без сомнения, вопросам 
правильной интерпретации получаемых результатов. Экстремально высокие показатели чувствительности и 
специфичности ПЦР делают эту методику во многом революционной в лабораторной диагностике. 
Основными мишенями при выявлении хламидии трахоматис являются нуклеотидная последовательность 
видоспецифической криптической плазмиды, последовательность главного белка внутренней мембраны, 
рибосомальные гены.

    Данная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию) 
специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, 

дезоксинуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-
праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка. Каждый цикл состоит из трех стадий с 
различными температурными режимами. На первой стадии при 94 

0

 С происходит разделение цепей ДНК, 

затем при 56-58 

0

 C- присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК-

мишени, и при температуре 72 

0

 C протекает синтез новых цепей ДНК путем достраивания цепей праймеров 

в направлении 5

`

 -3

`

. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что 

позволяет за 25-40 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в 
количестве, достаточном для ее детекции с помощью электрофореза или альтернативными ему 
технологиями.

    По сравнению с широко применяющимися иммунологическими тестами ПЦР-диагностика обладает 
рядом преимуществ:



высокой и регулируемой специфичностью, обусловленной лишь нуклеотидной 
последовательностью, применяемой в данной диагностической системе; 



высокой чувствительностью, позволяющей диагностировать не только острые, но и
латентные инфекции (возможно выявление даже единичных бактерий или 
вирусов); 



химическое сходство всех нуклеиновых кислот позволяет разрабатывать 
универсальные процедуры для выявления различных инфекционных агентов; 



возможностью идентификации возбудителя в течении 4,5-5 часов. 

    Доставка биоматериала в ПЦР-лабораторию производится в холодовом термоконтейнере или термосе со 
льдом. Важной отличительной особенностью ПЦР-диагностики является относительно низкая стоимость 
оборудования для проведения анализа, сочетающаяся с универсальностью метода, что позволяет выявлять 
весь спектр клинически актуальных инфекционных агентов. 

    ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты). Cледует иметь не менее двух комнат:

    -пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление 
реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется 
также проводить в дополнительном отдельном помещении); в этих помещениях запрещается проводить все 
другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические
тесты), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

    -пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации, в пост-ПЦР-помещении 
допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной 
лаборатории. Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как 
можно дальше от пре-ПЦР-помещений. Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР-
помещения в пре-ПЦР-помещение.

    В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть 
установлены ультрафиолетовые лампы, рабочие поверхности в лаборатории должны обрабатываться 
дезинфицирующими растворами 

Показания для диагностики Chl. trachomatis методом ПЦР

1. Острая фаза заболевания.

2. Хроническая фаза заболевания.

3. Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта.

4. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом.

5. Бесплодие неясного генеза.

6. Контроль эффективности проведенного антибактериального лечения. В случае выявления фрагмента ДНК
хламидии трахоматис после курса химиотерапии следует провести культуральную диагностику для 
исключения «ложноположительного с клинической точки зрения результата». Если проведение 
культуральной диагностики невозможно, то необходимо через 5-6 недель (полное обновление 
эпителиального покрова мочеполовых путей) провести повторное исследование методом ПЦР.

7. Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных лиц, больных туберкулезом, вирусным гепатитом и со 
вторичными иммунодефицитными состояними (онкологические больные после курсов химио- и лучевой 
терапии, трансплантации костного мозга, получающие иммуносупрессивную терапию).

    В 1991 году компания Хоффман-ла Рош ЛТД получила от компании Cetus права и патенты на 
использование ПЦР. В этом же году была создан Roche Molecular Systems, занимающийся исключительно 
вопросами развития и совершенствования ПЦР. В 1992 году были внедрены первые стандартизованные 
тест-системы для клинической ПЦР-диагностики AMPLICOR Chlamydia trachomatis, а в 1993 году начато 
производство этих тест систем. Многочисленные проведенные исследования показали высокую 
чувствительность и специфичность данного набора. Это позволило получить данной тест-системе 
сертификат Food and Drug Administration (FDA) в 1993 году. В 1995 году появился новый набор AMPLICOR 
Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae для одновременной их детекции в одной пробирке. В тесте 
использованы биотинилированные праймеры (СР24/CР27) из криптической плазмиды Chl. trachomatis. 
Чувствительность теста составляет 10 копий/мл, специфичность 99,6%. Тест-система включает: набор для 
сбора и транспортировки образцов, набор для выделения ДНК из цервикальных, уретральных образцов и 
мочи, набор для амплификации и детекции. Все наборы стандартизованы, полностью готовы к 
использованию, имеют внутренний контроль, систему защиты от контаминаций. 

    Научно-производственной фирмой “Литех” при НИИ физико-химической медицины МЗ РФ выпускается 
набор реагентов “Полимик” в виде трех отдельных наборов для определения соответственно Chlamydia 
trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum. Каждый набор «Полимик» комплектуется 
отдельным набором для выделения ДНК из биопроб. Инструкция по применению набора реагентов 
рекомендована к утверждению экспертной комиссией Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ 
(протокол No 3 от 18.03.96 г.) и утверждена Министерством здравоохранения РФ 17.05.96 г. (ТУ 9398-405-
17253567-96). 

    В состав реакционной смеси набора «Полимик» входит внутренний контроль (рекомбинантная плазмида, 
содержащая фрагмент-вставку размером 308 н.п.). Этот компонент позволяет контролировать процесс 
прохождения реакции амплификации, а также тестировать наличие в пробах веществ, ингибирующих ПЦР. 
Полоса, соответствующая внутреннему контролю, должна проявляться как в положительном и в 
отрицательном контролях, так и во всех тестируемых пробах.

    При выделении ДНК из биопробы («Набор для выделения ДНК») используется метод экстракции ДНК из 
клеток хламидий с помощью гуанидина тиоцианата и связывания высвобождающихся нуклеиновых кислот 
с частицами крупнопористого стекла. Это позволяет оптимизировать условия выделения и подготовки проб 
для амплификации, а также уменьшить количество манипуляций с образцом. При этом все манипуляции 
проводятся в одной пробирке. Выход хромосомной ДНК составляет 70-80% по результатам определения 
числа колониеобразующих единиц клеток Acholeplasma laidlawii (штамм микоплазм, взятый в качестве 
стандарта) как в случае чистой культуры, так и при добавлении этих клеток к клиническому материалу, не 
содержащему определяемых инфекционных агентов. 

    После завершения ПЦР продукты амплификации фракционируют методом электрофореза в 1,5% 
агарозном геле.

Анализ результатов диагностики

1. В положительном контрольном образце для хламидии выявляется полоса размером 501 н.п.

2. В отрицательном контрольном образце полоса, соответствующая фрагментам генома, хламидии должна 
отсутствовать. Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации компонентов 
набора.

3. В анализируемой пробе отсутствие полосы строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует
об отсутствии возбудителя в пробе, наличие полосы, соответствующей по электрофоретической 
подвижности положительному контролю, свидетельствует о наличии хламидии в клинической пробе.

4. Во всех образцах выявляется полоса оранжево-красного цвета, соответствующая внутреннему контролю 
размером 308 н.п. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с 
использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) светофильтра. При использовании 
видеосистемы “Gel-doс” возможно документирование результатов электрофореза в виде компьютерного 
файла, доступного любым приложениям «Windows».

    Набор «Полимик» следует хранить при температуре - 18-20 

0

 С в течение всего срока годности (6 

месяцев). Допускается хранение и транcпортировка набора при температуре не выше 0 

о

 градусов не более 

одних суток.

    В настоящее время (по состоянию на третий квартал 2000 г.) Минздравом России помимо набора 
«Полимик» разрешены следующие диагностические наборы для обнаружения хламидии трахоматис 
методом ПЦР в качестве изделий медицинского назначения:



набор реагентов амплификационный для определения ДНК хламидий (Хламидия-
Ампли-тест) ТУ 9398-402-18137053-96 производства АО «ВНЦМДЛ», Москва; 



набор реактивов для выявления нуклеотидных последовательностей хламидия 
трахоматис методом ПЦР (Хлам Ам) ТУ 9398-403-29032954-96 производства ЗАО 
«Внедрение систем в медицину», Москва; 



набор реагентов для выявления ДНК хламидии трахоматис методом ПЦР (Хлам-
Ген) ТУ 9398-412-46482062-97 производства НПФ «ДНК-технология», Москва. 

    В таблицах 18 и 19 приведены данные А.В. Савичевой и М.А. Башмаковой по выявлению хламидии 
трахоматис в клинических пробах различными методами исследования. Использованы выборки из 
исследований, в которых хотя бы одним из методов они были бы обнаружены. Видно преимущество ПЦР 
как при исследовании первичных материалов, так и при детекции ДНК хламидий в клеточной культуре, 
зараженной клиническим материалом. В таблице 20 приведены данные о недостатках и достоинствах этих 
методов. 

Таблица 18. Сравнительная чувствительность прямых методов исследования (ПИФ, ПЦР, ИФА) при 
выявлении Сhl.trachomatis в клинических образцах

Методы детекции 

Выявление хламидий (в %) в одних и тех же пробах 

ПИФ 

68,9 

ПЦР 

94,8 

ИФА 

25,62 

Таблица 19. Сравнительная чувствительность прямых методов исследования (ПИФ, ПЦР) при 
выявлении Chl.trachomatis в клеточной культуре, зараженной клиническим материалом

Методы детекции 

Выявление хламидий (в %) в одних и тех же пробах 

ПИФ 

94 

ПЦР 

96,2 

Изменения иммунного статуса при хламидийной инфекции

    При хламидийной инфекции происходят изменения как клеточного, так и гуморального звеньев 
иммунитета. В настоящее время доказано, что при хламидиозе начинают развиваться следующие защитные 
иммунологические реакции:

-локальное образование секреторного иммуноглобулина А;

-цитотоксическая защита посредством Т-лимфоцитов;

-образование антител классов IgM, IgA, IgG к хламидийному липополисахаридному антигену.

    Изменения показателей иммунитета системы при острых поражениях нижнего отдела урогенитального 
тракта (уретрит, цервицит), как правило, неотчетливы. При хронизации и распространении процесса 
(спальпингит, простатит, артриты) они приобретают стойкий характер.

    У больных хламидийной инфекцией отмечается снижение уровеня нейтрофилов и повышение содержания
эозинофилов. При исследовании клеточного звена иммунитета непрямым иммунофлюоресцентным методом
с помощью моноклональных антител, определении концентрации IgG,A,M методом радиальной 
иммунодиффузии могут выявляться следующие нарушения: в гуморальном звене - снижение IgG и IgA при 
снижении относительного содержания клеток СД 72 (В-лимфоцитов). Дисбаланс клеточного звена 
иммунитета выражается в достоверном снижении клеток СД4 (относительное содержание), тенденции к 
повышению СД8, очевидно, за счет роста цитотоксических клеток и, как следствие, снижение 
иммунорегуляторного индекса. Факторы неспецифического иммунитета характеризуются значительным 
повышением относительного содержания популяции естественных киллеров, а также недостаточной 
функциональной активностью опсоно-фагоцитарной системы.

    Для клинициста такое иммунологическое обследование больного хламидийной 
инфекцией необходимо для обоснованного назначения иммуномодулирующих 
препаратов, в частности, оказывающих стимулирующее действие на нейтрофильно-
фагоцитарное и Т-клеточное звено иммунитета. Необходимо осуществлять 
индивидуальный подбор иммуномодуляторов на основании изучения функциональной 
активности полиморфноядерных лейкоцитов системы фагоцитоза методом 
люминолзависимой хемолюминесценции (ЛЗХЛ). Основанием для назначения того или 
иного препарата является максимальное по сравнению с другими повышение активности 
фагоцитов, детектируемое амплитудой вспышки ЛЗХЛ в момент внесения данного 
препарата в исследуюмую пробу крови.

Основные принципы лечения больных хламидийной инфекцией

    Имеющиеся сведения об этом инфекционном процессе позволяют высказать ряд положений, которые 
следует учитывать при лечении хламидиоза. Chl.trachomatis высоко адаптированы к жизни внутри клеток, 
что обуславливает трудности ее элиминации в процессе фагоцитоза. Клетка организма-хозяина 
используется хламидиями как поставщик строительного материала и энергии для размножения и 
персистенции, а также для диссеминации возбудителя, как это отмечено на примере возникновения 
хламидийного менингоэнцефалита после массажа уретры или простаты. Проницаемость клеточных мембран
для большинства антибиотиков низкая, их концентрация внутри клетки не достигает того уровня, который 
создается в крови. Пока еще неизвестно, на какую стадию развития хламидий действуют антибиотики. 
Латентность и тенденция к внезапному проявлению свежих поражений характерны для хламидийной 
инфекции как до лечения, так и после него за счет сохранения жизнеспособных элементов хламидий внутри 
эпителиальных клеток аналогично тому, как они сохраняются в культуре клеток, подвергнутой действию 
антибиотика. После нескольких пассажей на свежих клеточных культурах снова появляются 
внутриклеточные включения из сохранившихся жизнеспособных телец. Персистирование хламидий в 
организме у части больных в течение ряда лет, несмотря на проведенное лечение, свидетельствует о том, 

что у разных больных курсы лечения антибиотиками дают разные результаты, в особенности при 
осложненных формах (А.М.Савичева, М.А. Башмакова, 1998).

Оценка риска меланомы

1. Выясняют, не было ли в семье случаев меланомы или диспластических невусов 

(крупных, неправильных, бросающихся в глаза родимых пятен). Внимание: под 
словами «рак кожи» может скрываться как собственно рак, так и меланома, 
поэтому высказывания больного интерпретируют с осторожностью.

2. Определяют тип светочувствительности кожи. Для этого достаточно задать 

вопрос: «Легко ли вы загораете?»

• Если больной ответил «Да», у него III или IV тип светочувствительности кожи.
• Если больной ответил «Нет», у него1 или II тип светочувствительности кожи. 

Риск меланомы значительно выше у людей со светочувствительностью кожи I и II типов.

3. Осматривают кожные покровы и подсчитывают количество пигментных 

невусов. Наличие более 50 невусов диаметром > 2 мм означает повышенный 
риск меланомы. (Об этом же свидетельствуют и другие признаки, например, 
рыжие волосы и веснушки, даже если у больного совсем нет невусов.) 
Внимательно осматривают пальцы рук и ног, ладони, подошвы и слизистые, 
особенно у представителей цветных рас; не забывают и о волосистой части 
головы. 

4.  Определяют тип обнаруженных невусов.
• Приобретенные невоклеточные невусы имеют диаметр менее 5 мм и, как 

правило, отчетливо возвышаются над уровнем кожи.

• Диспластические невусы выглядят плоскими (хотя при боковом освещении 

видно, что это не так), обычно имеют большие размеры (5 мм и более), темную, 
неравномерную окраску, неправильную форму и размытые границы.

• Врожденные невоклеточные невусы присутствуют с первой-второй недели 

жизни. Время появления невуса подтверждают детские фотографии больного и сведения, 
полученные от родителей или других родственников. Эти невусы приподняты над 
уровнем кожи, часто бывают покрыты терминальными волосами и имеют бугристую 
поверхность. Размеры невуса не имеют значения.

ОЦЕНКА ТЯЖЕСТИ 

АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА 

ПО МЕЖДУНАРОДНОЙ СИСТЕМЕ SCORAD 

(SEVERITY SCORING OF ATOPIC DERMATITIS: THE SCORAD–INDEX)

Для   оценки   тяжести   атопического   дерматита,   экспертизы

инвалидности   важно   определение   клинической   формы   АД,
площади   поражения,   интенсивности   зуда,   степени   нарушения
сна.   В   этом   плане   заслуживает   внимания   система   балльной
оценки   степени   тяжести   АД —  SCORAD  (Scoring  of  Atopic
Dermatitis —   шкала   атопического   дерматита),   разработанная
группой   ученых   европейских   стран.   Оценка   проводится   в
четыре этапа.

I  этап.   Определение   и   оценка

признаков

 

интенсивности

(объективные симптомы)

В   системе  SCORAD  выделено 6   признаков: 1)   эритема

(гиперемия), 2) отек / папулообразование, 3) мокнутие / корки, 4)
экскориация,

 

5) лихенификация, 6) сухость.

Каждый   признак   оценивается   от 0   до 3   баллов   (0 —

отсутствие, 1 —   легкий, 2 —   средний, 3 —   тяжелый)   согласно
рекомендованным

 

фотографиям

 

(доступны

 

в

дерматологических атласах и в сети Интернет, например, http://
childderm.rusmedserv.com).   Полубалльные   оценки   не
разрешаются.  Оценки  в  баллах  выставляются  в  специальной
оценочной   таблице,   затем   общий   индекс

 SCORAD

рассчитывается по формуле, приведенной ниже.

Область, выбранная для оценки, должна представлять каждый

признак   со   средней   интенсивностью,   исключая   область–
мишень или область наибольшего поражения. Однако, одна и
та же область может быть выбрана для 2-х и более признаков.
Например, одна и та же область может служить для оценки как
экскориаций, так и эритемы. С другой стороны, сухость может
быть выражена на областях, не имеющих острых высыпаний
или лихенификаций.

II  этап.   Расчет   площади   поражения

кожных покровов

Площадь поражения оценивается у детей по правилу «девяток»

и   детально   изображается   на   оценочном   рисунке   (рис. 6)
контуров   тела   ребенка   спереди   и   сзади   с   поправками
(относительно   головы   и   нижних   конечностей)   для   больных
до 2-летнего   возраста.   Очаги,   принимаемые   во   внимание,
должны   иметь   только   воспалительное   поражение,   но   не
сухость.   Обратите   внимание,   что   одна   ладонь   больного
составляет 1% всей кожной поверхности.

III 

этап.   Оценка   субъективных

признаков

Они включают зуд и нарушение сна. Больной (обычно старше 7

лет) или его (её) родители должны ответить полно и правильно
на ваши вопросы по этой теме. Попросите больного (или его
родителей)   указать   на 10-см   оценочной   шкале   пункт,