Том 3. Справочник по кожным болезням - часть 8

Сыворотки крови положительные и слабоположительные получают из крови кроликов,

зараженных патогенными бледными трепонемами (штамм Никольса), отрицательные - из крови
здоровых кроликов.

Сухие сыворотки крови выпускают в ампулах по 1 мл. В день постановки реакции сыворотку крови

растворяют добавлением изотонического раствора натрия хлорида для восстановления
первоначального (до высушивания) объема.

После полного растворения сыворотки крови инактивируют при 56град. в течение 30 минут.

Положительные и слабоположительные сыворотки крови должны давать задержку гемолиза на 4+ и 2+
соответственно при разведении 1:5 по качественной методике постановки реакции Вассермана с
кардиолипиновым и трепонемным антигенами.

Если рабочая доза комплемента выбрана неправильно (избыток комплемента), то со

слабоположительной сывороткой крови будет получен отрицательный результат реакции; при
недостатке комплемента наблюдается задержка гемолиза с контрольной отрицательной сывороткой
крови и в контроле испытуемых сывороток крови (3-й ряд пробирок).

Источники ошибок:
- нарушение условий и методики постановки реакции;
- несоблюдение условий и срока хранения испытуемой сыворотки крови, антигенов, комплемента,

эритроцитов барана;

- изменение процентного содержания натрия хлорида;
- неправильно выбранная рабочая доза комплемента (избыток или недостаток его в опыте);
- исключение из постановки реакции контрольных положительных и слабоположительных

сывороток крови;

- использование при постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток, химических стаканов,

мерных цилиндров.

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА

Определение титра реагинов и противотрепонемных антител в положительных сыворотках крови

производится   путем   исследования   в   реакции   связывания   комплемента   уменьшающихся   объемов
сыворотки   крови,   разведенной   изотоническим   раствором   натрия   хлорида.   Количественный   метод
постановки   реакции   Вассермана   ставят   с   положительными   сыворотками   крови,   давшими   4+   с
кардиолипиновым или трепонемным антигенами.

Сыворотки крови повторно инактивируют 15 минут при 56 град. в инактиваторе. Каждую сыворотку

крови исследуют в 8 пробирках, (таблица N 6). В первую пробирку наливают 0,8 мл изотонического
раствора натрия  хлорида, со второй по 7-ю пробирку - по 0,25 мл изотонического раствора натрия
хлорида. В первую пробирку вносят 0,2 мл испытуемой сыворотки крови, перемешивают, затем 0,25 мл
удаляют, а по 0,25 мл переносят во вторую и восьмую пробирки. После перемешивания переносят 0,25
мл из второй пробирки в третью, из третьей - в четвертую и т.д. - до седьмой пробирки, из которой 0,25
мл   разведенной   сыворотки   крови   удаляют.   Затем   приливают   по   0,25   мл   разведенного
кардиолипинового антигена, разведенного по титру, с первой по седьмую, а в 8-ю пробирку 0,25 мл
изотонического раствора натрия хлорида. После легкого встряхивания по все пробирки приливают по
0,25 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе. Первичная инкубация в термостате при 37 град.
продолжается 45 минут, после чего во все пробирки приливают по 0,5 мл гемолитической системы.
Встряхнув   пробирки,   их   помещают   в   термостат   при   37   град.на   45-60   минут   и   после   наступления
полного гемолиза в восьмой (контрольной) пробирке регистрируют результаты реакции.

Оценка результатов. Титром реагинов исследуемой сыворотки крови является последнее

разведение, давшее задержку гемолиза.

В выдаваемых лабораторией анализах при наличии резкоположительной реакции (4+) указывают,

с каким титром испытуемой сыворотки получена положительная реакция.

Количественное определение реагинов имеет значение при оценке эффективности

противосифилитического лечения. Быстрое снижение титра реагинов свидетельствует об успешности
терапии. Длительно не снижающийся титр реагинов указывает на отсутствие эффективности терапии и
необходимости ее изменения.

Источники ошибок. Те же, что и при качественной методике постановки реакции Вассермана.

Таблица N 6

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА

Љ”””””””””””””””””””””””’””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””Ї
ЈИнгредиенты (в мл)     Ј                 NN пробирок                  Ј
Ј(общий объем - 1,25 мл)“”””””’”””””’””””””’””””’”””””’””””””’””””’””””¤
Ј                       Ј  1  Ј  2  Ј  3   Ј 4  Ј  5  Ј  6   Ј 7  Ј 8  Ј
“”””””””””””””””””””””””•”””””‘”””””‘””””””‘””””‘”””””‘””””””‘””””‘””””¤
ЈИзотонический раствор  Ј 0,8   0,25  0,25  0,25  0,25  0,25  0,25  -  Ј
Јнатрия хлорида         Ј                                              Ј
ЈИспытуемая инактивиро- Ј 0,2  -0,25 -0,25 -0,25 -0,25 -0,25 -0,25 0,25Ј
Јванная сыворотка крови Ј                                              Ј
“”””””””””””””””””””””””•””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤
Ј                       ЈПосле перемешивания  из  I  пробирки  0,25  млЈ
Ј                       Јудаляют,  а во II и VIII пробирки переносят поЈ
Ј                       Ј0,25 мл.  Из II пробирки  после  перемешиванияЈ
Ј                       Јпереносят   последовательно   из   пробирки  вЈ
Ј                       Јпробирку (из II в III,  из III в IV и т.д.  доЈ
Ј                       ЈVII пробирки включительно) по 0,25 мл.  Из VIIЈ
Ј                       Јпробирки 0,25 мл удаляют.  Получают разведенияЈ
Ј                       Јсыворотки крови:                              Ј
Ј                       Ј 1:5   1:10  1:20  1:40  1:80  1:160 1:320 1:5Ј
“”””””””””””””””””””””””•””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤
ЈАнтиген, разводимый по Ј                                              Ј
Јтитру (кардиолипиновый Ј 0,25  0,25  0,25  0,25  0,25  0,25  0,25  -  Ј
Јили трепонемный)       Ј                                              Ј
“”””””””””””””””””””””””‘””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤
ЈИзотонический раствор     -     -     -     -     -     -     -    -  Ј
Јнатрия хлорида                                                        Ј
Ј                                                                      Ј
ЈКомплемент,                                                           Ј
Јразведенный по рабочей   0,25  0,25  0,25  0,25  0,25  0,25  0,25 0,25Ј
Јдозе                                                                  Ј
“””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤
Ј        Встряхнуть, поместить в термостат при 37 град. С на 45 минут  Ј
“””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤
ЈГемолитическая система   0,5   0,5   0,5   0,5   0,5   0,5   0,5  0,5 Ј
“””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤
Ј   Встряхнуть, поместить в термостат при 37 град. С на 45 - 60 минут  Ј
Ј       до наступления полного гемолиза в контрольной пробирке         Ј
“””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤
ЈРезультат              4+      4+       4+      3+    -    -    -    -Ј
“””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤
Ј            В данном случае титр сыворотки крови 1 : 40               Ј
ђ””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””‰

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА

СО СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТЬЮ

В спинномозговой жидкости больного сифилисом могут находиться противотрепонемные

антитела и реагины, способные вступать в реакцию связывания комплемента с соответствующими
антигенами.

Реакцию ставят с непрогретой спинномозговой жидкостью, ввиду отсутствия в ней комплемента.
Мутную или с примесью крови жидкость центрифугируют и отсасывают надосадочную жидкость.
Спинномозговую жидкость параллельно исследуют в трех дозах:
1) неразведенную; 2) разведенную изотоническим раствором натрия хлорида 1:2; 3) разведенную

изотоническим раствором натрия хлорида 1:5 (таблица N 7).

Реакцию производят с двумя антигенами параллельно - трепонемным и кардиолипиновым - с

каждым разведением спинномозговой жидкости по схеме (таблица N 7).

Ввиду отсутствия антикомплементарных свойств спинномозговой жидкости для ее исследования

комплемент в реакцию вводят по титру (первая растворяющая доза без обычной надбавки). Для

повышения качества ликвородиагностики сифилиса реакцию связывания комплемента рекомендуется
заменять РИФ-ц или новой модификацией РИТ, методика постановки которой изложена ниже.

Оценка результатов.
Результаты реакции учитывают отдельно для каждой антигена и разведения спинномозговой

жидкости. Для обозначения позитивности реакции Вассермана со спинномозговой жидкостью
пользуются системой четырех плюсов, описанной выше.

Таблица N 7

МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА

СО СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТЬЮ

Љ”””””””””””””””””””””””’””””””””””””””””””””””””””””””””””””Ї
ЈИнгредиенты (в мл)     Ј          NN пробирок               Ј
“”””””””””””””””””””””””•””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””””¤
Ј(общин объем-1,25 мл)  Ј  1 Ј 2  Ј 3  Ј 4  Ј 5  Ј 6  Ј 7    Ј
Ј                       Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј(кон- Ј
Ј                       Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Јтроль)Ј
“”””””””””””””””””””””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””””¤
ЈСпинномозговая жидкость 0,05 0,05 0,13 0,13 0,25 0,25 0,25  Ј
Ј                                                            Ј
ЈИзотонический раствор   0,2  0,2  0,12 0,12  -    -   0,25  Ј
Јнатрия 5 хлорида                                            Ј
Ј                                                            Ј
ЈАнтиген трепонемный,    0,25   -  0,25   -  0,25  -    -    Ј
Јразведенный по титру                                        Ј
Ј                                                            Ј
ЈАнтиген кардиолипиновый, -   0,25  -   0,25  -   0,25  -    Ј
Јразведенный по титру                                        Ј
Ј                                                            Ј
ЈКомплемент, разведенный 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25  Ј
Јпо титру                                                    Ј
ђ””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””‰
Встряхнуть, поместить в термостат при 37 град. С на 45 минут
Љ””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””Ї
ЈГемолитическая система  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5  0,5   Ј
“””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤
ЈВстряхнуть, поместить                                       Ј
Јв термостат при 37                                          Ј
Јград. С на 45-60 минут                                      Ј
Јдо наступления                                              Ј
Јгемолиза в контрольной                                      Ј
Јпробирке                                                    Ј
ђ””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””‰

Источники ошибок.
Нарушение условий и методики постановки реакции. Несоблюдение условий и срока хранения

спинномозговой жидкости, антигенов, комплемента, эритроцитов барана. Изменение процентного
содержания натрия хлорида. Неправильно выбранная рабочая доза комплемента (избыток или
недостаток его в опыте).

Использование при постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток, химических стаканов,

мерных цилиндров.

РЕАКЦИЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЛЕДНЫХ ТРЕПОНЕМ

Принцип. Реакция основана на феномене потери бледными трепонемами подвижности в

присутствии иммобилизирующих противотрепонемных антител исследуемой сыворотки крови и
комплемента в условиях анаэробиоза. Постановке реакции предшествует подготовительная работа.

Обработка лабораторной посуды. Вся лабораторная посуда (пипетки, пробирки, флаконы, и т. п.),

используемая   для   постановки   реакции   иммобилизации   трепонем,   должна   быть   стерильной.   Перед
стерилизацией ее моют без применения дезинфицирующих средств. Для этого после опыта пробирки и
флаконы погружают в мыльную воду комнатной температуры, кипятят в течение 40 минут, охлаждают
до  40град.   и  моют  водопроводной   сначала   теплой,   а  затем  холодной   водой,  наливая   ее в  каждую
пробирку 5-7 раз, после чего 1 раз промывают дистиллированной водой и высушивают в сушильном
шкафу. Высушенную посуду завертывают в бумагу и стерилизуют автоклавированием  в течение 30
минут при 2 атмосферах по манометру. После стерилизации посуду вновь высушивают в сушильном
шкафу и хранят в боксе в течение 7 дней.

1. Получение исследуемой сыворотки крови и ее обработка. Перед взятием крови обследуемый

не должен получать медикаменты, особенно препараты пенициллина. Прием препаратов отменяют на
срок их возможной задержки в организме. После отмены бициллина кровь берут через 1 месяц. При
использовании пенициллиназы при постановке реакции прекращение введения препаратов
пенициллина не обязательно.

Кровь для реакции берут из локтевой вены натощак стерильно, в сухую, химически чистую и

стерильную пробирку. Кожу локтевого сгиба перед проколом протирают 70 % спиртом. Взятую кровь
обрабатывают   так   же,   как   для   реакции   Вассермана,   но   с   соблюдением   условий   стерильности.   В
реакции   используют   сыворотку   крови,   инактивированную   в   течение   30   минут   в   водяной   бане   при
56град. для исключения действия  неспецифических иммобилизинов. При необходимости повторного
исследования одной и той же сыворотки крови ее инактивирование проводят повторно, но в течение 15
минут. Перед исследованием сыворотку крови можно хранить в холодильнике в течение 10-15 дней при
-10 град. С., а при 4 град. С в течение 5 дней. Никаких консервантов в сыворотку крови не добавляют.

В реакции можно исследовать сыворотки крови, высушенные на вощаной бумаге, с добавлением

по 3 капли на каждые 0,5 мл сыворотки крови свежеприготовленного 40% раствора пищевого сахара.
Такие сыворотки крови должны быть исследованы не позднее 5 дней после высушивания в южных
районах страны, а также в летнее время года, не позднее 10 дней на остальных территориях страны.
Следует помнить, что результаты исследования сыворотки крови с невысоким содержанием антител
негативируются быстрее, поэтому не следует широко применять высушенные сыворотки крови. Для
растворения к высушенным сывороткам крови, помещенным в пробирку, добавляют 0,9%
изотонический раствор натрия хлорида, восстанавливая их первоначальный объем, после растворения
стерилизуют кварцеванием в течение 30 минут, расположив пробирки на расстоянии 0,5 метра от
кварцевой лампы.

2. Среда выживания для бледных трепонем. Период от момента постановки реакции до

регистрации ее результатов длится 18-20 часов, поэтому для сохранения жизнеспособности и хорошей
подвижности микроорганизмов  необходима среда  выживания. Рекомендуется  среда N 2 ЦКВИ.  Для
приготовления среды берут 50 г говяжьего или кроличьего мяса, освобождают его от жира и сухожилий,
измельчают, заливают 100 мл водопроводной воды и помещают в холодильник на 24 часа при 4 град.
С для экстрагирования. На следующий день кипятят в течение 10 минут кроличье мясо и 20 минут
говяжье,   охлаждают   и   фильтруют   через   многослойный   бумажный   фильтр.   После   фильтрования
устанавливают   рН=7,2-7,4   добавлением   20%   раствора   едкого   натрия.   Приготовленную   среду
стерилизуют автоклавированием в течение 20 минут при 1 атмосфере по манометру и ампулируют.
При   условии   сохранения   стерильности   среда   пригодна   для   использования   в   течение   12   месяцев.
Ампулы со средой хранят в холодильнике при 4 град. С. Каждую новую партию среды вводят в опыт
параллельно со старой средой для выяснения ее качеств. При невозможности приготовления среды
можно пользоваться 0,9% раствором натрия хлорида промышленного производства.

3. Комплемент. В реакции иммобилизации используют избыток комплемента. В реакции

применяют комплемент морской свинки. Количество его в значительной степени зависит от среды
выживания для бледных трепонем. При использовании среды N 2 ЦКВИ в микроанаэростатном методе
количество комплемента составляет 27% от общего объема используемых в реакции реагентов, а при
постановке в меланжерах - 40%.

Для получения комплемента кровь берут обязательно у нескольких морских свинок так же, как для

реакции Вассермана, но с соблюдением условий стерильности. После получения сыворотки крови ее
наливают в стерильные пробирки по 1-4 мл и исследуют на стерильность. Для этого 1 мл сыворотки
крови морской свинки оставляют в термостате при 37 град. С на сутки. В случае бактериального
загрязнения комплемент бракуют. Пробирки с комплементом хранят в холодильнике при -10 град. С в
течение 2-3 недель. Повторное замораживание и оттаивание не рекомендуется. Нельзя применять в
реакции иммобилизации бледных трепонем консервированный комплемент, т.к. он токсичен для
микроорганизмов. Лиофильно высушенный без консерванта комплемент морской свинки также нельзя
использовать в реакции, т.к. по качеству он хуже свежего.

4. Антиген. В качестве антигена в реакции применяют взвесь бледных трепонем из раннего орхита

кролика   (7-9   суток   после   заражения).   Используют   бледные   трепонемы   штамма   Никольса,   которые
еженедельно   пассируют   на   кроликах.   Зараженных   кроликов   содержат   в   светлых   проветриваемых
помещениях.   Кормят   полноценной   пищей,   содержащей   витамины   (морковь   -   обязательно).   Для
заражения следует брать здоровых кроликов - самцов весом 2,5-3 кг с отрицательным результатом
серологических реакций на сифилис (КСР и РИТ). За 1-2 суток до заражения у кроликов выстригают
шерсть  в  нижней  части  живота,  внутренней  поверхности   бедер и  мошонки.  Для  получения   раннего
специфического орхита кролика заражают введением внутрь каждого яичка по 1 мл взвеси бледных
трепонем. Во взвеси должно содержаться более 50 микроорганизмов в каждом поле зрения микроскопа
при использовании окуляра 7 х и объектива 40.

Введение животным гидрокортизона для подавления иммуногенеза не является строго

обязательным. Применение его рекомендуется при уменьшении в яичках числа бледных трепонем при
повторных пассажах (менее 50 при исследовании в темном поле зрения). Гидрокортизон вводят
внутримышечно в дозе 20 мг перед заражением и в последующие 4-6 дней - 10 мг.

О появлении орхита свидетельствует увеличение размеров яичка и его уплотнение. Для удаления

яичек кролика привязывают к станку, обескровливают пункцией сердца под эфирным наркозом, если
кролик при этом не погибает, его забивают воздушной эмболией - введением 20 мл воздуха в сердце
или в вену уха. Яички выводят через паховый канал в мошонку, поглаживая по животу от середины
вниз   до   мошонки.   Поверхность   кожи   мошонки   накрывают   стерильной   резиновой   салфеткой   с
разрезами, через которые выводят яички. Кожу мошонки над яичками протирают тампоном, смоченным
эфиром, приподнимают ее пинцетом сначала над одним яичком и делают разрез ножницами, через
который  выводят   яичко  вместе с  оболочками,   отрезают  его  у  основания  ножницами  и  помещают  в
стерильную чашку Петри. Далее в условиях бокса каждое яичко освобождают от оболочек, придатков и
жира. Помещают в стерильный бокс, разрезают на 10-14 частей, заливают 5 мл среды N 2 ЦКВИ и
полученную взвесь исследуют в микроскопе с конденсором темного поля зрения на наличие бледных
трепонем.   Для   этого   на   предметное   стекло   пастеровской   пипеткой   наносят   по   капле   жидкости   из
каждого бокса. При наличии трепонем кусочки яичка вместе со средой из бокса переносят во флакон
емкостью  50 мл и встряхивают  во встряхивателе  для  вымывания  микроорганизмов  из ткани  яичка.
Время   встряхивания   зависит   от   числа   обнаруженных  микроорганизмов.   При   наличии   5-10   бледных
трепонем 1 поле зрения встряхивание длится в течение часа, а при наличии 30-40 трепонем - только
20-30   минут.   После   встряхивания   содержимое   флакона   переносят   в   стерильную   центрифужную
пробирку и центрифугируют в течение 5 минут, при 1000 об/мин для осаждения эритроцитов и кусочков
тканей   яичка.   Надосадочную   жидкость   переносят   в   другую   стерильную   пробирку,   из   нее   готовят
препараты   на   предметном   стекле,   которые   исследуют,   как   было   выше   описано,   определяя
приблизительное число бледных трепонем в нескольких полях зрения.

Содержащуюся в пробирке густую взвесь бледных трепонем набирают в шприц и заражают

подготовленных кроликов введением 1,0 мл взвеси внутрь каждого яичка.

Для приготовления антигена взвесь бледных трепонем разводят средой N 2 ЦКВИ так, чтобы в

поле зрения было 10-15 микроорганизмов. Например, если во взвеси содержится 1000-1500
микроорганизмов в каждом поле зрения (т. е. трепонемы густо покрывают все поле зрения), то на 9,9
мл среды добавляют 0,1 мл взвеси трепонем и получают разведение в 100 раз.

5. Гемолитическая система. Дефибринированную баранью кровь или эритроциты барана в

объеме,   необходимом   для   работы   в   данный   день,   центрифугируют,   плазму   отсасывают,   а   осадок
трижды   отмывают   6-7   объемами   0,9%   изотонического   раствора   натрия   хлорида.   При   последнем
промывании надосадочная жидкость должна быть бесцветной. Из плотного осадка готовят 2% взвесь
эритроцитов   барана   в   том   же   растворе.   Нужный   объем   гемолитической   сыворотки,   разведенной   в
изотоническом растворе натрия хлорида по утроенному титру (например, если на этикетке указан титр
1:1200, то для разведения используют титр 1:400, т. е. 0,1 мл гемолитической сыворотки на 39,9 мл
изотонического   раствора   натрия   хлорида)   объединяют   с   равным   объемом   2%   взвеси   эритроцитов
барана.   Раствор   гемолитической   сыворотки   приливают   к   взвеси   эритроцитов   барана   и   производят
быстрое смешивание. Полученную гемолитическую систему выдерживают в термостате 30 минут при
37град. С.

ОСНОВНОЙ ОПЫТ

Постановку реакции проводят в боксе. Каждую сыворотку исследуют в двух пробирках: опытной и

контрольной.

Таблица N 10

СХЕМА РЕАКЦИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ БЛЕДНЫХ ТРЕПОНЕМ

(МИКРОАНАЭРОСТАТНАЯ МЕТОДИКА)

Љ”””””””””””””””””””’””””””’”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””Ї
ЈИнгредиенты (мл)   Ј Опыт Ј      Контроли ингредиентов            Ј
Ј                   “””””””‘”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””¤
Ј                   Ј                  NN пробирок                 Ј
Ј                   “”””””’”””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””’””””¤
Ј                   Ј  1  Ј  2  Ј 3  Ј 4  Ј 5  Ј  6 Ј 7  Ј 8  Ј 9  Ј
Ј                   Јопыт-Јконт-Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј
Ј                   Јная  Јроль-Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј
Ј                   Ј     Јная  Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј    Ј
“”””””””””””””””””””•”””””‘”””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””‘””””¤
ЈИсследуемая        Ј0,05  0,05   -    -    -    -     -   -    -  Ј
Јинактивированная   Ј                                              Ј
Јсыворотка крови    Ј                                              Ј
Ј                   Ј                                              Ј
ЈКомплемент активныйЈ0,15   -    0,15  -   0,15  -   0,15  -    -  Ј
Ј                   Ј                                              Ј
ЈКомплемент         Ј -    0,15   -   0,15  -   0,15  -   0,15  -  Ј
Јинактивированный   Ј                                              Ј
Ј                   Ј                                              Ј
ЈАнтиген            Ј0,35  0,35  0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35Ј
Ј                   Ј                                              Ј
ЈПоложительная      Ј -     -    0,05 0,05  -     -   -     -    - Ј
Јинактивированная   Ј                                              Ј
Јсыворотка крови    Ј                                              Ј
Ј                   Ј                                              Ј
ЈОтрицательная      Ј -     -     -    -   0,05 0,05  -     -    - Ј
Јинактивированная   Ј                                              Ј
Јсыворотка крови    Ј                                              Ј
ђ”””””””””””””””””””‘””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””‰

В обе пробирки вносят по 0,05 мл исследуемой сыворотки крови и по 0,35 мл антигена. В опытную

пробирку   наливают   0,15   мл   активного   комплемента,   а   в   контрольную   такое   же   количество
инактивированной   сыворотки   крови   морской   свинки.   После   заполнения   содержимое   пробирок
перемешивают   легким   встряхиванием   и   помещают   в   микроанаэростат.   Из   микроанаэростата   с
помощью   вакуумного   насоса   удаляют   атмосферный   воздух   и   заполняют   его   газовой   смесью   из
баллона,   в   котором   содержится   азот   (95   частей)   и   углекислый   газ   (5   частей).   При   заполнении
микроанаэростата газовой смесью следят за тем, чтобы стрелка манометра не доходила до нулевого
уровня. В этом случае удается избежать повышения давления внутри анаэростата выше атмосферного
в   связи   с   перемещением   его   из   комнаты   в   термостат   с  температурой   35   град.,   а   также   позволяет
следить за герметичностью этого прибора. Микроанаэростат с пробирками помещают в термостат на
18-20 часов.

При постановке реакции применяют 5 контрольных исследований: с заведомо положительной и

отрицательной сыворотками крови, взятыми из предыдущего опыта, с активным и инактивированным
комплементом  и средой выживания  для бледных трепонем. Контрольную  отрицательную  сыворотку
крови   применяют   для   суждения   о   степени   подвижности   бледных   трепонем   в   данном   опыте.
Контрольную положительную сыворотку крови - для оценки степени иммобилизирующей активности в
условиях   данного   опыта.   Сыворотки   крови   исследуют   по   вышеописанной   методике.   Исследование
активного   и   инактивированного   комплемента   и   среды   проводят   для   определения   их   влияния   на
подвижность бледных трепонем (таблица N 10).

Разлив ингредиентов при постановке реакции производят в боксе, предварительно облученном

бактерицидной кварцевой лампой в течение 45-60 минут.

Оценку полученных результатов проводят через 18-20 часов. Пробирки вынимают из термостата и

микроанаэростата и расставляют в штативе попарно (опытная и контрольная). Из каждой пары
пробирок пастеровской пипеткой наносят капли пронумерованные соответственно опытным пробиркам
на предметные стекла, накрывают покровными стеклами 20х20 мм и исследуют в микроскопе с
конденсором темного поля зрения с объективом 40, окуляром 10 х . Просматривают несколько полей

зрения в разных участках препарата, подсчитывая в каждом число подвижных и неподвижных бледных
трепонем. Подсчет начинают с препарата из контрольной, а затем из опытной пробирки.

В препарате подсчитывают не менее 25 трепонем и отмечают, сколько из них подвижных и

сколько неподвижных.

Если в опытном препарате содержится 13-19 подвижных бледных трепонем, то для получения

более достоверного результата необходимо сосчитать не 25, а 50 микроорганизмов, также отмечая
среди них число подвижных и неподвижных. При подсчете 50 бледных трепонем полученное число
подвижных микроорганизмов делят на 2.

Если в контрольном препарате содержится меньше 17 подвижных трепонем из 25 подсчитанных,

то такой опыт не пригоден и исследование данной сыворотки крови следует повторить. В контрольных
пробирках с инактивированным комплементом отсутствие подвижных трепонем объясняется
токсичностью исследуемой сыворотки крови, чаще всего вследствие примеси медикаментов, иногда
бактериальным загрязнением.

При определении подвижности бледных трепонем следует обращать внимание на интенсивность

движений, совершаемых бледной трепонемой. У бледной трепонемы не всегда можно наблюдать
сгибательные и контрактильные движения и иногда только вращательные. Следует также уметь
отличать активные движения трепонем от движения с током жидкости.

Расчет процента специфической иммобилизации бледных трепонем производят по следующей

формуле:

                          A - В
                      Х = ------ x 100, где
                            А
    А - число подвижных бледных трепонем в контрольной пробирке;
    В - число подвижных бледных трепонем в опытной пробирке;
    Х - процент иммобилизации.

    Пример:       24 - 21
             Х = -------- х 100 = 12%
                    24

В практической работе процент иммобилизации определяют по заранее составленной таблице (N

11) с применением вышеуказанной формулы. Реакция иммобилизации считается отрицательной, когда
процент иммобилизации колеблется в пределах 0-20, сомнительной от 21 до 30, слабоположительной
от 31 до 50 и положительной выше 50. Сыворотки крови с сомнительными и слабоположительными
результатами реакции нуждаются в повторном исследовании для получения более достоверных
результатов. Целесообразно также подвергать повторному исследованию все сыворотки крови, давшие
полное расхождение результатов с результатами стандартных серологических реакций. Эти сыворотки
крови заслуживают особого внимания, так как в этих случаях результаты реакции иммобилизации
бледных трепонем дают возможность судить о наличии или отсутствии сифилиса у обследуемого лица.

Определение остаточного комплемента. Определение остаточного комплемента необходимо для

суждения о том, достаточным ли было количество комплемента в опытных пробирках, не была ли
подвижность бледных трепонем обусловлена отсутствием комплемента, вследствие чего
иммобилизины не могли проявить свою активность.

После регистрации результатов реакции иммобилизации бледных трепонем в содержимом

пробирок   определяют   остаточный   комплемент   добавлением   в   каждую   пробирку   гемолитической
системы в объеме 0,1 мл. Пробирки помещают в термостат при 37 град. С на 45 минут. В опытных
пробирках должен наступить гемолиз  эритроцитов,  в контрольных должна быть задержка гемолиза.
Отсутствие  в опытных пробирках гемолиза  указывает  на недостаточное  количество комплемента, в
этих случаях исследование надо повторить . Повторное исследование сыворотки крови не производят
только в том случае, если отмечена 100% иммобилизация бледных трепонем.

    Источники ошибок:
    - токсичность исследуемой сыворотки крови;
    - бактериальное загрязнение исследуемой сыворотки крови
      комплемента, среды;
    - недостаточное количество комплемента в опыте;
    - нарушение  герметичности  микроанаэростата,  проникновение в
      него кислорода из атмосферного воздуха;
    - повышение  или  понижение температуры в термостате в течение

      реакции;
    - кислотность     или    щелочность    лабораторной    посуды,
      использованной при постановке реакции.

Таблица N 11

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТА ИММОБИЛИЗАЦИИ БЛЕДНЫХ ТРЕПОНЕМ

Љ”””””””’””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””Ї
ЈКоли-  Ј        Количество подвижных трепонем в опытных пробирках                     Ј
Јчество Ј                                                                              Ј
Јподви- Ј                                                                              Ј
Јжных   Ј                                                                              Ј
Јтрепо- Ј                                                                              Ј
Јнем в  Ј                                                                              Ј
Јконтро-Ј                                                                              Ј
Јльных  Ј                                                                              Ј
Јприбо- “””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’””’”””¤
Јрах    Ј25Ј24Ј23Ј22Ј21Ј20Ј19Ј18Ј17Ј16Ј15Ј14Ј13Ј12Ј11Ј10Ј9 Ј8 Ј7 Ј6 Ј5 Ј4 Ј3 Ј2 Ј1 Ј0  Ј
“”””””””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘””‘”””¤
Ј  25    0  4  8  12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 92 96 100Ј
Ј  24    0  0  4  8  12 17 21 25 29 33 37 42 46 50 54 58 62 67 71 75 79 83 87 92 96 100Ј
Ј  23    0  0  0  4  9  13 17 22 26 30 35 39 43 48 52 56 61 65 70 74 78 83 87 91 96 100Ј
Ј  22    0  0  0  0  5  9  14 18 23 27 32 36 41 45 50 54 59 64 68 73 77 82 86 91 95 100Ј
Ј  21    0  0  0  0  0  5  10 14 19 24 29 33 38 43 48 52 57 62 67 71 76 81 86 90 95 100Ј
Ј  20    0  0  0  0  0  0  5  10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 35 90 95 100Ј
Ј  19    0  0  0  0  0  0  0  5  11 16 21 26 32 37 42 47 54 58 63 68 74 79 84 89 95 100Ј
Ј  18    0  0  0  0  0  0  0  0  6  11 17 22 28 33 39 44 50 56 61 67 72 78 83 89 94 100Ј
Ј  17    0  0  0  0  0  0  0  0  0  6  12 18 24 29 35 41 47 53 59 65 71 76 82 88 94 100Ј
ђ””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””‰

Примечание: Ответ находят в точке пересечения горизонтальной строки с вертикальным

столбцом, например: 22 подвижных трепонемы в контрольной пробирке и 8 подвижных трепонем в
опытной пробирке соответствует 64% иммобилизации бледных трепонем.

МЕЛАНЖЕРНАЯ МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РИТ

ПО Н. М. ОВЧИННИКОВУ

Анаэробные условия при постановке реакции создаются помещением реагирующей смеси в

меланжер (лейкоцитарный смеситель), оба конца которого закрыты резиновым кольцом. Меланжерная
методика реакции позволяет обходиться без вакуумного насоса, баллона со смесью азота, углекислого
газа, микроанаэростата. При сравнительном изучении на большом клиническом материале получены
результаты, не уступающие классической анаэростатной методике.

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, которая

состоит из следующих этапов:

1. Получение и обработка исследуемой сыворотки крови проводится так же, как и для

микроанаэростатной методики.

2. Приготовление среды для бледных трепонем. Меланжерная методика реакции выполняется с

той же средой, что и микроанаэростатная.

3. Комплемент. Готовится и хранится так же, как и при выполнении микроанаэростатной методики.
4. Антиген. Применяется тот же штамм бледной трепонемы и методика его приготовления та же,

что и для микроанаэростатной методики.

5. Приготовление смеси антигена с комплементом "коктейля". Предварительно в двух стерильных

флаконах или колбах соединяют комплемент с антигеном, взятых в равных объемах. Количество
комплемента и антигена зависит от общего числа исследуемых сывороток крови. На одну сыворотку
крови расходуется 0,15 мл комплемента и столько же антигена. Антиген разливают равными частями в
два стерильных флакона и добавляют в один флакон активный комплемент, а во второй -
инактивированную сыворотку крови морской свинки (таблица N 12).

6. Гемолитическую сыворотку разводят так же, как и для микроанаэростатного метода.
7. Приготовление изотонического раствора хлорида натрия. Растворяют 9,0 г натрия хлорида

химически чистого в 1 литре дистиллированной воды. Раствор фильтруют через бумажный фильтр и
стерилизуют автоклавированием в течение 20 минут при 1 атмосфере по манометру.

содержание .. 6 7 8 9 ..