содержание      ..     12      13      14      15     ..

ФЕРМЕНТЫ – СТРОЕНИЕ: СВОЙСТВА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ (СТАТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ)

Понятие о ферментах.

Сущность явлений ферментативного катализа

Основу – изнедеятельности любого организма составляют химические процессы. Практически все реакции в живом организме протекают с участием природных биокатализаторов, называемых ферментами, или энзимами. Среди множества энергетически возможных реакций ферменты избирательно преобразуют реагенты, называемые субстратами, по физиологически полезному пути. Таким образом, ферменты управляют всеми метаболическими процессами организма.

В настоящее время известно более 3700 ферментов. В научной литературе на русском языке утвердились оба термина («ферменты» и «энзимы»), но предпочтение отдают термину «фермент», хотя наука о ферментах называется энзимологией. Слово «фермент» происходит от лат.fеrmentum – закваска, слово – «энзим» от греч. еn – в, внутри и zyme – дрожжи. Данная терминология возникла исторически при изучении ферментативных процессов спиртового брожения.

Становление энзимологии как науки произошло в начале XIX века. Её активное развитие продолжается и в настоящее время. В задачи этой науки входят определение роли отдельных ферментов в ускорении химических реакций, протекающих в организме, выделение и очистка ферментов, установление их структуры, исследование механизма действия ферментов, изучение кинетических характеристик и особенностей регуляции активности in vivo.

Для практической медицины важность энзимологии обусловлена тем, что она даёт фармакологам инструмент направленного изменения метаболизма клетки путём воздействия определёнными химическими веществами на активность ферментов. Огромное количество фармацевтических препаратов – ингибиторы ферментов. Другая не менее важная задача энзимологии – использование методов определения активности ферментов в биологических жидкостях для диагностики заболеваний. Кроме того, выделенные и очищенные ферменты могут использоваться в качестве терапевтических средств.

Фермент, выполняя функцию катализатора химической реакции, подчиняется общим законам катализа и обладает всеми свойствами, характерными для небиологических катализаторов, однако имеет и отличительные свойства, связанные с особенностями строения ферментов.

Сходство ферментов с небиологическими катализаторами заключается в том, что ферменты:

1) катализируют только энергетически возможные реакции, т.е. реакции, которые могут протекать и без них;

2) не изменяют направление реакции;

3) не сдвигают равновесие обратимой реакции, а лишь ускоряют его наступление;

4) не расходуются в процессе реакции и выходят из реакции в первоначальном виде.

Oтличие ферментов от небиологических катализаторов заключается в том, что:

1) скорость ферментативных реакций выше, чем реакций, катализируемых небелковыми катализаторами (эффективность действия ферментов). Для большинства ферментов характерно то, что 1 молекула фермента может превратить от 1000 до 1 млн. молекул субстрата за 1 минуту. Эта скорость недостижима для небиологических катализаторов;

2) ферменты обладают высокой специфичностью действия;

3) ферменты катализируют реакции в очень мягких условиях (обычное давление, нейтральная рН, невысокая tº);

4) активность ферментов в клетках строго регулируется как на генетическом уровне, так и посредством определённых низкомолекулярных соединений (субстратов и продуктов реакции, катализируемых этими же ферментами);

5) скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству фермента.

Структурная организация ферментов

В настоящее время получены неопровержимые экспериментальные доказательства белковой природы ферментов. Единственным исключением из этого положения является обнаружение у молекулы ряда предшественников РНК ферментативной активности, получившей название рибозима и катализирующей самосплайсинг, т. е. отщепление интронных нетранслируемых последовательностей от предшественника РНК.

Ферменты, как и все белки, обладают рядом свойств, характерных для высокомолекулярных соединений: амфотерностью, электрофоретической подвижностью и неспособностью к диализу через полупроницаемые мембраны. Подобно белкам, ферменты имеют большую молекулярную массу: от десятков тысяч до нескольких миллионов дальтон. Им присущи все особенности структурной организации белковых молекул (первичный, вторичный, третичный и четвертичный уровни организации).

В природе существуют как простые, так и сложные ферменты (рис. 14.1). Первые целиком представлены полипептидными цепями и при гидролизе распадаются исключительно на аминокислоты. Такими ферментами являются гидролитические ферменты, в частности пепсин, трипсин, папаин, уреаза, лизоцим, рибонуклеаза, фосфатаза и др. Большинство природных ферментов относится к классу сложных белков, содержащих помимо полипептидных цепей какой-либо небелковый компонент (кофактор), присутствие которого является абсолютно необходимым для каталитической активности. Кофакторы могут иметь различную химическую природу и различаться по прочности связи с полипептидной цепью. Если константа диссоциации сложного фермента настолько мала, что в растворе все полипептидные цепи оказываются связанными со своими кофакторами и не разделяются при выделении и очистке, то такой фермент получает название холофермента (холоэнзима), а кофактор – название простетической группы, рассматривающейся как интегральная часть молекулы фермента (например, FAD, FMN, биотин, липоевая кислота). Полипептидную часть фермента принято называть апоферментом. Если же дополнительная группа легко отделяется от апофермента при диализе, в этом случае она называется коферментом (например, NAD⁺, NADP⁺). Кроме этого, роль кофактора могут выполнять металлы: Mg²⁺, Мn²⁺, Са²⁺ и др.

Рис. 14.1. Структура ферментов

Химическая природа кофакторов, их функции в ферментативных реакциях очень разнообразны. Согласно одной из классификаций все коферменты и простетические группы делят на 2 группы:

1.      производные витаминов (табл. 14.1);

2.      невитаминные кофакторы.

Таблица 14.1.

Важнейшие коферменты и простетические группы ферментов

К невитаминным кофакторам относят следующие соединения: НS-глутатион, АТР, липоевую кислоту, производные нуклеозидов (уридинфосфат, цитидинфосфат, фосфоаденозинфосфосульфат), порфиринсодержащие вещества и др. К ним же могут быть отнесены тРНК, которые в составе ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз принимают активное участие в транспортировке аминокислот в рибосому, где осуществляется синтез белка.

Следует отметить одну отличительную особенность двухкомпонентных) ферментов: ни кофактор отдельно (включая большинство коферментов), ни сам по себе апофермент каталитической активностью не наделены, и только их объединение, протекающее не хаотично, а в соответствии с программой их структурной организации, обеспечивает быстрый ход химической реакции.

Более 25% всех ферментов для проявления полной каталитической активности нуждается в ионах металлов. Роль металлов в ферментативном катализе разнообразна.

1. Ионы металла выполняют функцию стабилизаторов молекулы субстрата, активного центра фермента и конформации белковой молекулы фермента, а именно третичной и четвертичной структур.

а) Ионы металлов – стабилизаторы молекулы субстрата

Для некоторых ферментов субстратом служит комплекс превращаемого вещества с ионом металла. Например, для большинства киназ в качестве одного из субстратов выступает не молекула АТР, а комплекс Мg²⁺-АТР. В этом случае ион Mg²⁺ не взаимодействует непосредственно с ферментом, а участвует в стабилизации молекулы АТР и нейтрализации отрицательного заряда субстрата, что упрощает его присоединение к активному центру фермента (рис. 14.2).

Рис. 14.2. Структура АТР

Схематично роль кофактора при взаимодействии фермента и субстрата можно представить как комплекс E-S-Me, где Е – фермент, S – субстрат, Ме – ион металла. В качестве примера можно привести расположение субстратов в активном центре гексокиназы (рис. 14.3).

Рис. 14.3. Участие ионов магния в присоединении субстрата в активном центре гексокиназы

В активном центре гексокиназы есть участки связывания для молекулы глюкозы и комплекса Мg²⁺-АТР. Гексокиназа катализирует перенос концевого g-фосфатного остатка молекулы АТР на глюкозу с образованием глюкозо-6-фосфата. Ион Mg²⁺ участвует в присоединении и «правильной» ориентации молекулы АТР в активном центре фермента, ослабляя фосфоэфирную связь и облегчая перенос фосфата на глюкозу.

б) Ионы металла – стабилизаторы активного центра фермента

В некоторых случаях ионы металла служат «мостиком» между ферментом и субстратом. Они выполняют функцию стабилизаторов активного центра, упрощая присоединение к нему субстрата и протекание химической реакции. В ряде случаев ион металла может способствовать присоединению кофермента. Перечисленные выше функции выполняют такие металлы, как Mg²⁺, Мп²⁺, Zn²⁺, Со²⁺, Мо²⁺. В отсутствие металла эти ферменты активностью не обладают. Такие ферменты получили название «металлоэнзимы». Схематично данный процесс взаимодействия фермента, субстрата и металла можно представить следующим образом: E-Me-S.

К металлоэнзимам относят, например, пируваткиназу (рис. 14.4), катализирующую реакцию превращения фосфоенолпирувата в пируват.

Рис. 14.4. Участие ионов магния в присоединении субстрата в активном центре пируваткиназы

Активный центр пируваткиназы имеет участки связывания дпя фосфоенолпирувата и АDP. Mg²⁺ участвует в стабилизации активного центра, что облегчает присоединение фосфоенолпирувата. В ходе ферментативной реакции образуется пируват и АТР.

в) Ионы металлов – роль в стабилизации третичной

и четвертичной структуры фермента

Ионы металлов обеспечивают сохранение вторичной, третичной, четвертичной структуры молекулы фермента. Такие ферменты в отсутствие ионов металлов способны к химическому катализу («металлоэнзимные комплексы»), однако они нестабильны. Их активность снижается и даже полностью исчезает при небольших изменениях рН, температуры и других незначительных изменениях параметров внешнего окружения. Таким образом, ионы металлов выполняют функцию стабилизаторов оптимальной конформации белковой молекулы.

Иногда в стабилизации вторичной и третичной структуры принимают участие ионы щёлочноземельных металлов. Так, для поддержания третичной конформации пируваткиназы необходимы ионы К⁺.

Для стабилизации четвертичной структуры алкогольдегидрогеназы, катализирующей реакцию окисления этанола, необходимы ионы цинка. Алкогольдегидрогеназа состоит из 4 субъединиц с молекулярной массой 151 кДа. В состав фермента входят 4 атома Zn²⁺. Удаление Zn²⁺ приводит к потере активности фермента за счёт диссоциации на 4 неактивные субъединицы с молекулярной массой 36 кДа (рис. 14.5).

Рис. 14.5. Роль ионов цинка в стабилизации четвертичной структуры алкогольдeгидрогеназы

2. Ионы металлов могут принимать непосредственное участие в акте катализа.

а) Участие в электрофильном катализе

Наиболее часто эту функцию выполняют ионы металлов с переменной валентностью, имеющие свободную d-орбиталь и выступающие в качестве электрофилов. Это в первую очередь такие металлы, как Zn²⁺, Fе²⁺, Mn²⁺, Сu²⁺. Ионы щёлочноземельных металлов (такие как Na⁺ и К⁺), не обладают этим свойством. В качестве примера можно рассмотреть функционирование фермента карбоангидразы. Карбоангидраза – цинксодержащий фермент, катализирующий реакцию образования угольной кислоты:

Ион Zn²⁺ в результате электрофильной атаки участвует в образовании Н⁺ и ОН¯ ионов из молекулы воды:

Протон и гидроксильная группа последовательно присоединяются к диоксиду углерода с образованием угольной кислоты:

В ходе электрофильного катализа ионы металлов часто участвуют в стабилизации промежуточных соединений.

б) Участие в окислительно-восстановительных реакциях

Ионы металлов с переменной валентностью могут также участвовать в переносе электронов. Например, в цитохромах (гемсодержащих белках) ион железа способен присоединять и отдавать один электрон:

Благодаря этому свойству цитохромы участвуют в окислительно-восстановительных реакциях.

3. Роль металлов в регуляции aктивности ферментов

Иногда ионы металлов выступают в роли регуляторных молекул. Например, ионы Са²⁺ служат активаторами протеинкиназы С, катализирующей реакции фосфорилирования белков. Ионы Са²⁺ также изменяют активность ряда кальций-кальмодулинзависимых ферментов.

Любой каталитический акт начинается с взаимодействия фермента и молекулы субстрата, то есть с тем веществом, на которое действует фермент. Участвующие в ферментативных реакциях молекулы субстратов часто имеют небольшие размеры по сравнению с молекулами ферментов. Поэтому было высказано предположение о том, что при образовании фермент-субстратных комплексов в непосредственный контакт с молекулой субстрата, очевидно, вступает ограниченная часть аминокислот пептидной цепи. Отсюда возникло представление об активном центре фермента.

Под активным центром подразумевают уникальную комбинацию аминокислотных остатков в молекуле фермента, обеспечивающую непосредственное связывание ее с молекулой субстрата и прямое участие в акте катализа (рис. 14.6). Темные полосы на рисунке – участки полипептидной цепи фермента; R – аминокислотные остатки и их порядковые номера (с N-конца). Установлено, что у сложных ферментов в состав активного центра входят также простетические группы.

Рис. 14. 6. Активный центр фермента

Аминокислотные остатки (АО), формирующие активный центр, могут находиться в различных участках полипептидной цепи, однако, непременно должны быть сближены в пространстве. Такое сближение достигается благодаря трёхмерной структуре молекулы белка.

Предполагают, что формирование активного центра фермента начинается уже на ранних этапах синтеза белка-фермента на рибосоме, когда линейная одномерная структура пептидной цепи превращается в трехмерное тело строго определенной конфигурации. Образовавшийся белок приобретает информацию совершенно нового типа, а именно функциональную (в частности, каталитическую). Любые воздействия, приводящие к денатурации, т.е. нарушению третичной структуры, приводят к искажению или разрушению структуры активного центра и соответственно потере ферментом каталитических свойств. Если при подходящих внешних условиях удается восстановить нативную трехмерную структуру белка-фермента (ренатурировать его), то восстанавливается и его каталитическая активность.

В активном центре условно различают так называемый каталитический центр, непосредственно вступающий в химическое взаимодействие с субстратом, и связывающий центр, или контактную («якорную») площадку, которая обеспечивает специфическое сродство к субстрату и формирование его комплекса с ферментом. В свою очередь молекула субстрата также содержит функционально различные участки: например, субстраты эстераз или протеиназ – одну специфическую связь (или группу атомов), подвергающуюся атаке со стороны фермента, и один или несколько участков, избирательно связываемых ферментом (рис. 14.7).

Рис. 14.7. Структура активного центра молекулы химотрипсина

Обычно активный центр формируют 12-16 аминокислотных остатков, иногда их может быть больше. Кроме аминокислотных остатков, участвующих в формировании активного центра выделяют ещё два их типа: вспомогательные, которые находятся рядом с активным центром и влияют на его реакционную способность; способствующие, которые удалённы АО, влияющие на конформацию всей молекулы фермента. Таким образом, от 1/2 до 2/3 всех АО ферментативного белка прямо или косвенно участвует в работе активного центра. Число активных центров в олигомерных ферментах может быть равно числу субъединиц, т. е. по одному активному центру на 1 субъединицу. Например, лактатдегидрогеназа состоит из четырёх субъединиц, каждая из которых имеет по активному центру. Активный центр может образовываться на месте контакта двух субъединиц. Тогда число активных центров будет меньше числа субъединиц.

Помимо активного центра в молекуле фермента может присутствовать также аллостерический центр (от греч. allos – другой, иной и steros – пространственный, структурный), представляющий собой участок молекулы фермента, с которым связываются определенные, обычно низкомолекулярные, вещества (эффекторы, или модификаторы), молекулы которых отличаются по структуре от субстратов. Иногда этих центров может быть несколько. Присоединение эффектора к аллостерическому центру изменяет третичную и часто также четвертичную структуру молекулы фермента и соответственно конфигурацию активного центра, вызывая снижение или повышение энзиматической активности. Ферменты, активность каталитического центра которых изменяется под влиянием аллостерических эффекторов, связывающихся с аллостерическим центром, получили название аллостерических ферментов.

Внутри клеток разных тканей и в самой клетке ферменты распределены неодинаково. Впервые это показал О. Варбург, который в 1913 г. определил, что процесс клеточного дыхания связан с осаждаемыми внутриклеточными частицами. Развитие метода дифференциального ультрацентрифугирования ускорило изучение внутриклеточной локализации ферментов. Биохимический анализ отдельных клеточных фракций показал, что ферменты расположены в различных органеллах соответственно их функции в обмене веществ (табл. 14.2).

В цитозоле (растворимая фракция) содержатся ферменты гликолиза, пентозофосфатного пути распада глюкозы, активации аминокислот, синтеза и распада гликогена, ферментный комплекс – синтетаза жирных кислот и др.

В митохондриях происходит большинство обменных процессов, которые обеспечивают энергией всю клетку. В них локализованы ферменты цикла Кребса, окислительного фосфорилирования, окисления жирных кислот, глутаматдегидрогеназа, синтетаза аминолевулиновой кислоты и др.

Лизосомы участвуют в процессах внутриклеточного переваривания. Содержат около 30 ферментов, главным образом гидролазы: рибонуклеазу, эстеразы, протеазы, Р-глюкуронидазу и др. Лизосомальные ферменты представляют интерес для медицины вследствие их участия в воспалительных процессах, повреждениях клеток, рассасывании ткани и некоторых наследственных метаболических заболеваниях.

Микросомальная фракция включает рибосомы и эндоплазматический ретикулум, где содержатся ферменты синтеза белков, холинэстераза, церулоплазмин, глюкозо-6-фосфатаза, g-глутамилтранспептидаза, ферменты конъюгации и др.

В ядре предположительно около 40 ферментов, в число которых входят репликативный комплекс, РНК-полимераза и, по-видимому, NАD-синтетаза.

Клеточная (плазматическая) мембрана содержит ферменты транспорта веществ – транслоказы, аденилатциклазу, 5-нуклеотидазу и некоторые др.

Таблица 14.2

Локализация некоторых ферментов внутри клетки

Активность ряда ферментов обнаруживается одновременно в нескольких органеллах.

Изоферменты: биологическая роль

Изоферменты, или изоэнзимы – это множественные формы фермента, катализирующие одну и ту же реакцию, но отличающиеся друг от друга по физическим и химическим свойствам, в частности по сродству к субстрату, максимальной скорости катализируемой реакции (активности), электрофоретической подвижности или регуляторным свойствам.

В живой природе имеются ферменты, молекулы которых состоят из двух и более субъединиц, обладающих одинаковой или разной первичной, вторичной или третичной структурой. Субъединицы нередко называют протомерами, а объединенную олигомерную молекулу – мультимером (рис. 14.8 а-г).

Считают, что процесс олигомеризации придает субъединицам белков повышенную стабильность и устойчивость по отношению к действию денатурирующих агентов, включая нагревание, влияние протеиназ и др. Однако на нынешнем этапе знаний нельзя ответить однозначно на вопрос о существенности четвертичной структуры для каталитической активности ферментов, поскольку пока отсутствуют методы, позволяющие в «мягких» условиях разрушить лишь четвертичную структуру. Обычно применяемые методы жесткой обработки (экстремальные значения рН, высокие концентрации гуанидинхлорида или мочевины) приводят к разрушению не только четвертичной, но и вторичной, и третичной структур стабильного олигомерного фермента, протомеры которого оказываются денатурированными и, как следствие, лишенными биологической активности.

Рис. 14.8. Модели строения некоторых олигомерных ферментов: а – молекула глутаматдегидрогеназы, состоящая из 6 протомеров (336 кДа); б – молекула РНК-полимеразы; в – половина молекулы каталазы; г – молекулярный комплекс пируватдегидрогеназы

Следует указать на отсутствие ковалентных, главновалентных связей между субъединицами. Связи в основном являются нековалентными, поэтому такие ферменты довольно легко диссоциируют на протомеры. Удивительной особенностью таких ферментов является зависимость активности всего комплекса от способа упаковки отдельных субъединиц. Если генетически различимые субъединицы могут существовать более чем в одной форме, то соответственно и фермент, образованный из двух или нескольких типов субъединиц, сочетающихся в разных количественных пропорциях, может существовать в нескольких сходных, но не одинаковых формах. Подобные разновидности фермента получили название изоферментов (изоэнзимов или, реже, изозимов).

Одним из наиболее изученных ферментов, множественность форм которого детально изучена методом гель-электрофореза, является лактатдегидрогеназа (ЛДГ), катализирующая обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную. Она может состоять из четырёх субъединиц двух разных Н- и М- типов (сердечный и мышечный). Активный фермент представляет собой одну из следующих комбинаций: НННН, НННМ, ННММ, НМММ, ММММ или Н₄, Н₃М, Н₂М₂, НМ₃, М₄. Они соответствуют изоферментам ЛДГ₁, ЛДГ₂, ЛДГ₃, ЛДГ₄, и ЛДГ₅. При этом синтез Н- и М-типов осуществляется различными генами и в разных органах экспрессируется по-разному.

Поскольку Н-протомеры при рН 7,0-9,0 несут более выраженный отрицательный заряд, чем М-протомеры, то изофермент Н₄ при электрофорезе будет мигрировать с наибольшей скоростью в электрическом поле к положительному электроду (аноду). С наименьшей скоростью будет продвигаться к аноду изофермент М₄, в то время как остальные изоферменты будут занимать промежуточные позиции (рис. 14.9).

Рис. 14.9. Распределение и относительное количество изоферментов ЛДГ в различных органах

Для каждой ткани в норме характерно свое соотношение форм (изоферментный спектр) ЛДГ. Например, в сердечной мышце преобладает тип Н₄, т. е. ЛДГ₁, а в скелетных мышцах и печени – тип М₄, т.е. ЛДГ₅.

Эти обстоятельства широко используют в клинической практике, поскольку изучение появления изоферментов ЛДГ (и ряда других ферментов) в сыворотке крови может представлять интерес для дифференциальной диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей. По изменению содержания изоферментов в сыворотке крови можно судить как о топографии патологического процесса, так и о степени поражения органа или ткани.

В одних случаях субъединицы имеют почти идентичную структуру и каждая содержит каталитически активный участок (например, b-галактозидаза, состоящая из четырё субъединиц). В других случаях субъединицы оказываются неидентичными. Примером последних может служить триптофансинтаза, состоящая из двух субъединиц, каждая из которых наделена собственной (но не основной) энзиматической активностью, однако, только будучи объединенными в макромолекулярную структуру, обе субъединицы проявляют триптофансинтазную активность.

Термин «множественные формы фермента» применим к белкам, катализирующим одну и ту же реакцию и встречающимся в природе в организмах одного вида. Термин «изофермент» применим только к тем множественным формам ферментов, которые появляются вследствие генетически обусловленных различий в первичной структуре белка (но не к формам, образовавшимся в результате модификации одной первичной последовательности).

Механизм действия ферментов

В 1903 г. В. Генри сделал вывод о том, что необходимой стадией ферментативного катализа является соединение фермента с субстратом, в результате чего образуется фермент-субстратный комплекс. Развитие этой идеи привело к созданию общей теории действия ферментов; особенно большой вклад в неё в 1913г. внесли Л. Михаэлис и М. Ментен. Согласно их гипотезе процесс ферментативного катализа можно разделить на три стадии:

1) диффузия субстрата к ферменту и стерическое связывание его с активным центром фермента, т.е. образование фермент-субстратного комплекса (ES);

2) преобразование первичного комплекса в один или несколько активированных фермент-субстратных комплексов (ES*, ES**…);

3) отделение продуктов (Р) реакции от активного центра и диффузия его в окружающую среду.

Первая стадия обычно непродолжительна и зависит от концентрации субстрата в среде, а также его диффузии к активному центру фермента. Комплекс образуется практически мгновенно. Субстрат присоединяется к активному центру в нескольких точках, образуя хелатные (клешневидные) комплексы. Присоединение осуществляется связями разного характера, в основном слабыми (водородные, электростатические, гидрофобные, координационные), ковалентные связи встречаются редко. На этой стадии изменение энергии активации незначительно, ориентация субстрата и активного центра способствует их сближению и прохождению реакции.

Вторая стадия наиболее медленная и лимитирует скорость всего катализа в целом. Её длительность зависит от энергии активации данной химической реакции. На этой стадии происходит расшатывание связей субстрата, их разрыв или образование новых связей в результате взаимодействия с активными группами фермента. Благодаря образованию активированных переходных комплексов снижается энергия активации реакции.

Третья стадия практически мгновенна. Она определяется скоростью диффузии продуктов реакции в окружающую среду.

Ферменты – истинные катализаторы. Они значительно повышают скорость строго определённых химических реакций, которые в отсутствии ферментов протекают очень медленно. Ферменты не могут влиять на положение равновесия ускоряемых реакций; при этом в ходе реакций они не расходуются и не претерпевают необратимых изменений.

Ферменты с термодинамической точки зрения ускоряют химические реакции за счет снижения энергии активации. Энергией активации называется энергия, необходимая для перевода всех молекул моля вещества в активированное (переходное) состояние при данной температуре. Фермент снижает энергию активации путем увеличения числа активированных молекул, которые становятся реакционноспособными на более низком энергетическом уровне (рис. 14.10).

Рис. 14.10. Энергетический механизм ферментативной и неферментативной химических реакций: S – исходный субстрат; Р – продукт; DЕнф – энергия активации неферментативной реакции; DЕф – энергия активации ферментативной реакции; DG – стандартное изменение свободной энергии

Существует два основных пути повышения скорости химической реакции. Первый путь – повышение температуры, т.е. ускорение теплового движения молекул, которое приводит к увеличению доли молекул, обладающих достаточной энергией для достижения переходного состояния. В этой точке существует равная вероятность того, что достигшие её молекулы вступят в реакцию с образованием продукта или вернутся на уровень непрореагировавших молекул. Скорость любой химической реакции пропорциональна концентрации молекул, находящихся в переходном состоянии.

Второй путь – добавление катализатора. Они ускоряют химические реакции, находя «обходные пути», позволяющие молекулам преодолевать активационный барьер на более низком энергетическом уровне. На промежуточной стадии реакции катализатор (С) взаимодействует с реагентом (А) с образованием нового комплекса СА, переходному состоянию которого соответствует значительно сниженная энергия активации по сравнению с переходным состоянием реагента А в некатализируемой реакции. Затем комплекс СА распадается на продукт (Р) и свободный катализатор, который может опять соединиться с другой молекулой А и повторить весь цикл:

Существуют четыре основных фактора, определяющих способность ферментов ускорять химические реакции.

1.Сближение и ориентация. Фермент способен связывать молекулу субстрата таким образом, что атакуемая им связь оказывается не только расположенной в непосредственной близости от каталитической группы, но и правильно ориентированной по отношению к ней. В результате вероятность того, что комплекс ES достигнет переходного состояния, сильно увеличивается (рис. 14.11).

2. Напряжение и деформация: индуцированное соответствие. Присоединение субстрата может вызывать конформационные изменения в молекуле фермента, которые приводят к напряжению структуры активного центра, а также несколько деформируют связанный субстрат, упрощая тем самым достижение комплексом ES переходного состояния.

При этом возникает так называемое индуцированное соответствие фермента субстрату. Таким образом, небольшие изменения третичной или четвертичной структуры относительно крупной молекулы фермента могут играть роль механического рычага для молекулы субстрата. Возможно, именно по этой причине ферменты представляют собой белки и, следовательно, по своим размерам значительно превосходят молекулы большинства субстратов.

3. Общий кuслотно-основный катализ. В активном центре фермента могут находиться группы специфических аминокислотных остатков, которые являются хорошими донорами или акцепторами протонов (рис. 14.12). Такие кислотные или основные группы общего типа представляют собой мощные катализаторы многих органических реакций, протекающих в водных системах.

Рис. 14.12. Функциональные группы аминокислотных остатков, принимающие участие в каталитических процессах: а – протон-донорные группы; б – протон-акцепторные группы

4. Ковалентный катализ. Некоторые ферменты реагируют со своими субстратами, образуя очень нестабильные, ковалентно связанные фермент-субстратные комплексы, из которых в ходе последующей реакции образуются продукты реакции, причем значительно быстрее, чем в случае некатализируемых реакций:

В некоторых ферментативных реакциях фермент замещает функциональную группу R в субстрате RX, в результате чего образуется ковалентный комплекс ЕХ. Он нестабилен и гидролизуется значительно быстрее, чем RX. К ферментам, осуществляющим ковалентный катализ, отноcится химотрипсин.

Перечисленные выше факторы, по-видимому, в различной степени ускоряют химические реакции. Однако для многих ферментов пока не известно точного механизма, обеспечивающего ускорение той или иной специфической реакции.

Специфичность действия ферментов

Ферменты обладают высокой специфичностью действия. Это свойство существенно отличает их от неорганических катализаторов. Высокая специфичность ферментов обусловлена конформационной и электростатической комплементарностью между молекулами субстрата и фермента и уникальной структурной организацией активного центра, что обеспечивает «узнавание», высокое сродство и избирательность протекания одной какой-либо реакции из тысячи других, осуществляющихся одновременно в живых клетках.

В зависимости от механизма действия различают три вида специфичности действия ферментов.

Относительной (или групповой) специфичностью обладают большинство ферментов, участвующих в процессе пищеварения. Так, для действия некоторых гидролитических ферментов наибольшее значение имеет тип химической связи в молекуле субстрата. Например, пепсин в одинаковой степени расщепляет белки животного и растительного происхождения несмотря на то, что эти белки существенно отличаются как по химическому строению и аминокислотному составу, так и по физико-химическим свойствам. Однако пепсин не расщепляет ни углеводы, ни жиры. Объясняется это тем, что точкой приложения действия пепсина является пептидная связь.

Абсолютной специфичностью действия называют способность фермента катализировать превращение только единственного субстрата. Любые изменения (модификации) в структуре субстрата делают его недоступным для действия фермента. Примерами таких ферментов могут служить аргиназа, расщепляющая в естественных условиях (в организме) аргинин, уреаза, катализирующая распад мочевины, и др.

Имеются экспериментальные доказательства существования так называемой стереохимической специфичности, обусловленной существованием оптически изомерных L- и D-форм или геометрических цис-и транс-изомеров химических веществ. Так, известны оксидазы L- и D-аминокислот, хотя в природных белках обнаружены только L-аминокислоты. Каждый из видов оксидаз действует только на свой специфический стереоизомер:

                                            Оксидаза D-аминокислот

Если какое-либо соединение существует в форме цис-и транс-изомеров с различным расположением групп атомов вокруг двойной связи, то, как правило, только один из этих геометрических изомеров может служить в качестве субстрата для действия фермента. Например, фумараза катализирует превращение только фумаровой кислоты (транс-изомер), но не действует на малеиновую кислоту (цис-изомер):

Таким образом, благодаря высокой специфичности действия ферменты обеспечивают протекание с большой скоростью лишь определенных химических реакций из огромного разнообразия возможных превращений в микропространстве клеток и всём организме, регулируя интенсивность обмена веществ.

В 1890 г. Фишер (Fischer) высказал предположение о том, что высокая специфичность действия ферментов обусловливается особой формой молекулы фермента, точно соответствующей форме молекулы субстрата (или субстратов). Эту гипотезу часто называют гипотезой «ключа и замка»: в ней субстрат сравнивается с «ключом», который точно подходит по форме к «замку», т. е. к ферменту (рис. 14.13).

Рис. 14.13. Образование нестойкого фермент-субстратного комплекса согласно теории Э. Фишера «ключ-замок»

Фермент-субстратный комплекс – это активированное состояние, ведущее к образованию продуктов реакции. Образовавшиеся продукты по форме уже не соответствуют активному центру. Они отделяются от него (поступают в окружающую среду), после чего освободившийся активный центр может принимать новые молекулы субстрата.

В 1959 г. новую интерпретацию гипотезы «ключа и замка» предложил Д. Кошланд. На основании данных, позволявших считать ферменты и их активные центры физически более гибкими, чем это казалось вначале, он предложил идею о динамическом взаимодействии между ферментом и субстратом. Согласно этому представлению субстрат, соединяясь с ферментом, вызывает изменения в структуре последнего. Аминокислотные остатки, составляющие активный центр фермента, принимают определенную форму, которая дает возможность ферменту наиболее эффективным образом выполнять свою функцию (рис. 14.14.)

Рис. 14.14 Изменения структуры активного центра фермента, вызванные субстратом, согласно модели Д. Кошланда: 1 – активный комплекс; 2 – неактивный комплекс; А, В, С – функциональные группы активного центра

Эту гипотезу называют гипотезой индуцированного соответствия. Подходящей аналогией в этом случае может служить перчатка, которая при надевании на руку соответствующим образом изменяет свою форму. С выяснением отдельных деталей механизма различных реакций в эту гипотезу вносятся уточнения. Выяснилось, например, что молекулы субстрата в некоторых случаях несколько изменяют свою форму еще до того, как вступить в соединение с ферментом.

Стационарная кинетика ферментативных реакций

Кинетика ферментативных реакций – раздел энзимологии, изучающий зависимость скорости химических реакций, катализируемых ферментами, от химической природы реагирующих веществ, а также факторов окружающей среды. Чтобы понять и правильно оценить результаты определения ферментативной активности, нужно совершенно отчётливо представлять себе, от каких факторов зависит скорость реакции, какие условия оказывают влияние на неё. Таких условий много. Прежде всего, это соотношение концентраций самих реагирующих веществ: фермента и субстрата. Также важны условия, в которых протекает реакция: температура, кислотность, присутствие регуляторных молекул (активаторов и ингибиторов), солей и других примесей, способных как ускорить, так и замедлить ферментативный процесс, и т.д.

Концентрация субстрата

Одним из наиболее существенных факторов, определяющих скорость ферментативной реакции, является концентрация субстрата (или субстратов) и продукта (продуктов). В случае постоянной концентрации фермента скорость реакции постепенно увеличивается, достигая определенного максимума (рис. 14.15), при котором дальнейшее увеличение количества субстрата практически не оказывает влияния на скорость ферментативной реакции. В таких случаях принято считать, что субстрат находится в избытке, а фермент полностью насыщен, т. е. все молекулы фермента связаны с субстратом. Фактором, ограничивающим скорость реакции, при этом становится концентрация фермента.

Рис. 14.15 График зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента

Концентрация фермента

Скорость любой ферментативной реакции непосредственно зависит от концентрации фермента (рис.14.16). Линейная зависимость между этими величинами, когда скорость реакции прямо пропорциональна количеству присутствующего фермента, справедлива только в определенных условиях, например в начальный период ферментативной реакции, т. к. в этот период практически не происходит обратной реакции, а концентрация продукта оказывается недостаточной для обратимости реакции. Именно в этом случае скорость реакции (точнее, начальная скорость реакции v) будет пропорциональна концентрации фермента.

Рис. 14.16 Зависимость скорости реакции от концентрации фермента в присутствии избытка субстрата

Температура

Скорость химических реакций зависит и от температуры, поэтому катализируемые ферментами реакции также чувствительны к её изменениям. Установлено, что скорость большинства биохимических реакций повышается в 2 раза при повышении температуры на 10°С и, наоборот, снижается в 2 раза при понижении температуры на 10°С. Этот показатель получил название температурного коэффициента. Однако вследствие белковой природы фермента тепловая денатурация при повышении температуры будет снижать эффективную концентрацию фермента с соответствующим снижением скорости реакции. Так, при температуре, не превышающей 45-50°С, скорость реакции увеличивается согласно теории химической кинетики. При температуре выше 50°С на скорость реакции большое влияние начинает оказывать тепловая денатурация белка-фермента, приводящая к полному прекращению ферментативного процесса (рис. 14.17).

Таким образом, термолабильность, или чувствительность к повышению температуры, является одним из характерных свойств ферментов, резко отличающих их от неорганических катализаторов. В присутствии последних скорость реакции возрастает экспоненциально при повышении температуры (кривая «а» на рис. 14.17). При температуре 100°С почти все ферменты утрачивают свою активность: Исключение составляет, очевидно, только один фермент мышечной ткани – миокиназа, которая выдерживает нагревание до 100°С.

Оптимальной для действия большинства ферментов теплокровных животных является температура 40°С; в этих условиях скорость реакции оказывается максимальной вследствие увеличения кинетической энергии реагирующих молекул. При низких температурах (0°С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля.

Рис. 14.17 Зависимость скорости катализируемой ферментом реакции от температуры: а – повышение скорости реакции как функция температуры; б - снижение скорости реакции как функция денатурации белка-фермента

Во всех случаях имеет значение время воздействия соответствующей температуры. Следует отметить, что на термолабильность ферментов определенное влияние оказывают концентрация субстрата, величина рН среды и другие факторы.

Величина рН среды

Ферменты обычно наиболее активны в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов, соответствующей для животных тканей в основном выработанным в процессе эволюции физиологическим значениям рН среды 6,0–8,0. При графическом изображении на кривой колоколообразной формы имеется определенная точка, в которой фермент проявляет максимальную активность; эту точку называют оптимумом рН среды для действия данного фермента (рис. 14.18).

При определении зависимости активности фермента от концентрации водородных ионов реакцию проводят при разных значениях рН среды, обычно при оптимальной температуре и достаточно высокой (насыщающей) концентрации субстрата. В табл. 14.3 приводятся оптимальные значения рН среды для ряда ферментов.

Рис. 14.18 Зависимость скорости реакции от значения рН

Из данных табл. 14.3 видно, что рН-оптимум действия ферментов лежит в пределах физиологических значений. Исключение составляет пепсин, рН-оптимум которого 2,0 (при рН 6,0 он неактивен и нестабилен). Объясняется это, во-первых, структурной организацией молекулы фермента и, во-вторых, тем, что пепсин является компонентом желудочного сока, содержащего свободную соляную кислоту, которая создает оптимальную кислую среду для действия этого фермента. С другой стороны, рН-оптимум аргиназы лежит в сильнощелочной зоне (около 10,0); такой среды нет в клетках печени, следовательно, in vivo аргиназа функционирует, по-видимому, не в своей оптимальной зоне рН среды.

Таблица 14.3

Оптимальные значения рН для некоторых ферментов

Согласно современным представлениям влияние изменений рН среды на молекулу фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислотных и основных групп (в частности, СООН-группы дикар-боновых аминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гисти-дина, NH₂-группы лизина и др.). При резких сдвигах от оптимума рН среды ферменты могут подвергаться конформационным изменениям, приводящим к потере активности вследствие денатурации или изменения заряда молекулы фермента. При разных значениях рН среды активный центр может находиться в частично ионизированной или неионизированной форме, что сказывается на третичной структуре белка и соответственно на формировании активного фермент-субстратного комплекса. Кроме того, имеет значение состояние ионизации субстратов и кофакторов.

Уравнение Михаэлиса-Ментен

Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является получение информации, которая может способствовать выяснению молекулярного механизма действия фермента.

Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям. Известно, что любая химическая реакция характеризуется константой термодинамического равновесия. Она выражает состояние химического равновесия, достигаемого системой, и обозначается К_р. Так, для реакции

константа равновесия равна произведению концентраций образующихся веществ, деленному на произведение концентрации исходных веществ. Значение константы равновесия обычно находят из соотношения констант скоростей прямой (k₊₁) и обратной (k-₁) реакций, т.е. К_p = k₊₁/k-₁. В состоянии равновесия скорость прямой реакции: v₊₁ = k₊₁[А]·[B] равна скорости обратной реакции: v₁ = k_-1 [С]·[D], т. е. v₊₁ = v_-1 соответственно k₊₁[А]·[B] = k_-1[С]·[D], или

.

Отсюда,

Таким образом, константа равновесия равна отношению констант скоростей прямой и обратной реакций. Величину, обратную константе равновесия, принято называть в случае ферментативной реакции константой диссоциации фермент–субстратного комплекса, и обозначать символом K_S. Так, в реакции

т.е. K_S равна отношению произведения концентрации фермента и субстрата к концентрации фермент-субстратного комплекса или отношению констант скоростей обратной и прямой реакций. Следует отметить, что константа K_S зависит от химической природы субстрата и фермента и определяет степень их сродства. Чем ниже значение K_S, тем выше сродство фермента к субстрату.

При изучении кинетики ферментативных реакций следует учитывать одну важную особенность этих реакций, не свойственную обычным химическим реакциям и связанную с явлением насыщения фермента субстратом. При низкой концентрации субстрата зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 14.19) ляется почти линейной и подчиняется кинетике первого порядка.

Рис. 14.19. График зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента: а – реакция первого порядка; б – реакция смешанного порядка; в – реакция нулевого порядка

Это означает, что скорость реакции S→Р прямо пропорциональна концентрации субстрата S и в любой момент времени t определяется следующим кинетическим уравнением:

,

где [S] – молярная концентрация субстрата; –d[S]/dt – скорость убыли субстрата; k' – константа скорости реакции, которая в данном случае имеет размерность, обратную единице времени (мин^–1 или с^–1).

При высокой концентрации субстрата скорость реакции максимальна, постоянна и не зависит от концентрации субстрата. В этом случае реакция подчиняется кинетике нулевого порядка v = k′′ (при полном насыщении фермента субстратом) и целиком определяется концентрацией фермента. Кроме того, различают реакции второго порядка, скорость которых пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ. В определенных условиях при нарушении пропорциональности иногда говорят о реакциях смешанного порядка (см. рис. 14.19).

Изучая явление насыщения, Л. Михаэлис и М. Ментен разработали общую теорию ферментативной кинетики. Они исходили из предположения о том, что ферментативный процесс протекает в виде следующей химической реакции:

т.е. фермент Е вступает во взаимодействие с субстратом S с образованием промежуточного комплекса ES, который далее распадается на свободный фермент и продукт реакции Р. Принимая во внимание, что скорость ферментативной реакции определяется константой каталитического превращения фермент-субстратного комплекса (k₊₂) и его концетрации, Михаэлис и Ментен предложили уравнение, выражающее количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции:

где v – наблюдаемая скорость реакции при данной концентрации субстрата; K_S– константа диссоциации фермент-субстратного комплекса, моль/л; V_max– максимальная скорость реакции при полном насыщении фермента субстратом.

Из уравнения Михаэлиса–Ментен следует, что при высокой концентрации субстрата и низком значении K_S скорость реакции является максимальной, т.е. v = V_max (реакция нулевого порядка, см. рис. 14.19). При низкой концентрации субстрата, скорость реакции напротив, оказывается прямопропорциональной концентрации субстрата в каждый данный момент (реакция первого порядка).

Следует указать, что уравнение Михаэлиса-Ментен в его классическом виде не учитывает влияние на скорость ферментативного процесса продуктов реакции и носит несколько ограниченный характер.

В связи с этим были предприняты попытки усовершенствовать уравнение, что было сделано Бриггсом и Холдейном:

,

где К_m - константа Михаэлиса, являющаяся экспериментально определяемой величиной. Она может быть представлена следующим уравнением:

, или .

В числителе – константы скоростей распада комплекса ES в двух направлениях (в сторону исходных Е и S и в сторону конечных продуктов реакции Е и Р). Отношение k_–1/ k₊₁ представляет собой константу диссоциации фермент-субстратного комплекса K_S. Тогда

Отсюда вытекает важное следствие: константа Михаэлиса всегда больше константы диссоциации фермент-субстратного комплекса K_S на величину k₊₂/k₊₁.

Для определения численного значения К_m обычно находят ту концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной реакции v составляет половину от максимальной V_max, т.е. если v = ¹/₂ V_maх. Подставив значение v в уравнение Бриггса–Холдейна, получаем:

.

Разделив обе части уравнения на V_mах, получим:

,

откуда Km  =  [S]

Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной.

Определение величины К_m имеет важное значение при выяснении механизма действия эффекторов на активность ферментов и т.д. Константу Михаэлиса можно вычислить по графику (рис. 14.20).

Рис. 14.20. Гиперболическая зависимость начальной скорости катализируемой ферментом реакции от концентрации субстрата (график уравнения Михаэлиса-Ментен)

Отрезок на абсциссе, соответствующий скорости, равной половине максимальной, будет представлять собой К_m.

Единицы ферментов

Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет известные трудности поскольку, за редким исключением ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных, согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции. Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности в условных единицах Комиссией по ферментам Международного биохимического союза была рекомендована стандартная международная единица (Е или U): за единицу активности любого фермента принимается то его количество, которое в оптимальных условиях катализирует превращение одного микромоля субстрата или образование одного микромоля продукта в минуту (мкмоль/мин). Единицы активности фермента выражают также в наномолях (10^-9моль) и пикомолях (10^-12 моль).

В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено новое выражение активности фермента в каталах (кат, kat): 1 кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 молю в 1 с (1 моль/с). Отношение международной единицы (U) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 моль·с^-1 = 60 моль·мин^-l = 60·10⁶ мкмоль·мин^-l = 6·10⁷U, или 1 U = 1 мкмоль·мин^-l = 1/60) мкмоль·с^-l = 1/60) мккат = 16,67 нкат. Таким образом, 1 U фермента соответствует 16,67 нкат.

Кроме того, рекомендовано измерять активность фермента при температуре 25°С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому порядку реакции в отношении субстрата и зависит только от концентрации фермента.

В практике для выражения активности часто пользуются произвольными понятиями удельной и молярной активности. Удельную активность фермента принято выражать числом единиц ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг активного белка). Количество молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в продукт в процессе реакции в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом, принято называть числом оборотов фермента, или молярной активностью (молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г/моль фермента). Так, одна молекула каталазы эритроцитов способна, например, расщепить в одну секунду 44000 молекул перекиси водорода. В то же время для того, чтобы 1 атом неорганического железа, также катализирующий распад H₂O₂, расщепил такое число молекул H₂O₂, которое расщепляет каталаза в одну секунду, потребовалось бы несколько лет. Этот пример является наглядным доказательством одного из главных свойств ферментов – их высокой каталитической активности.

содержание      ..     12      13      14      15     ..