содержание      ..     27      28      29      30     ..

ТРАНСКРИПЦИЯ  (БИОСИНТЕЗ  РНК) - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

Транскрипцией называют биосинтез РНК на матрице ДНК. Транскрипция является начальной стадией реализации генетической информации, в процессе которой информация с определенных участков ДНК «переписывается» в комплементарные  одноцепочечные молекулы РНК. В результате образуются мРНК, кодирующие аминокислотные последовательности белков, а также тРНК, рРНК и другие виды РНК, выполняющие структурную, регуляторную и каталитическую функции. Основой транскрипции является фундаментальный принцип комплементарности азотистых оснований полинуклеотидных цепей ДНК и РНК.

В отличие от репликации ДНК, тесно связанной с клеточным делением, транскрипция ЛНК происходит практически во всех ядросодержащих клетках, как делящихся, так и неделящихся.

Процесс транскрипции осуществляется ферментами ДНК-зависимыми РНК-полимеразами, которые, как и ДНК-полимеразы, являются нуклеотидилтрансферазами, в качестве субстратов использующими нуклеозид-5ʹ-трифосфаты. РНК-полимеразы проявляют активность только в присутствии ионов Mg²⁺. В отличие от ДНК-полимераз, РНК-полимеразы не нуждаются в праймере и в качестве субстратов используют рибонуклеозид-5ʹ-трифосфаты (АТР, GTP, CTP, UTP). Как и при синтезе ДНК, в ходе включения рибонуклеозид-трифосфатов в строящуюся цепь они теряют пирофосфатные остатки. Это обеспечивает процесс энергией; поэтому дополнительных ее источников не требуется.

Рост полинуклеотидной цепи идет в направлении 5ʹ→ 3ʹ. Это означает, что рибонуклеозид-5ʹ-трифосфаты присоединяются к 3ʹ-ОН группе рибозы предшествующего нуклеотида. У бактерий один фермент синтезирует все виды РНК, у эукариот разные виды РНК синтезируются различными РНК-полимеразами.

Обычно транскрибируется только одна из комплементарных цепей ДНК; следовательно, для транскрипции характерна асимметричность процесса. Неясно, каким образом осуществляется выбор нужной цепи. Видимо, ключевую роль играют какие-то последовательности нуклеотидов на одной из цепей, узнаваемые РНК-полимеразой. Транскрибируется матричная цепь ДНК. Другая цепь называется кодирующей (смысловой), поскольку ее последовательность идентична последовательности РНК. При этом необходимо помнить о том, что вместо основания Т (тимин) в РНК включается основание U (урацил).

Например, в ДНК:

РНК, синтезируемая  на основе этого участка:

Видно, что синтезированная РНК комплементарна матричной цепи ДНК и идентична кодирующей цепи ДНК.

Для транскрипции характерна консервативность процесса. Молекула ДНК по окончании синтеза РНК возвращается в исходное состояние. При синтезе же ДНК молекулы наполовину обновляются.

Как у про-, так и у эукариот единовременно транскрибируется не вся молекула ДНК, а только ее определенные участки ‒ транскриптоны. В транскриптоне присутствуют последовательности, одна из которых называется промотором (зона начала траскрипции), а другая ‒ терминатором (зона остановки транскрипции). Транскриптоны бактерий называют оперонами. Опероны, как правило, включают в себя нуклеотидные последовательности, кодирующие структуру нескольких белков, называемых структурными генами (цистронами). Поэтому бактериальные мРНК являются полицистронными, в отличие от моноцистронных мРНК высших организмов.

Транскрипция у прокариот

Бактериальные РНК-полимеразы ‒ сложные белки, состоящие из нескольких типов субъединиц. Холофермент Е.соli содержит 5 разных субъединиц: 2 α-субъединицы, β-, βʹ-субъединицу, σ- и ω-субъединицы. Альтернативная форма фермента, лишенная σ-субъединицы, называется мини-ферментом или кор-ферментом. Он способен транскрибировать ДНК в РНК, однако не может инициировать синтез РНК в нужном месте, поскольку не способен узнавать промоторные сайты. Точное связывание и инициация в промоторах происходят только после добавления к кор-ферменту σ-субъединицы и образования холофермента (рис.30.1).

Транскрипция аналогична репликации в том смысле, что порядок присоединения рибонуклеотидов определяется комплементарным спариванием оснований. После формирования первых нескольких фосфодиэфирных связей (обычно 5-10) σ-субъединица отделяется от инициирующего комплекса, а дальнейшая транскрипция осуществляется с помощью кор-фермента.

Рис. 30.1. Общая схема транскрипционного цикла

Как и другие матричные процессы, транскрипция включает три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.

Инициация транскрипции

На этом этапе транскрипции необходимы холофермент, специальная последовательность нуклеотидов в ДНК (промотор) и набор нуклеозидтрифосфатов. Транскрипция инициируется при образовании стабильного комплекса между холоферментом и промотором, расположенным в начале всех транскрипционных единиц.

Промотор ‒ это участок молекулы ДНК, состоящий примерно из 40 пар нуклеотидов и расположенный непосредственно перед участком инициации транскрипции. В нем различают две важные и достаточно консервативные по составу последовательности. Одна из них состоит из шести или семи нуклеотидов (чаще ТАТААТ)  и расположена на расстоянии примерно 10 нуклеотидов от первого транскрибируемого нуклеотида (+1); эту последовательность обычно обозначают как ‒10-последовательность, или Прибнов-бокс, (в честь ее первооткрывателя Прибнова). В данном сайте РНК-полимераза связывается с ДНК. Вторая последовательность расположена на расстоянии примерно 35 нуклеотидов до сайта инициации  (-35) и служит участком распознавания промотора РНК-полимеразой (рис.30.2).

Рис.30.2. Структура промотора у прокариот

Когда РНК-полимераза связывается с промотором, происходит локальное расплетение двойной спирали ДНК и образование открытого промоторного комплекса (рис.30.3), так называемого транскрипционного «глазок». Благодаря этому нуклеотиды матричной цепи ДНК в области «глазка» становятся доступными для спаривания с рибонуклеозид-трифосфатами.

Рис. 30.3. Схема инициации транскрипции

Происходит копирование последовательности смысловой, или (+)-цепи ДНК, имеющей направление 5ʹ→ 3ʹ. При этом первым в строящуюся цепь РНК всегда включается пуриновый нуклеотид ‒ АТР или GTP, сохраняющий все три его фосфатных остатка. Затем образуется первая 5ʹ,3ʹ-фосфодиэфирная связь. Далее σ-субъединица теряет связь с ферментом, а кор-фермент начинает перемещаться по ДНК.

Элонгация транскрипции

Растущая цепь РНК остается связанной с ферментом и спаренной своим растущим концом с участком матричной цепи. Остальная часть образовавшейся цепи не связана ни с ферментом, ни с ДНК. По мере продолжения транскрипции кор-фермент, движущийся вдоль цепи ДНК, действует подобно застежке «молния», расплетая двойную спираль, которая замыкается позади фермента, и восстанавливается ее исходная дуплексная структура. «Раскрытая» ферментом область ДНК простирается всего на несколько нуклеотидов (рис.30.4).

Наращивание РНК идет в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу вдоль матричной (‒)-цепи, ориентированной в направлении 3ʹ→5ʹ, т.е. антипараллельно. РНК наращивается на 3ʹ-конце. В ходе присоединением каждого нуклеотида кор-фермент делает шаг по ДНК и сдвигается на один нуклеотид. Размер белкового комплекса, составляющего кор-фермент, 150 Ǻ. Размеры РНК-полимеразы − 150×115×110Ǻ.

Рис. 30.4. Элонгация транскрипции

Скорость работы РНК-полимеразы – до 50 нуклеотидов в секунду. Комплекс кор-фермента с ДНК и РНК называется элонгационным комплексом. В нем находится ДНК-РНК гибрид. Это участок, на котором ДНК спарена с РНК и 3′-конец РНК открыт для дальнейшего роста. Размер этого гибрида – 9 пар оснований. «Расплетенный» участок ДНК занимает примерно 12 пар оснований.

Перед «расплетенным» участком РНК-полимераза связана с ДНК. Этот участок называется передним дуплексом ДНК, его размер – 10 пар оснований. Полимераза связана также с более длинной частью ДНК, называемой задним дуплексом ДНК. Размер матричных РНК, которые синтезируют РНК-полимеразы у бактерий, может достигать 1000 нуклеотидов и больше. В эукариотических клетках размер синтезируемых ДНК может достигать 100000 и даже нескольких миллионов нуклеотидов. Правда, неизвестно, существуют ли они в таких размерах в клетках, или в процессе синтеза могут успеть процессировать.

Элонгационный комплекс довольно стабилен, т.к. должен выполнить большую работу (рис.30.5). Он способен перемещаться по ДНК со скоростью до 50 нуклеотидов в секунду. Этот процесс называется перемещением (или транслокацией). Взаимодействие ДНК с РНК-полимеразой (кор-ферментом) не зависит от последовательности этой ДНК, в отличие от σ-субъединицы. При прохождении определенных сигналов терминации кор-фермент завершает синтез ДНК.

Рис.30.5. Элонгационный косплекс

Терминация транскрипции

Последовательности ДНК, являющиеся сигналами к остановке транскрипции, называются транскрипционными терминаторами. Они содержат инвертированные повторы (GC-богатые участки), благодаря чему 3ʹ-концы РНК-транскриптов складываются с образованием шпилек разной длины. Поскольку сила взаимодействия пар G-C велика, локальная денатурация таких участков в ДНК затруднена. Это замедляет продвижение РНК-полимеразы и может служить для нее сигналом к прекращению транскрипции.

Обнаружены два типа сигналов терминации: ρ-зависимый и ρ-независимый терминаторы (ρ ‒ это олигомерный белок, прочно связывающийся с РНК и в этом состоянии гидролизующий АТР до АDP и неорганического фосфата).

В одной из моделей действие ρ-белка объясняется тем, что он связывается с синтезируемой цепью РНК и перемещается вдоль нее в направлении 5ʹ→ 3ʹ к месту синтеза РНК, необходимая для перемещения энергия выделяется при гидролизе АТР (рис.30.6).

Рис.30.6. Механизм ρ-зависимой терминации транскрипции

При этом ρ-белок наталкивается на образующуюся в РНК «шпильку» и останавливает полимеразу, которая могла бы продолжить транскрипцию. Механизм ρ-независимой терминации изучен хуже, в нем остается много неясного.

Транскрипция у эукариот

РНК-полимеразы эукариот изучены значительно слабее, чем соответствующие ферменты бактерий. Синтез РНК у эукариот осуществляют три различных фермента: РНК-полимеразы I, II и III. Их структура изучена не полностью. РНК-полимераза I необходима для синтеза 18S-, 5,8S- и 28S-рибосомальных рНК; РНК-полимераза II участвует в синтезе мРНК, некоторых мяРНК; РНК-полимераза III необходима для синтеза 5S рРНК, тРНК и некоторых мяРНК. У эукариот ни одна из РНК-полимераз не способна самостоятельно связываться с промоторами транскрибируемых ими генов. Для этого необходимы специфичные для каждой РНК-полимеразы белковые факторы транскрипции (TF-факторы) (рис. 30.7). Механизмы транскрипции у эукариот и прокариот идентичны.

Рис.30.7. Комплекс инициации транскрипции у эукариот

На рис. 30.7 в составе комплекса приведены общие факторы транскрипции (TFIIB, E, F, H и TBP), РНК-полимераза II, медиатор и специфический фактор транскрипции, связанный с энхансером

Процессинг первичных транскриптов РНК

В большинстве случаев первичные транскрипты, образующиеся вышеписанным способом, не являются зрелыми молекулами РНК, а требуют процесса созревания, который называется процессингом РНК. У прокариот первичные транскрипты, сформированные при транскрипции генов, кодирующих белки, функционируют в качестве мРНК без последующей модификации или процессинга. Более того, трансляция мРНК часто начинается даже до завершения синтеза 3ʹ-конца транскрипта. Совсем иная ситуация наблюдается для молекул прокариотических рРНК и тРНК. В этом случае кластеры рРНК- или т-РНК-генов часто транскрибируются с образованием единой цепи РНК. Для формирования зрелых функциональных форм необходимо специфическое разрезание первичных РНК-транскриптов и их модификация. Эти молекулярные события и называются процессингом РНК (или посттранскрипционной модификацией).

Созревание первичных транскриптов у эукариот осуществляется гораздо сложнее. Первичные транскрипты, так называемые гетерогенные ядерные РНК (гяРНК), по размерам значительно превышают цитоплазматические мРНК, участвующие в трансляции. Это связано с тем, что гяРНК содержат интроны. На первом этапе созревания интроны должны быть удалены из гяРНК. Этот процесс называется сплайсингом (от англ. to splice ‒ сплетать, сращивать). После удаления интронов происходит ковалентное соединение участков РНК, которые были транскрибированы с экзонов (рис.30.8).

Рис.30.8. Схема сплайсинга РНК

Сплайсинг катализируется нуклеопротеиновым комплексом, сплайсосомой, в состав которой, наряду с белками, входят малые ядерные РНК (мяРНК). Это небольшие по размеру молекулы, характерной особенностью которых является значительное содержание пиримидинового основания ‒ урацила (рис.30.9).

Рис.30.9. Структура сплайсосомы

В первичных транскриптах именно мяРНК катализируют расщепление фосфодиэфирных связей. Именно они являются рибозимами. В сплайсосомах место сплайсинга определяется с высокой точностью, поскольку ошибка даже в один нуклеотид может привести к синтезу функционально неактивного белка. Точное узнавание осуществляется благодаря специфическим нуклеотидным последовательностям (сигналам) на концах интронов.

Кроме сплайсинга, мРНК эукариот подвергается модификации: на 5ʹ-конце синтезируется «кэп» (шапочка) ‒ структура, представляющая собой метилированный остаток гуанозинтрифосфата, который защищает РНК от гидролиза 5ʹ-экзонуклеазами. На 3ʹ-конце пре-мРНК синтезируется полиаденилатная последовательность длиной 150-200 нуклеотидов − «шлейф», поли-А-хвост (см. лекцию 11).

Процессинг прешественников тРНК и рРНК у эукариот осуществляется аналогично таковому у прокариот (рис.30.10)

Рис.30.10. Процессинг пре-транспортной РНК

Регуляция генной экспрессии на уровне транскрипции

Клетки имеют механизмы, регулирующие синтез различных белков. Размер хромосомной ДНК в Е.соli (4,7∙10⁶ нуклеотидных пар) достаточен для кодирования примерно 4000 белков. Однако единовременно синтезируется лишь около 1000 белков. В 46 хромосомах человека число закодированных белков в 100 раз больше, но не все белки постоянно синтезируются. Это означает то, что в клетке биосинтез белков контролируется, причем некоторые белки синтезируются только при определенных условий.

Белки, синтезируемые с постоянной скоростью, называются конститутивными, белки, синтезируемые со скоростью, резко изменяющейся в зависимости от условий – адаптивными, или индуцибельными.

Конститутивные белки (в том числе и ферменты) содержатся в клетках примерно в постоянном количестве, независимо от того, есть ли в них потребность. Предполагается, что они будут нужны клетке всегда. Поэтому промоторы кодирующих их генов не имеют «выключателя», они всегда находятся в положении «включено». Конститутивными белками являются, например ферменты гликолиза. Количество молекул адаптивных белков варьируется в широких пределах. Очевидно, что синтез конститутивных белков не регулируется, а индуцибельных, напротив, подвергается тонкой регуляции.

Стимуляция биосинтеза белков, сопровождающаяся увеличением их количества, называется индукцией, подавление синтеза белков – репрессией. В клетках имеются вещества, сигнализирующие о состоянии метаболизма внутри клеток или организма. С помощью этих веществ можно «включать» или «выключать» синтез белков. Такими веществами у прокариот могут быть поступающие в клетку питательные вещества и некоторые внутриклеточные регуляторы (циклические нуклеотиды).

Впервые схема регуляции биосинтеза белков у прокариот была предложена французскими учеными Ф. Жакобом и Ж. Моно в 1961 году. Эта схема была разработана на примере лактозного оперона Е.соli и получила название механизма индукции – репрессии активности генов. Их идеи были подтверждены в ходе различных генетических и биохимических исследований.

Механизм регуляции активности разных транскриптонов (оперонов) у бактерий выглядит следующим образом. В бактериях имеется группа белков, называемых репрессорами, которые контролируют транскрипцию разных оперонов. Участок ДНК, определяющий структуру белка-репрессора, называется геном-регулятором. Он может быть расположен рядом с опероном, а может располагаться на определенном расстоянии от регулируемого оперона.

Все репрессоры связываются с оператором оперона и блокируют транскрипцию; в этом случае не синтезируются определенные мРНК и не идет синтез соответствующих белков.

Способность связываться с оператором зависит от конформации репрессора, которая может быть активной и неактивной. Только в активной форме репрессор способен образовывать слабые связи с оператором и блокировать синтез мРНК и белка; в неактивной форме он не может соединяться с оператором. Вещества, которые инактивируют репрессор, называются индукторами (рис. 30.11).

Рис.30.11.Регуляция экспрессии генов путем индукции

Вещества, переводящие его из неактивного состояния в активное, называются корепрессорами. Следовательно, репрессор имеет участок связывания корепрессора и индуктора (рис.30.12)

Рис.30.12. Регуляция экспрессии генов пути репрессии

Механизм индукции на примере Lac-оперона

Lac-оперон – это группа функционально связанных структурных генов Z, Y и A, несущих информацию о структуре трех ферментов, участвующих в превращении лактозы. Оперон имеет один промотор и один терминатор; поэтому все входящие в него гены транскрибируются в одну полицистронную молекулу мРНК. На мРНК, считанной с Lac-оперона, синтезируются различные белки, т.к. как каждый ген обладает собственным  сайтом связывания рибосомы. Существует также ген I (I означает индуцибельный), который кодирует белок lac-репрессор. Репрессор может связываться с участком ДНК, называемым оператором. Наконец, есть участок ДНК, с которым может связываться белок, являющийся рецептором сАМР. Он назван белком-активатором катаболизма (БАК, САР) потому, что участвует в индукции и других ферментов, осуществляющих катаболизм субстратов. Организация Lac-оперона приведена на рис.30.13.

В Lac-опероне ген Z кодирует фермент β-галактозидазу, участвующую в расщеплении лактозы, ген Y ‒ β-галактозидпермеазу, необходимую для транспорта лактозы в клетку, ген А ‒ галактозидтрансацетилазу (белок А), участвующую в защите клетки от неметаболизирующихся, потенциально токсичных β-галактозидов.

В норме эти три белка синтезируются в течение нескольких минут, но в небольших количествах. Они не нужны клетке до тех пор, пока в среде есть глюкоза. Но как только глюкоза заменяется на лактозу, которая оказывается единственным источником энергии, через 1-2 мин клетки начинают синтезировать β-галактозидазу в больших количествах, достигая уровня, превышающего 1000 молекул на клетку. Теперь Е.соli может использовать лактозу в качестве источника углерода и энергии. Однако если помимо лактозы есть и глюкоза, клетка не продуцирует указанные выше ферменты. Эта регуляция осуществляется на уровне инициации транскрипции оперона.

Рис.30.13. Организация и регуляция Lac-оперона у E.coli

В качестве индуктора Lac-оперона выступает лактоза (либо аллолактоза). Белок-репрессор Lac-оперона – тетрамер, состоящий из четырех субъединиц с молекулярной массой 37 кДа каждая. Он имеет 2 центра связывания: – один с операторным участком ДНК, другой – с индуктором. Активный белок-репрессор способен связываться с оператором, тем самым не позволяя РНК-полимеразе присоединяться к промотору и начинать транскрипцию Lac-оперона.

Если затем индуцированные лактозой клетки Е.соli перенести на свежую среду, содержащую вместо лактозы глюкозу, транскрипция Lac-оперона прекратится. Таким образом, индукция ферментов – это экономичный процесс. Индуцируемые ферменты синтезируются лишь тогда, когда в них возникает потребность. Если один индуктор вызывает синтез группы связанных ферментов или белков, как в данном случае, такой процесс называют координированной индукцией.

Е.соli и другие бактерии способны в ответ на различные специфические индукторы синтезировать большое количество разных связанных друг с другом ферментов или их групп. Такая способность позволяет бактериям быстро приспособиться к новым условиям и экономно использовать самые разнообразные питательные вещества, которые появляются в окружающей среде.

В большинстве случаев индуцибельными являются опероны, ответственные за синтез ферментов, катализирующих катаболические реакции (распад аминокислот, сбраживание сахаров и др.). Индукторами таких оперонов, переводящих активный репрессор в неактивное состояние, являются субстраты этих катаболических ферментов.

Катаболитная репрессия

Еще одним способом регуляции Lac-оперона является катаболитная репрессия. Ключом к пониманию этого вопроса явились данные о том, что глюкоза понижает концентрацию сАМР в клетках Е.соli. Затем было обнаружено, что экзогенный сАМР снимает состояние репрессии, обусловленное присутствием глюкозы.

Синтезированный в отсутствие глюкозы сАМР связывается с БАК (белковый активатор катаболизма) – белком. Это димер, состоящий из субъединиц с молекулярной массой 22 кДа. Комплекс БАК с сАМР стимулирует транскрипцию, связываясь вблизи от промоторного участка. БАК без сАМР такой способностью не обладает (рис. 30.14).

Рис.30.13. Катаболитная репрессия Lac-оперона E.coli

БАК стимулирует инициацию синтеза лактозной мРНК в 50 раз. Таким образом, индуцибельные системы контролируются с помощью механизмов, которые используют в качестве сигнальных молекул сАМР и специфические индукторы.

содержание      ..     27      28      29      30     ..