содержание .. 56 57 58 59 ..
ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 58
Продолжение таблицы 5.5.-1.
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
ρ20
растворе
ρ20
растворе
в процентах
граммов
миллилитров
в процентах
граммов
миллилитров
по
по
в 100
в 100 г при
по
по
в 100
в 100 г при
массе
объему
мл при
взвешивании
массе
объему
мл при
взвешивании
200С
в воздухе
200С
в воздухе
4
29,05
16
75
84
4
29
23
33
76
2
17
30
86
99
2
40
35
43
90
0
29
44
97
37,15
0
50
46
51
45,03
0,9548
41
58
28,07
30
0,9438
61
58
61
17
6
53
72
19
46
6
71
70
70
30
4
65
85
30
51
4
82
82
80
44
2
77
99
41
76
2
93
94
89
58
0
89
36,13
52
92
0
36,03
43,05
98
71
0,9538
30,01
26
62
38,06
0,9428
13
17
34,07
84
6
13
40
73
21
6
24
28
16
97
4
25
53
83
36
4
34
39
25
46,10
2
36
67
94
51
2
45
51
34
23
0
48
80
29,05
66
0
55
62
43
36
0,9528
60
94
16
81
0,9418
65
74
52
49
6
72
37,07
26
96
6
76
85
61
62
4
84
20
36
39,10
4
86
97
70
75
2
95
34
47
25
2
96
44.08
79
88
0
31,07
47
57
40
0
37,07
19
88
47,01
0,9518
18
60
68
55
0,9408
17
30
96
14
6
30
73
78
69
6
27
42
35,06
27
4
41
86
88
84
4
37
53
15
41
2
53
99
98
98
2
47
64
23
53
0
64
38,12
30,09
40,12
0
58
75
32
66
0,9508
76
25
19
27
0,9398
68
86
41
79
6
87
38
29
42
6
78
98
50
93
4
99
51
39
56
4
88
45,09
59
48,06
2
32,10
64
50
70
2
98
20
68
18
0
21
77
60
85
0
38,09
31
76
31
0,9498
33
90
70
41,00
0,9388
19
42
85
43
6
44
39,03
81
14
6
29
53
94
56
4
55
15
90
28
4
39
64
36,02
69
2
66
28
31,00
42
2
49
75
11
82
0
78
40
10
56
0
59
86
20
95
0,9488
89
53
31,20
71
0,9378
69
97
28
49,07
6
33,00
66
30
86
6
79
46,08
37
20
4
11
78
40
99
4
89
19
46
33
2
22
91
50
42,14
2
99
30
54
46
0
33
40,04
60
28
0
39,09
41
63
58
0,9478
44
16
70
42
0,9368
19
52
72
71
6
55
28
79
56
6
29
63
80
84
4
66
41
89
70
4
39
73
88
96
2
77
53
99
84
2
49
84
97
50,08
0
88
65
32,08
98
0
59
95
37,06
21
0,9468
99
78
18
43,12
0,9358
69
47,06
14
34
6
34,10
90
28
26
6
79
17
23
47
4
21
41,02
38
39
4
89
27
31
59
2
32
15
48
54
2
99
38
40
72
0
43
27
57
68
0
40,09
49
48
85
0,9458
54
39
67
81
0,9348
19
59
56
97
6
65
51
76
95
6
29
70
65
51,10
4
76
63
86
44,08
4
38
81
73
22
2
86
75
95
22
2
48
92
82
35
0
97
87
33,05
35
0
58
48,02
90
47
0,9448
35,08
99
14
49
0,9338
68
13
99
60
6
19
42,11
24
63
6
78
23
38,07
72
Продолжение таблицы 5.5.-1.
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
ρ20
растворе
ρ20
растворе
в процентах
граммов
миллилитров
в процентах
граммов
миллилитров
по
по
в 100
в 100 г при
по
по
в 100
в 100 г при
массе
объему
мл при
взвешивании
массе
объему
мл при
взвешивании
200С
в воздухе
200С
в воздухе
4
88
33
15
84
4
09
86
51
46
2
98
44
23
97
2
18
96
59
58
0
41,07
54
31
52,09
0
28
54,06
67
70
0,9328
17
65
40
22
0,9218
37
15
74
81
6
27
75
48
34
6
46
25
82
93
4
36
86
56
46
4
55
34
89
59,05
2
46
96
64
58
2
65
44
97
17
0
56
49,07
73
71
0
74
54
43,05
29
0,9318
65
17
81
83
0,9208
83
63
12
40
6
75
27
89
95
6
92
73
20
52
4
85
38
97
53,08
4
47,01
82
27
63
2
94
48
39,05
20
2
10
92
35
75
0
42,04
58
13
32
0
20
55,01
42
86
0,9308
13
69
22
45
0,9198
29
11
50
98
6
23
79
30
56
6
38
20
57
60,10
4
33
89
38
68
4
47
30
65
22
2
42
99
46
80
2
56
39
72
33
0
52
50,10
54
93
0
65
48
79
44
0,9298
61
20
62
54,05
0,9188
74
58
87
56
6
71
30
70
17
6
83
67
94
67
4
80
40
78
29
4
93
77
44,02
79
2
90
50
86
41
2
48,02
86
09
91
0
43,00
60
94
53
0
11
95
16
61,02
0,9288
09
71
40,02
66
0,9178
20
56,05
24
14
6
18
81
10
78
6
29
14
31
25
4
28
91
18
90
4
38
23
38
37
2
37
51,01
26
55,02
2
47
33
46
49
0
47
11
34
14
0
56
42
53
60
0,9278
56
21
42
26
0,9168
65
51
60
71
6
66
31
50
38
6
75
61
68
83
4
75
41
58
50
4
84
70
75
95
2
85
51
66
62
2
93
79
82
62,06
0
94
61
73
74
0
49,02
89
90
18
0,9268
44,04
71
81
86
0,9158
11
98
97
29
6
13
81
89
98
6
20
57,07
45,04
40
4
23
91
97
56,10
4
29
17
12
53
2
32
52,00
41,04
21
2
38
26
19
64
0
41
10
12
33
0
47
35
26
76
0,9258
51
20
20
45
0,9148
56
44
34
87
6
60
30
28
57
6
65
53
41
98
4
70
40
36
69
4
74
62
48
63,09
2
79
50
44
81
2
83
72
56
21
0
88
60
52
93
0
92
81
63
32
0,9248
98
69
59
57,04
0,9138
50,01
90
70
44
6
45,07
79
67
16
6
10
99
77
55
4
16
89
74
28
4
19
58,08
84
66
2
26
99
82
40
2
28
17
91
77
0
35
53,09
90
52
0
37
26
98
89
0,9238
44
18
97
63
0,9128
46
35
46,05
64,00
6
53
28
42,05
75
6
55
44
12
11
4
63
38
13
88
4
64
54
20
23
2
72
48
21
58,00
2
73
63
27
35
0
81
57
28
11
0
82
72
35
46
0,9228
91
67
36
23
0,9118
91
81
42
57
6
46,00
77
44
35
6
51,00
90
49
68
Продолжение таблицы 5.5.-1.
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
ρ20
растворе
ρ20
растворе
в процентах
граммов
миллилитров
в процентах
граммов
миллилитров
по
по
в 100
в 100 г при
по
по
в 100
в 100 г при
массе
объему
мл при
взвешивании
массе
объему
мл при
взвешивании
200С
в воздухе
200С
в воздухе
4
09
99
56
80
4
95
82
37
97
2
18
59,08
63
91
2
56,03
91
44
71,08
0
27
17
70
65,02
0
12
64,00
51
20
0,9108
36
26
77
14
0,8998
21
08
58
30
6
45
35
84
25
6
30
17
65
42
4
54
44
91
36
4
38
25
71
53
2
63
53
99
48
2
47
34
78
64
0
71
62
47,06
59
0
56
42
84
75
0,9098
80
71
13
70
0,8988
65
51
92
86
6
89
80
20
82
6
73
59
99
97
4
98
89
27
93
4
82
68
51,05
72,08
2
52,07
98
34
66,05
2
91
76
11
19
0
16
60,07
41
16
0
57,00
85
18
30
0,9088
25
16
48
27
0,8978
08
93
25
41
6
34
25
55
39
6
17
65,02
32
53
4
43
34
62
50
4
26
10
38
63
2
52
43
70
61
2
34
18
44
73
0
60
52
77
72
0
43
27
52
85
0,9078
69
60
83
83
0,8968
52
35
58
96
6
78
69
90
95
6
60
43
64
73,06
4
87
78
97
67,06
4
69
52
71
18
2
96
87
48,04
17
2
78
61
78
30
0
53,05
96
11
29
0
87
69
85
41
0,9068
14
61,05
18
41
0,8958
95
77
91
51
6
22
14
26
52
6
58,04
86
99
63
4
31
22
32
62
4
13
94
52,05
73
2
40
31
39
73
2
21
66,02
11
84
0
49
40
46
85
0
30
11
18
95
0,9058
58
49
53
97
0,8948
39
19
24
74,06
6
67
57
60
68,07
6
47
27
30
17
4
75
66
67
19
4
56
36
38
29
2
84
75
74
30
2
65
44
44
39
0
93
84
81
41
0
74
53
51
51
0,9048
54,02
92
87
52
0,8938
82
61
57
61
6
11
62,01
94
63
6
91
69
64
72
4
19
10
49,01
75
4
59,00
77
70
83
2
28
19
08
87
2
08
86
77
95
0
37
27
15
96
0
17
94
83
75,05
0,9038
46
36
22
69,08
0,8928
26
67,02
90
16
6
54
45
29
19
6
34
11
97
27
4
63
53
35
30
4
43
19
53,03
39
2
72
62
42
42
2
52
27
09
49
0
81
71
50
53
0
60
36
17
61
0,9028
89
79
56
63
0,8918
69
44
23
72
6
98
88
63
74
6
77
52
29
83
4
55,07
97
70
86
4
86
61
36
94
2
16
63,05
76
97
2
95
69
43
76,05
0
25
14
83
70,08
0
60,03
77
49
15
0,9018
33
22
90
19
0,8908
12
85
55
26
6
42
31
97
30
6
21
94
62
38
4
51
40
50,04
42
4
29
68,02
69
49
2
60
48
10
52
2
38
10
75
59
0
68
57
17
64
0
47
18
81
70
0,9008
77
65
24
75
0,8898
55
26
88
81
6
86
74
31
86
6
64
35
95
93
Продолжение таблицы 5.5.-1.
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
ρ20
растворе
ρ20
растворе
в процентах
граммов
миллилитров
в процентах
граммов
миллилитров
по
по
в 100
в 100 г при
по
по
в 100
в 100 г при
массе
объему
мл при
взвешивании
массе
объему
мл при
взвешивании
200С
в воздухе
200С
в воздухе
4
72
43
54,01
77,04
4
44
83
48
83,01
2
81
51
07
14
2
52
91
55
12
0
90
59
14
25
0
61
98
60
22
0,8888
98
67
20
36
0,8778
69
73,06
66
33
6
61,07
75
26
47
6
78
14
73
45
4
15
83
33
57
4
86
22
79
56
2
24
91
39
68
2
95
29
85
66
0
33
69,00
46
80
0
66,03
37
91
77
0,8878
41
08
52
91
0,8768
12
45
97
87
6
50
16
59
78,02
6
20
53
58,03
98
4
58
24
65
12
4
29
60
09
84,08
2
67
32
71
23
2
37
68
15
19
0
76
40
78
34
0
46
76
22
30
0,8868
84
48
84
45
0,8758
54
84
28
42
6
93
56
90
56
6
63
91
33
51
4
62,01
64
96
66
4
71
99
40
63
2
10
72
55,03
77
2
80
74,07
46
74
0
18
80
09
88
0
88
15
52
85
0,8858
27
88
15
99
0,8748
97
22
58
95
6
36
96
22
79,10
6
67,05
30
64
85,06
4
44
70,05
29
21
4
14
37
70
16
2
53
12
34
31
2
22
45
76
27
0
61
20
41
42
0
31
53
82
38
0,8848
70
28
47
53
0,8738
39
61
89
49
6
79
36
53
64
6
47
68
94
59
4
87
45
60
75
4
56
76
59,01
70
2
96
53
67
86
2
64
84
07
81
0
63,04
61
73
97
0
73
91
12
91
0,8838
13
69
79
80,08
0,8728
81
99
19
86,03
6
21
77
86
19
6
90
75,06
24
12
4
30
85
92
30
4
98
14
31
24
2
39
93
98
40
2
68,07
22
37
35
0
47
71,01
56,05
51
0
15
29
42
45
0,8828
56
09
11
62
0,8718
24
37
49
56
6
64
17
17
73
6
32
45
55
67
4
73
25
24
84
4
41
52
61
77
2
82
33
30
95
2
49
60
67
89
0
90
41
36
81,06
0
58
68
73
87,00
0,8818
99
49
42
17
0,8708
66
75
79
10
6
64,07
57
49
28
6
75
83
85
21
4
16
65
55
39
4
83
90
91
31
2
24
72
61
49
2
92
98
97
42
0
33
80
67
60
0
69,00
76,06
60,03
53
0,8808
41
88
73
70
0,8698
08
13
09
63
6
50
96
80
81
6
17
21
15
74
4
59
72,04
86
93
4
25
28
21
85
2
67
12
92
82,04
2
34
36
27
96
0
76
20
99
15
0
42
43
32
88,06
0,8798
84
28
57,05
25
0,8688
51
51
39
17
6
93
36
11
36
6
59
58
44
27
4
65,01
44
17
47
4
68
66
51
38
2
10
51
23
57
2
76
74
57
50
0
18
59
29
68
0
84
81
62
60
0,8788
27
67
36
79
0,8678
93
89
69
71
6
35
75
42
90
6
70,01
96
74
81
Продолжение таблицы 5.5.-1.
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
ρ20
растворе
ρ20
растворе
в процентах
граммов
миллилитров
в процентах
граммов
миллилитров
по
по
в 100
в 100 г при
по
по
в 100
в 100 г при
массе
объему
мл при
взвешивании
массе
объему
мл при
взвешивании
200С
в воздухе
200С
в воздухе
4
10
77,04
81
93
4
69
81,05
97
76
2
18
11
86
89,02
2
78
12
64,03
87
0
26
19
92
14
0
86
19
08
97
0,8668
35
26
98
24
0,8558
94
26
14
95,07
6
43
33
61,03
34
6
75,02
33
19
17
4
52
41
10
46
4
11
40
25
28
2
60
48
15
56
2
19
47
30
38
0
68
56
22
67
0
27
54
36
49
0,8658
77
63
27
77
0,8548
35
61
41
59
6
85
70
33
88
6
44
68
47
70
4
94
78
39
99
4
52
75
52
80
2
71,02
85
44
90,09
2
60
82
58
90
0
10
93
51
21
0
69
89
63
96,01
0,8648
19
78,00
61,56
31
0,8538
77
96
68
11
6
27
07
62
41
6
85
82,03
74
21
4
36
15
68
53
4
93
10
80
32
2
44
22
74
63
2
76,01
17
85
43
0
52
29
79
73
0
10
24
91
53
0,8638
61
37
86
84
0,8528
18
31
64,96
63
6
69
44
91
95
6
26
38
65,02
74
4
7
51
97
91,05
4
35
45
08
85
2
86
59
62,03
16
2
43
52
13
95
0
94
66
08
26
0
51
59
19
97,06
0,8628
72,03
73
14
36
0,8518
59
66
24
16
6
11
81
20
47
6
67
73
30
27
4
19
88
26
57
4
76
80
35
38
2
28
95
31
68
2
84
87
41
48
0
37
79,03
38
79
0
92
94
46
59
0,8618
44
10
43
90
0,8508
77,00
83,01
52
69
6
53
17
49
92,00
6
09
08
57
80
4
61
24
54
10
4
17
14
62
89
2
69
32
60
22
2
25
21
68
99
0
78
39
66
32
0
33
28
73
98,10
0,8608
86
46
72
42
0,8498
42
35
79
20
6
95
53
77
52
6
50
42
84
31
4
73,03
61
83
64
4
58
49
90
42
2
11
68
89
74
2
66
56
95
53
0
20
75
94
84
0
74
63
66,01
63
0,8598
28
83
63,01
96
0,8488
83
69
05
73
6
36
90
06
93,06
6
91
76
11
83
4
45
97
12
16
4
99
83
16
93
2
53
80,04
17
27
2
78,07
90
22
99,04
0
61
11
23
37
0
16
97
28
15
0,8588
70
19
29
49
0,8478
24
84,04
33
25
6
78
26
35
59
6
32
10
38
34
4
86
33
40
70
4
40
17
43
45
2
95
40
46
80
2
48
24
49
56
0
74,03
47
51
90
0
56
31
54
67
0,8578
11
54
57
94,01
0,8468
64
38
60
78
6
20
62
63
13
6
73
44
65
87
4
28
69
69
23
4
81
51
70
98
2
36
76
74
33
2
89
58
76
100,08
0
44
83
80
43
0
97
65
81
19
0,8568
53
90
85
54
0,8458
79,05
71
86
28
6
61
97
91
64
6
13
78
91
39
Продолжение таблицы 5.5.-1.
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
ρ20
растворе
ρ20
растворе
в процентах
граммов
миллилитров
в процентах
граммов
миллилитров
по
по
в 100
в 100 г при
по
по
в 100
в 100 г при
массе
объему
мл при
взвешивании
массе
объему
мл при
взвешивании
200С
в воздухе
200С
в воздухе
4
22
85
97
50
4
64
42
79
10
2
30
91
67,02
60
2
72
48
83
20
0
38
98
07
70
0
80
54
88
30
0,8448
46
85,05
13
80
0,8338
88
61
94
42
6
54
12
18
91
6
96
67
98
51
4
62
18
23
101,01
4
84,04
73
70,03
61
2
70
25
29
12
2
11
79
08
70
0
78
32
34
23
0
19
86
13
82
0,8438
87
38
39
32
0,8328
27
92
18
91
6
95
45
44
42
6
35
98
23
107,01
4
80,03
51
49
52
4
43
89,04
28
10
2
11
58
55
63
2
51
10
32
20
0
19
65
60
74
0
59
16
37
30
0,8428
27
71
65
83
0,8318
67
23
43
42
6
35
78
70
94
6
74
29
47
52
4
43
85
76
102,04
4
82
35
52
61
2
51
91
81
14
2
90
41
57
71
0
60
98
86
25
0
98
47
62
80
0,8418
68
86,05
92
36
0,8308
85,06
53
66
91
6
76
11
96
45
6
14
59
71
108,00
4
84
18
68,02
56
4
21
65
76
10
2
92
24
07
65
2
29
71
81
20
0
81,00
31
12
76
0
37
77
85
29
0,8408
08
86,37
17
85
0,8298
45
83
90
39
6
16
44
22
96
6
53
90
96
51
4
24
50
27
103,-6
4
61
96
71,00
61
2
32
57
33
17
2
68
90,02
05
70
0
40
63
37
26
0
76
08
10
81
0,8398
48
70
43
37
0,8288
84
14
14
90
6
56
76
48
47
6
92
20
19
109,00
4
64
83
53
58
4
86,00
26
24
10
2
72
89
58
67
2
07
32
29
20
0
80
96
63
78
0
15
38
33
30
0,8388
88
87,02
68
87
0,8278
23
43
37
38
6
96
09
74
98
6
31
49
42
48
4
82,04
15
78
104,08
4
38
55
47
58
2
12
21
83
18
2
46
61
52
68
0
20
28
89
29
0
54
67
56
78
0,8378
28
34
93
38
0,8268
62
73
61
88
6
36
41
99
49
6
69
79
66
98
4
44
47
69,04
59
4
77
85
71
110,08
2
52
53
08
68
2
85
91
75
18
0
60
60
14
79
0
93
97
80
28
0,8368
68
66
19
89
0,8258
87,00
91,03
85
38
6
76
72
23
98
6
08
09
89
48
4
84
79
29
105,09
4
16
15
94
58
2
92
85
34
19
2
24
20
98
66
0
83,00
92
39
30
0
31
26
72,03
76
0,8358
08
98
44
40
0,8248
39
32
08
86
6
16
88,04
49
49
6
47
38
12
96
4
24
11
54
61
4
54
44
18
111,06
2
32
17
59
70
2
62
50
23
16
0
40
23
64
80
0
70
55
27
25
0,8348
48
29
68
89
0,8238
78
61
32
35
6
56
36
74
106,01
6
85
67
36
45
Продолжение таблицы 5.5.-1.
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
ρ20
растворе
ρ20
растворе
в процентах
граммов
миллилитров
в процентах
граммов
миллилитров
по
по
в 100
в 100 г при
по
по
в 100
в 100 г при
массе
объему
мл при
взвешивании
массе
объему
мл при
взвешивании
200С
в воздухе
200С
в воздухе
4
93
73
41
55
4
92,05
75
78
78
2
88,01
79
45
65
2
13
80
82
87
0
08
85
50
75
0
20
85
86
96
0,8228
16
90
53
83
0,8118
27
91
91
117,07
6
24
96
58
93
6
35
96
95
16
4
31
92,02
63
112,03
4
42
95,01
99
25
2
39
08
68
14
2
49
06
75,03
34
0
47
13
72
22
0
56
11
07
43
0,8218
54
19
76
32
0,8108
64
16
11
52
6
62
25
81
42
6
71
21
15
61
4
69
30
85
51
4
78
26
19
70
2
77
36
90
61
2
85
31
22
80
0
85
42
94
71
0
93
36
26
89
0,8208
92
47
98
81
0,8098
93,00
41
30
98
6
89,00
53
73,03
91
6
07
46
34
118,07
4
08
58
07
113,00
4
14
52
39
18
2
15
64
12
10
2
22
57
43
27
0
23
70
17
20
0
29
62
47
36
0,8198
30
75
20
29
0,8088
36
67
51
45
6
38
81
25
39
6
43
72
55
54
4
45
87
30
49
4
50
77
59
63
2
53
92
34
58
2
58
82
63
73
0
60
98
39
68
0
65
87
67
82
0,8188
68
93,04
43
78
0,8078
72
92
71
91
6
75
09
47
86
6
79
97
75
119,00
4
83
14
51
95
4
86
96,02
79
09
2
91
20
56
114,06
2
94
07
83
18
0
98
25
60
15
0
94,01
12
86
27
0,8178
90,06
31
65
25
0,8068
08
16
90
35
6
13
36
69
33
6
15
21
94
44
4
21
42
73
44
4
22
26
98
53
2
28
47
77
53
2
29
31
76,02
63
0
35
53
82
63
0
36
36
05
72
0,8168
90,43
58
86
72
0,8058
43
41
09
81
6
50
63
90
80
6
50
45
13
89
4
58
69
95
91
4
57
50
16
98
2
65
74
99
115,00
2
65
55
20
120,08
0
73
80
74,03
10
0
72
60
24
17
0,8158
80
85
07
19
0,8048
79
65
28
26
6
88
91
12
30
6
86
70
32
35
4
95
96
16
38
4
93
74
35
43
2
91,03
94,02
21
49
2
95,00
79
39
52
0
10
07
25
58
0
07
84
43
61
0,8148
17
12
29
67
0,8038
14
89
47
70
6
25
17
33
76
6
21
94
51
80
4
32
23
37
86
4
28
99
55
89
2
39
28
41
95
2
35
97,03
58
97
0
47
33
45
116,03
0
42
08
62
121,06
0,8138
54
38
49
12
0,8028
49
12
65
14
6
61
43
53
21
6
56
17
69
23
4
69
49
58
32
4
63
22
74
33
2
76
54
62
41
2
70
26
77
40
0
83
59
66
50
0
77
31
81
50
0,8128
91
64
70
59
0,8018
84
35
85
58
6
98
70
74
70
6
91
40
88
67
Продолжение таблицы 5.5.-1.
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
Плотность
Содержание этанола в водно-спиртовом
ρ20
растворе
ρ20
растворе
в процентах
граммов
миллилитров
в процентах
граммов
миллилитров
по
по
в 100
в 100 г при
по
по
в 100
в 100 г при
массе
объему
мл при
взвешивании
массе
объему
мл при
взвешивании
200С
в воздухе
200С
в воздухе
4
98
44
92
75
2
08
81
78,00
43
2
96,04
49
96
84
0
14
85
03
51
0
11
54
77,00
94
0,7948
21
89
06
59
0,8008
18
58
03
122,01
6
27
94
09
69
6
25
63
07
11
4
34
98
12
77
4
32
67
10
19
2
41
99,02
15
85
2
39
72
14
29
0
47
06
19
93
0
46
76
17
36
0,7938
54
10
22
125,02
0,7998
52
81
21
46
6
60
14
25
10
6
59
86
25
55
4
67
18
28
18
4
66
90
28
63
2
74
22
31
26
2
73
95
32
72
0
80
26
34
34
0
80
99
35
80
0,7928
87
30
78,37
43
0,7988
87
98,04
38
90
6
93
34
41
51
6
93
08
41
98
4
99,00
38
44
59
4
97,00
12
44
123,06
2
06
42
47
67
2
07
17
48
16
0
13
46
50
75
0
14
21
53
24
0,7918
19
50
53
84
0,7978
20
25
56
32
6
26
54
56
92
6
27
29
59
40
4
32
58
60
126,01
4
34
34
63
50
2
38
62
63
09
2
41
38
66
58
0
45
66
66
17
0
47
42
69
66
0,7908
51
99,70
69
25
0,7968
54
47
73
76
6
58
74
72
33
6
61
51
76
84
4
64
78
75
42
4
67
55
79
92
2
70
82
78
50
2
74
59
83
99
0
77
86
82
58
0
81
64
86
124,09
0,7898
83
89
84
64
0,7958
88
68
90
17
6
89
93
87
72
6
94
72
93
25
4
96
97
90
81
4
98,01
77
97
35
0,78927
100,00
100,00
78,93
87
# Таблица 5.5.-2
Количество (в граммах при температуре 200С) воды и спирта разной концентрации, которые необходимо смешать, чтобы
получить 1 кг спирта концентрации 30%, 40, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 92 %
Крепость
30 %
40 %
50 %
60 %
70 %
80 %
90 %
92 %
взятого
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирта, %
96
262
738
355
645
452
548
555
445
665
335
783
217
913
87
941
59
95
266
734
360
640
459
541
564
436
675
325
795
205
927
73
955
45
94
270
730
366
634
466
534
572
428
686
314
807
193
941
59
970
30
93
275
725
371
629
473
527
681
419
696
304
820
180
956
44
985
15
92
279
721
377
623
481
519
590
410
707
293
832
168
970
30
91
283
717
383
617
488
512
599
401
717
283
845
155
985
15
90
287
713
389
611
495
505
608
392
728
272
858
142
89
292
708
395
605
503
497
617
383
739
261
871
129
88
296
704
401
599
511
489
627
373
751
249
884
116
87
301
699
407
593
518
482
636
364
762
238
898
102
86
305
695
413
587
526
474
646
354
774
226
911
89
85
310
690
419
581
534
466
656
344
786
214
925
75
84
315
685
426
574
543
457
666
334
798
202
940
60
83
320
680
432
568
551
449
676
324
810
190
954
46
82
325
675
439
561
560
440
687
313
823
177
969
31
81
330
670
446
554
568
432
698
302
836
164
984
16
80
335
665
453
547
577
423
709
291
849
151
79
340
660
460
540
587
413
720
280
863
137
78
346
654
468
532
596
404
732
268
876
124
77
351
649
475
525
605
395
743
257
890
110
76
357
643
483
517
615
385
755
245
905
95
75
363
637
491
509
625
375
768
232
920
80
74
369
631
499
501
636
364
781
219
935
65
73
375
625
507
493
646
354
794
206
951
49
72
381
619
516
484
657
343
807
193
967
33
71
388
612
525
475
669
331
821
179
983
17
70
394
606
534
466
680
320
835
165
69
401
599
543
457
692
308
849
151
68
408
592
553
447
704
296
864
136
67
416
584
562
438
716
284
879
121
66
423
577
572
428
729
271
895
105
65
431
569
583
417
742
258
911
89
Продолжение таблицы 5.5.-2
Концентрация
30 %
40 %
50 %
60 %
70 %
80 %
90 %
92 %
взятого
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирта, %
64
438
562
593
407
756
244
928
72
63
447
553
604
396
770
230
945
55
62
455
545
616
384
784
216
963
37
61
464
536
627
373
799
201
981
19
60
472
528
639
361
815
185
59
482
518
652
348
830
170
58
491
509
665
335
847
153
57
501
499
678
322
864
136
56
511
489
692
308
881
119
55
522
478
706
294
899
101
54
532
468
720
280
918
82
53
544
456
736
264
937
63
52
555
445
751
249
958
42
51
567
433
768
232
978
22
50
580
420
785
215
49
593
407
803
197
48
607
393
821
179
47
621
379
840
160
46
636
364
860
140
45
651
349
881
119
44
667
333
902
98
43
684
316
925
75
42
701
299
949
51
41
720
280
974
26
40
739
261
39
759
241
38
781
219
37
803
197
36
826
174
35
851
149
34
878
122
33
905
95
32
935
65
# Таблица 5.5.-3
Количество (в миллилитрах при 200С) воды и спирта различной концентрации, которые необходимо смешать, чтобы
получить 1 л спирта концентрации 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % , 85 %, 90 %
Концентрация
30 %
35 %
40 %
45 %
50 %
55 %
60 %
65 %
взятого
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирта, %
95
316
707
368
658
421
607
474
556
526
504
579
451
632
397
684
343
90
333
687
389
634
444
581
500
526
556
470
611
414
667
357
722
299
85
353
665
412
609
471
551
529
493
588
434
647
374
706
313
765
252
80
375
641
438
581
500
519
562
457
625
394
688
330
750
265
812
200
75
400
614
467
549
533
483
600
417
667
349
733
280
800
211
867
141
70
429
584
500
514
571
443
643
371
714
298
786
225
857
150
929
76
65
462
549
538
473
615
396
692
319
769
240
846
161
923
81
60
500
509
583
426
667
343
750
258
833
173
916
87
55
545
462
636
371
727
279
818
187
909
94
50
600
405
700
305
800
204
900
103
45
667
336
778
225
889
113
40
750
252
875
126
35
857
143
Продолжение таблицы 5.5.-3
Концентрация
70 %
75 %
80 %
85 %
90 %
взятого
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирта, %
95
737
288
789
233
842
176
895
119
947
61
90
778
240
833
182
889
122
944
62
85
824
190
882
127
941
64
80
875
134
938
67
75
933
71
70
65
60
55
50
45
40
35
# Таблица 5.5.-4
Количество (в миллилитрах при 200С) воды и спирта различной концентрации, которые необходимо смешать, чтобы
получить 1 л (при 200С) спирта концентрации 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %,
95 %
Концентрация
30 %
35 %
40 %
45 %
50 %
55 %
60 %
65 %
взятого
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирта, %
96,5
310,9
713,1
362,7
664,7
414,5
615,3
466,3
565,0
518,1
513,8
569,9
461,8
621,8
409,1
673,6
355,8
96,4
311,2
712.7
363,1
664,2
414,9
614,8
466,8
564,4
518,7
513,1
570,5
461,1
622,4
408,3
674,3
354,9
96,3
311,5
712,3
363,4
663,8
415,4
614,3
467,3
563,8
519,2
512,5
571,1
460,4
623,1
407,6
675,0
354,1
96,2
311,9
712,0
363,8
663,3
415,8
613,7
467,8
563,2
519,8
511,8
571,7
459,7
623,7
406,8
675,7
353,2
96,1
312,2
711,6
364,2
662,9
416,2
613,2
468,2
562,6
520,3
511,2
572,3
458,9
624,3
406,0
676,4
352,4
96,0
312,5
711,2
364,6
662,4
416,7
612,7
468,8
562,0
520,8
510,5
572,9
458,2
625,0
405,2
677,1
351,5
95,9
312,8
710,8
365,0
662,0
417,1
612,2
469,2
561,5
521,4
509,9
573,5
457,5
625,7
404,4
677,8
350,7
95,8
313,2
710,4
365,3
661,5
417,5
611,7
469,7
560,9
521,9
509,2
574,1
456,8
626,3
403,7
678,5
349,8
95,7
313,5
710,0
365,7
661,1
418,0
611,1
470,2
560,3
522,5
508,6
574,7
456,1
627,0
402,9
679,2
349,0
95,6
313,8
709,6
366,1
660,6
418,4
610,6
470,7
559,7
523,0
507,9
575,3
455,4
627,6
402,1
679,9
348,2
95,5
314,1
709,2
366,5
660,1
418,8
610,1
471,2
559,1
523,6
507,3
575,9
454,7
628,3
401,3
680,6
347,3
95,4
314,5
708,8
366,9
659,7
419,3
609,6
471,7
558,5
524,1
506,6
576,5
453,9
628,9
400,5
681,3
346,5
95,3
314,8
708,4
367,3
659,2
419,7
609,1
472,2
558,0
524,7
506,0
577,1
453,2
629,6
399,7
682,1
345,6
95,2
315,1
708,0
367,6
658,8
420,2
608,5
472,7
557,4
525,2
505,3
577,7
452,5
630,3
399,0
682,8
344,8
95,1
315,5
707,6
368,0
658,3
420,6
608,0
473,2
556,8
525,8
504,7
578,3
451,8
630,9
398,2
683,5
343,9
Продолжение таблицы 5.5.-4
Концентрация
70 %
75 %
80 %
85 %
90 %
95 %
взятого
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирта, %
96,5
725,4
301,8
777,2
247,2
829,0
192,0
880,8
135,8
932,6
78,2
984,5
18,6
96,4
726,1
300,9
778,0
246,3
829,9
190,9
881,7
134,7
933,6
77,1
985,5
17,3
96.3
726,9
300,0
778,8
245,3
830,7
189,9
882,7
133,6
934,6
75,9
986,5
16,1
96,2
727,7
299,1
779,6
244,3
831,6
188,8
883,6
132,4
935,6
74,7
987,5
14,9
96,1
728,4
298,2
780,4
243,3
832,5
187,8
884,5
131,3
936,5
73,6
988,6
13,6
96,0
729,2
297,2
781,3
242,4
833,3
186,8
885,4
130,2
937,5
72,4
989,6
12,4
95,9
729,9
296,3
782,1
241,4
834,2
185,7
886,3
129,1
938,5
71,2
990,6
11,2
95,8
730,7
295,4
782,9
240,4
835,1
184,7
887,3
128,0
939,5
70,0
991,6
9,9
95,7
731.5
294,5
783,7
239,4
835,9
183,6
888,2
126,9
940,4
68,9
992,7
8,7
95,6
732,2
293,6
784,5
238,5
836,8
182,6
889,1
125,8
941,4
67,7
993,7
7,5
95,5
733,0
292,7
785,3
237,5
837,7
181,6
890,1
124,7
942,4
66,5
994,8
6,2
95,4
733,7
291,8
786,2
236,5
838,6
180,5
891,0
123,6
943,4
65,4
995,8
5,0
95,3
734,5
290,9
787,0
235,5
839,5
179,5
891,9
122,5
944,4
64,2
996,8
3,7
95,2
735,3
290,0
787,8
234,5
840,3
178,4
892,9
121,4
945,4
63,0
997,9
2,5
95,1
736,1
289,0
788,6
233,6
841,2
177,4
893,8
120,3
946,4
61,8
998,9
1,3
# Таблица 5.5.-5
Таблица для получения спирта различной концентрации при 200С
Концентрация
Желаемая концентрация разведенного спирта
разводимого
30 %
35 %
40 %
45 %
50 %
55 %
60 %
65 %
70 %
75 %
80 %
85 %
90 %
спирта (1000
объемов), %
35
167
40
335
144
45
505
290
127
50
674
436
255
114
55
845
583
384
229
103
60
1017
730
514
344
207
95
65
1189
878
644
460
311
190
88
70
1360
1027
774
577
417
285
175
81
75
1535
1177
906
694
523
382
264
163
76
80
1709
1327
1039
812
630
480
353
246
153
72
85
1884
1478
1172
932
738
578
443
329
231
144
68
90
2061
1630
1306
1052
847
677
535
414
310
218
138
65
95
2239
1785
1443
1174
957
779
629
501
391
295
209
133
64
Примечание. Цифра в месте пересечения горизонтальной и вертикальной строк указывает объем воды при 200С, который следует прилить к 1000
объемам спирта имеющейся концентрации при 200С, для получения разведения.
# Таблица 5.5.-5
Количество (в миллилитрах при 200С) воды и спирта концентрации 96,6 % - 97,0 %, которые необходимо смешать, чтобы
получить 1 л (при 200С) спирта концентрации 40 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %
Концентрация
40 %
70 %
80 %
90 %
95 %
взятого
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирт
вода
спирта, %
96,6
414,1
615,8
724,6
302,7
828,2
193,0
931,7
79,4
983,4
19,8
96,7
413,7
616,3
723,9
303,6
827,3
194,0
930,7
80,6
982,4
21,0
96,8
413,2
616,8
723,1
304,5
826,5
195,7
929,7
81,7
981,4
22,3
96,9
412,8
617,4
722,4
305,4
825,6
196,1
928,8
82,9
980,4
23,5
97,0
412,4
617,9
721,7
306,3
824,7
197,1
927,8
84,0
979,4
24,7
5.6. ОТЧЕТ ОБ ИССЛЕДОВАНИИ ИНТЕРФЕРОНОВ
Данный раздел публикуется для информации.
1. ВВЕДЕНИЕ
Частные статьи по интерферонам человека описывают главным образом
исследования, основанные на ингибиторной активности интерферона в
отношении цитопатического действия вируса в культуре клеток. Однако если она
описывает более одного подкласса интерферона, то в большинстве случаев сам
вирус, культура клеток и детали исследования не определены с точностью,
необходимой для обеспечения достаточной вариабильности.
Данный текст представляет собой основную информацию для исследователя
относительно того, как планировать, оптимизировать и валидировать подобные
исследования после того, как будет определена комбинация культуры клеток и
цитопатического вируса. Подробная процедура для цитопатического
антивирусного анализа приводится в качестве примера подходящего метода
наряду с информацией по другим комбинациям вирус-клеточная линия и
руководством по адаптированию и валидированию данной процедуры для
аналогичных комбинаций.
2.
АНТИВИРУСНЫЕ
(СНИЖАЮЩИЕ ЦИТОПАТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ)
ИССЛЕДОВАНИЯ.
Антивирусные исследования человеческих интерферонов основываются на
индукции клеточной реакции в клетках человека, которая предотвращает или
снижает цитопатический эффект инфекционного вируса. Сила действия
интерферона оценивается путем сравнения его защитного эффекта против
вирусного цитопатического эффекта с подобным эффектом соответствующего
референтного препарата, калиброванного в Международных единицах.
3. ИССЛЕДОВАНИЕ ИНТЕРФЕРОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОК Hер2C и
ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО ЭНЦЕФАЛОМИОКАРДИТА
Данное антивирусное исследование интерферонов человека описывает
цитопатический эффект редукционного типа. В нем используются клетки человека
Hep2c, инфицированные вирусом энцефаломиокардита, для определения
эффективности различных экспериментальных препаратов человеческого
интерферона. Этот анализ использовался в трех международных исследованиях
под эгидой Всемирной организации здравоохранения
(ВОЗ) как вариант
международных стандартов для человеческого интерферона альфа,
человеческого интерферона бета и человеческого интерферона гамма и проявил
себя как чувствительный, надежный и воспроизводимый метод для оценок
эффективности различных типов человеческого интерферона.
Для культур клеток млекопитающих все процедуры выполняются с
использованием стандартных операционных процедур по поддержанию
клеточных линий в культуре. Объемы реагентов обозначены для клеточных
культур, выполняемых в 75 cм2 колбах. Могут использоваться другие типы
контейнеров, но при этом необходимо соответствующим образом
откорректировать объем.
3.1. ХРАНЕНИЕ И ПОДГОТОВКА КЛЕТОК Heр 2c.
Клетки Hep2c содержатся и пересеваются в культуральной среде А. Клетки
хранятся в замороженном виде с использованием стандартных операционных
процедур. Растущие клетки могут пересеваться в культуре до 30 пассажей, после
чего новую культуру получают из замороженного материала.
В начале исследования из колб берут клетки, образующие 90 % сплошной
монослой, используя трипсиновую обработку, описанную ниже.
Из колб удаляют культуральную среду, затем в каждую колбу добавляют 5
мл раствора трипсина, нагретого до 37 C (раствор трипсина содержит 4 мг/мл
трипсина Р и 4 мг/мл натрия эделата Р).
Непосредственно перед использованием раствор трипсина разводят
50
объемами фосфатного буфера. Колбу, закрытую пробкой, взбалтывают для
промывки клеточного монослоя. Излишки трипсинового раствора убирают.
Колбы выдерживают 5-10 мин при температуре 37 C. Визуально или через
микроскоп наблюдают за клетками на предмет появления признаков разделения.
При наблюдении в микроскоп видно, как клетки округляются или разделяются и
свободно плавают.
Энергично встряхивают колбы для разделения всех клеток, добавляют
приблизительно
5 мл культуральной среды А, еще раз встряхивают для
получения суспензии отдельных клеток.
При приготовлении суспензии для процедуры анализа необходимо
тщательно разделить клетки с помощью пипетки, чтобы разрушить клеточные
композиты. Подсчитывают количество клеток и ресуспендируют их в
культуральной среде до концентрации 6·105 клеток/мл.
3.2. ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ ВИРУСА ЭНЦЕФАЛОМИОКАРДИТА
Вирус энцефаломиокардита
(ЭМКВ) воспроизводится в культуре клеток
мышей L-929. Клетки L-929 получают с использованием трипсинизации, как это
описывалось для клеток Hep2c (Примечание: при слабом росте клеток может
возникнуть необходимость замены неонатальной телячьей сыворотки на
эмбриональную коровью сыворотку).
Берут несколько колб со сплошным монослоем культуры клеток L-929.
Удаляют среду из колб. Добавляют 2 мл суспензии ЭМКВ, разбавленной в
культуральной среде В таким образом, чтобы она содержала приблизительно
2,5·108 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на миллилитр. Каждая колба должна
содержать
4-6·107 L-929 клеток и, таким образом, инфекционность будет
составлять
10 БОЕ/клетку. Осторожно взбалтывают вирусную суспензию,
распределяя по клеточному монослою, и ставят колбы в термостат
приблизительно на один час. Поддерживают pH среды от 7,4 до 7,8.
После адсорбции ЭМКВ, добавляют приблизительно 40 мл культуральной
среды в каждую колбу и возвращают колбы в инкубатор с температурой 37°C
приблизительно на 30 ч. Поддерживают pH среды от 7,4 до 7,8 с целью получения
максимального количества вируса. По окончании инкубации удаляют
культуральную жидкость и хранят её при температуре приблизительно 40 C.
Колбы охлаждают до температуры −20 C, чтобы заморозить клеточный
монослой. Затем нагревают до комнатной температуры. Добавляют
приблизительно 5 мл культуральной среды и встряхивают колбу, чтобы разрушить
стенки клеток. Содержимое каждой колбы переносят в контейнер с культуральной
жидкостью. Затем культуральную жидкость, содержащую ЭМКВ, переносят в 50
мл пластиковые центрифужные пробирки и центрифугируют при ускорении 500 g
около 10 мин. Очищенную культуральную жидкость распределяют по стеклянным
контейнерам с закручивающейся пробкой в количествах 20 мл, 10 мл, 5 мл, 1 мл,
0,5 мл или 0,2 мл, в соответствии с необходимостью. Хранят при −70 C.
При необходимости большие объемы можно размораживать и
распределять по меньшим объемам и повторно замораживать.
При постоянном хранении приблизительно при температуре −70 C ЭМКВ
сохраняет свой первоначальный титр, но повторяющиеся циклы замораживания-
размораживания или хранение при более высоких температурах, например, при
−20 C, приводят к прогрессирующей потери титра.
3.3. ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
3.3.1. Определение уровня доза-ответ
Приготовление растворов
Стандарт интерферона (например специфический подтип стандарта ВОЗ
интерферона) разводят в культуральной среде А, в 10-ти кратных разведениях
таким образом, чтобы доза была в диапазоне 1000 - 0,001 МЕ/мл. Процедура
исследования выполняется в 96 ячеечном микротитровом планшете. В каждую
ячейку добавляют 100 мкл культуральной среды А. Затем в каждую ячейку, за
исключением тех, которые предназначены для вирусных контролей, добавляют
приблизительно
100 мкл каждого раствора препарата сравнения, используя
многоканальные пипетки на 100 мкл. Содержимое ячеек перемешивают.
Распределение клеточной суспензии
Суспензию клеток Hep2c, содержащую приблизительно 6·105 клеток/мл
клеточной культуры А, разливают в пластиковые чашки Петри.
Используя многоканальную пипетку на
100 мкл, переносят клеточную
суспензию из чашек Петри в каждую ячейку многотитровых планшетов. Помещают
планшеты приблизительно на
24 ч в инкубатор, установленный на
37°C и
содержащий 5% углерода диоксида.
Вирусная инфекция
На этом этапе, используя микроскоп, проверяют, чтобы монослои клеток
Hep2c были сплошными, имели правильную морфологию и были живыми.
Удаляют большую часть культуральной среды, перевернув планшет,
встряхнув его и промокнув бумажным полотенцем (процедура идентична той, что
описывается ниже по удалению жидкости из микротитровых планшетов). Разводят
ЭМКВ свежей культуральной средой А до титра приблизительно 3·107 БОЕ/мл
(Примечание: в каждом планшете должно быть около 20 мл вирусной суспензии
плюс от 5 до 10% сверх объема ).
Разведенную суспензию, полученную из 9 см стерильных чашек Петри,
распределяют, используя многоканальные пипетки, установленные на 200 мкл, во
все ячейки, включая вирусные контроли, за исключением клеточных контролей.
Добавляют приблизительно 200 мкл культуральной среды А без вируса в каждую
ячейку с клеточным контролем.
Планшет помещают в термостат, установленный на 37°C и содержащий 5%
углерода диоксида на 24 ч.
Окрашивание
Планшеты проверяют через микроскоп на предмет того, что ЭМКВ вызвал
цитопатический эффект (ц.п.э.) в вирусных контролях. Временной интервал для
максимального ц.п.э. может варьировать от одного исследования к другому
вследствие характерных изменений клеток Hep2c на введение вируса в течение
данного периода непрерывного культивирования.
Большую часть культуральной среды удаляют из ячеек в соответствующий
дезинфицирующий раствор (например, натрия гипохлорит). В каждую ячейку
добавляют солевой фосфатный буфер рН 7,4 Р. Сливают солевой фосфатный
буфер рН 7,4 Р в дезинфицирующий раствор. В каждую ячейку добавляют 150 мкл
окрашивающего раствора. Клетки окрашивают в течение 30 мин при комнатной
температуре. Сливают окрашивающий раствор в дезинфицирующий раствор.
Распределяют приблизительно 150 мкл фиксирующего раствора. Фиксируют в
течение 10 мин при комнатной температуре. Сливают фиксирующий раствор в
дезинфицирующий раствор и промывают клеточный монослой, погрузив
планшеты в пластиковые контейнеры с проточной водой. Удаляют воду и
промокают планшеты бумажными полотенцами. Высушивают планшеты при
температуре от 20 C до 37°C до тех пор, пока не испарится вся влага.
В каждую ячейку добавляют 150 мкл 0,1 M раствора натрия гидроксида Р.
Элюируют краску аккуратным встряхиванием планшетов или постукиванием
ладонью руки. Перед тем, как снимать спектрометрические показания,
необходимо убедиться, что краска равномерно распределилась по всем ячейкам.
Снимают показания при длине волны от 610 нм до 620 нм, используя считыватель
микротитрового планшета, а в качестве слепой пробы - ячейку или ряд ячеек,
содержащих около 150 мкл 0,1 M натрия гидроксида Р и не содержащих клеток.
Определяют концентрации интерферон-стандарта, которые вызывают
максимальное и минимальное снижение цитопатического эффекта. Это и есть
дозовая зависимость, соответствующая рабочему интервалу исследования.
3.3.2. Процедура исследования
Исследование проводят в соответствии с тем, как описано выше, используя
в качестве растворов:
-
вещество для исследования, разбавленное двумя объемами
культуральной среды А для достижения номинальных концентраций,
охватывающих рабочий диапазон исследования;
- в качестве растворов сравнения используют соответствующий стандарт
интерферона (например, специфический подтип интерферона ВОЗ), разведенный
в двух объемах культуральной среды А для достижения номинальных
концентраций, охватывающих рабочий диапазон исследования.
3.3.3. Анализ данных
Результаты исследования снижения цитопатического эффекта в основном
соответствуют сигмоидальному графику доза-ответ, когда функция представлена
графически
- концентрация интерферона
(логарифм обратной величины
разведения интерферона) к поглощению красителя.
Строят график функции концентрации интерферона (логарифм обратной
величины разведения) к поглощению красителя для стандартного препарата
интерферона и для экспериментальных растворов интерферона. Используя
линейный участок графика, рассчитывают концентрацию интерферона в образце
путем сравнения реакций для экспериментального и стандартного растворов,
используя обычные статистические методы для параллельного анализа.
4. ВАЛИДАЦИЯ ДРУГИХ ПРОЦЕДУР
4.1. ВЫБОР КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР И ВИРУСА
В антивирусных исследованиях интерферона использовался целый ряд
других комбинаций клеточных культур и вирусов. Например, EMCV использовался
в комбинации с эпителиальной клеточной культурой A549 карциномы легких,
вирус Semliki Forest или вирус Sindbis использовались с фибробластами человека,
с клеточной культурой амниона человека, вирус WISH или Madin-Darby с
почечной клеточной культурой крупного рогатого скота. В каждом случае выбор
комбинации клеточная культура/вирус основывается на том, какая из них дает
наиболее чувствительный ответ на препарат интерферона, предназначенный для
исследования, и дает параллельные реакции при сравнении экспериментального
препарата и интерферонового стандарта.
4.2. ВЫБОР РЕАКЦИИ
Процедура окрашивания, описанная выше, оценивает оставшиеся
жизнеспособные клетки. Кроме того, применялся целый ряд других реакций,
включая окрашивание метиленовым синим или кристаллическим фиолетовым или
преобразование тиазолинового синего (МТТ). В каждом случае выбор метода
основывался на получении подходящей линейной и чувствительной зависимости
между реакцией цвета и количеством жизнеспособных клеток.
4.3. СТАТИСТИЧЕСКОЕ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ДОСТОВЕРНОСТИ
Как и в случае с параллельными биоанализами, данное исследование должно
соответствовать обычным статистическим критериям линейности реакции,
параллелизма и дисперсии.
4.4. ВАЛИДАЦИЯ ПЛАНИРОВАНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ
Как и в случае с процедурой микротитрового планшета, необходимо
уделять внимание планированию исследования. В частности, необходимо
предусмотреть и исключить системные ошибки в результате неслучайного
порядка пипетирования и других факторов.
РЕАГЕНТЫ И КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА
Культуральная среда A (10% неонатальная телячья сыворотка)
RPMI 1640 культурная среда, дополненная при необходимости
антибиотиками (пенициллин 10000 МЕ/мл; стрептомицин 10 нг/мл)
- 450мл
L-глютамин, 200 мМ, стерильный
-
5мл
Культуральная среда B (2% эмбриональной коровьей сыворотки)
- 490мл
RPMI 1640 культуральная среда, дополненная при необходимости
антибиотиками (пенициллин 10000 МЕ/мл; стрептомицин 10нг/мл)
L-глютамин, 200 мМ, стерильный
-
5мл
Эмбриональная коровья сыворотка
- 10мл
Окрашивающий раствор
Нафталин черный
- 0,5 г
Кислота уксусная ледяная
- 90 мл
Натрия ацетат безводный
- 8,2 г
Вода
-1000 мл
содержание .. 56 57 58 59 ..