содержание .. 9 10 11 12 ..

Руководство по иммунофармакологии - часть 11

140

Глава 13

Места расщепления при образовании кининов

Рис. 60. Аминокислотная

последовательность брадикинина. В

верхней части рисунка указаны места

протеолитического расщепления при

образовании брадикинина, в нижней-

места расщепления при его инактивации.

(второй профермент во внутреннем коагуля-

добные протеиназы серина, которые обнару-

ционном каскаде, который ведет к образованию

живаются во многих органах: в поджелудоч-1

фибрина в плазме). Участок взаимодействия

ной железе, почках, слюнных железах, толстом j

между высокомолекулярным кининоге-ном и

кишечнике, коже, крови. В настоящее время

прекалликреином находится на легкой цепи

имеется подробное описание только двух кал-1

высокомолекулярного кинина. Образуется

ликреиновых систем: калликреин-фактор Ха-

комплекс высокомолекулярный кининоген-

гемана и тканевая калликреиновая система. Из

прекалликреин или высокомолекулярный ки-

табл. 12, где даны характеристики обеих си-

ниноген-фактор XI. Возможная значимость

стем, видно, что плазменные и тканевые калли- J

комплексов состоит в активации компонентов

креины весьма различны: это разные и не

контактной системы или фактора Хагемана, что

связанные между собой ферменты.

обсуждается ниже.

(Фактор Хагемана, или

Тканевые калликреины. Тканевые калликре-

фактор XII, является первым проферментом в

ины почек, поджелудочной железы, бронхоле-

коагуляционном каскаде.)

гочных тканей и слюнных желез родственны

между собой по антигенному составу, но отли-

Калликреины

чаются от калликреинов плазмы и кожи. Тка-

невые калликреины высвобождают лиз-бради-

Многие ферменты, например трипсин и плаз-

кинин из кининогенов, а их физиологическая

мин, способны высвобождать кинины из кини-

роль, возможно, заключается в контроле дви-

ногенов. Термин «калликреин» обозначает ки-

жения жидкости из сосудистого русла в экзо

нингенерирующий фермент, хотя первоначаль-

но он использовался для определения только

кинингенерирующего фермента из поджелудо-

Таблица 12. Плазменный и тканевой калликреин: сравни-

тельные данные

чной железы. Калликреины-это трипсинопо-

Таблица 11. Сравнительные характеристики высоко- и низ-

комолекулярного кининогена

Кинины

141

Рис. 61. Схематическая структура

высокомолекулярного кининогена, которая

показывает место нахождения брадикинина

(БК) в непосредственной близости от

обогащенной гистидином области легкой

цепи расщепленной молекулы (по Han и

др., 1976).

кринные железы и почки. Недавние исследова-

Активация плазменного прекалликреина

ния показали, что тканевой калликреин может

фактором Хагемана происходит при наличии

также активировать гормоны и р-фактор роста

отрицательно заряженной поверхности. На рис.

нервов посредством расщепления прогормона

62 дана схема молекулярного механизма

при секреции. Калликреин мочи, кроме того,

действия высокомолекулярного кининогена в

активирует проренин. Таким образом, семей-

качестве кофактора при взаимодействии фак-

ство родственных ферментов обладает разно-

тора Хагемана и прекалликреина на такой

образными внутри- и внеклеточными функ-

поверхности. Таким образом, источник кини-на,

циями, не связанными с образованием ки-

родительская молекула кининогена, цир-

нинов.

кулирует в комплексе с предшественником

Калликреиновая система плазмы калликре-

фермента, который может выделять тот же

ин-фактор Хагемана. В табл. 13 приведены

кинин. Поверхность облегчает действие и ак-

сведения о прекалликреине плазмы, профер-

тивацию фактора Хагемана и прекалликреина с

менте плазменного калликреина (форма, в ко-

последующим образованием кинина. На рис. 63

торой эта молекула циркулирует в плазме).

показаны некоторые другие из возможных

Два других профермента, фактор Хагемана

последовательностей

активации

фактора

(фактор XII) и фактор XI системы коагуляции,

Хагемана, которые могут иметь важное значе-

а также С1г и Cls системы комплемента (см.

ние при воспалении. К ним относится превра-

главу 12) обладают очень сходной структурой,

щение проренина в ренин и плазминогена-в

механизмом активации, одним ингибитором

плазмин, а также С1 (а возможно, и С5) системы

(Cl-ингибитор), что позволяет предположить

комплемента и активация как внутренней, так и

редупликацию гена при их эволюционном раз-

внешней коагуляционных систем.

витии.

Многие отрицательно заряженные вещества

могут служить поверхностью, на которой

облегчаются взаимодействие и активация фак-

Таблица 13. Характеристики плазменного прекалликреина

тора Хагемана и прекалликреина. К ним отно-

и фактора Хагемана

сятся гликозаминогликаны, бактериальные ли-

Прекалли-

Фактор

пополисахариды, гломерулярная базальная

креин

Хагемана

мембрана, коллагены, эластины и кристаллы

Молекулярная масса

85000

80000

уратов натрия. Они могут появляться или

Активационные фрагменты

50000

выделяться при воспалении, облегчая тем са-

Трипсиноподобные серино-

30000

мым активацию фактора Хагемана.

вые протеиназы

Инактивация ингибитором

Клеточные ферменты. Базофилы и тучные

С1

+ 50

клетки при активации анти-IgE антителами или

+ 25

Концентрация в плазме,

антигеном выделяют фермент

(протеиназа

мкг/мл

серина), способствующий образованию кинина

из кининогена. Это обеспечивает прямую связь

между аллергией и образованием кинина. Эн-

142

Глава 13

дотелиальные клетки кроликов также обладают

брадикининов, таким образом инактивируя их.

ферментом, активирующим фактор Хаге-мана.

Активный фермент локализуется на люми-

нальной поверхности эндотелиальных клеток.

Кининазы

Примерно половина кининазы II организма

находится в легких, которые в связи с этим

Кининаза II (ангиотензинконвертирующий

являются главным местом метаболизма кини-

фермент)

нов. Данный фермент также отщепляет две С-

терминальные аминокислоты от ангиотен-зина

Этот металлофермент, содержащий цинк, яв-

I, превращая его в ангиотензин II, мощный

ляется пептидилдипептидазой с молекулярной

сосудосуживающий

пептид.

Аффинитет

массой примерно 150000, который отщепляет

кининов к ферменту в 100 раз выше, чем у

две С-концевые аминокислоты

(фен-арг) от

ангиотензина I (Km-10-7 и 10-5 соответственно).

Следовательно, брадикинин может

Рис. 62. Молекулярная модель контактной активации системы фактора Хагемана. Показаны два (А и

Б) альтернативных пути. Отрицательно заряженные поверхности изображены в нижней части

каждой диаграммы. Для обозначения молекул используются следующие сокращения: фХ-фактор

Хагемана; фХа-активированный фактор Хагемана; ПК-прекалликреин; К- калликреин; Х1-фактор XI

системы коагуляции; Х1а-активированный фактор XI; ВМ Кгн-высокомолекулярный кининоген.

Схема А. верх: фХ связывается с отрицательно заряженной поверхностью. Комплекс ПК и ВМ Кгн в

растворе представляет отрицательно заряженную поверхность. фХ на поверхности чувствителен к

ферментативному расщеплению и активации (отмечено зигзагообразной стрелкой). В расщеплении

фХ в плазме наиболее часто участвует калликреин, показанный здесь как расщепляющий фермент;

однако возможно вовлечение и других ферментов. Хотя это никак не обозначено, калликреин

действует значительно активнее, когда ВМ Кгн связан непосредственно с фХ. Средняя и нижняя

диаграммы: фХ активирует ПК с образованием К. Нижняя диаграмма: фХ расщепляется в месте 2 с

образованием р-фХа (активный фрагмент с м. м. = 28000). который выделяется в супернатант. В

альтернативном представленному на схеме А случае фХ расщепляется только в месте 1 (т.е. в

пределах дисульфидной петли) и затем в виде а-фХа остается присоединенным к поверхности. Схема

Б: фХ присоединяется к поверхности и активируется ферментом, чаще всего калликреином. ВМ Кгн

и ПК присоединяются к его связям к поверхности. На средней и нижней диаграммах фХа в форме а-

фХа, расщепленного в месте 1, затем расщепляет и активирует фактор XI системы коагуляции,

который присоединяется к поверхности рядом с фХ с помощью ВМ Кгн. а-фХа и Х1а в основном

остаются связанными с поверхностью [Cochrane, Griffin.- Amer. J. Med., 1979, 67, 657].

Рис. 63. Возможные пути активации

системы фактора Хагемана.

и косвенно влиять на сосудистый тонус, успеш-

включая тимоциты. Они оказывают как прямое

но конкурируя с ангиотензином I за фермент

действие, так и непрямое влияние через

кининазу II. Ингибиторы кининазы I, произ-

метаболиты арахидоновой кислоты, гистамин,

водные пептидов из змеиного яда (например,

серотонин, вазопрессин и катехоламины. Од-

SQ 20881) оказались чрезвычайно полезными

нако до настоящего времени не существует

при определении значимости инактивации бра-

общепринятых взглядов на их роль в физиоло-

дикинина и образования ангиотензина И в раз-

гии и в воспалении. В значительной мере это

личных условиях, например, при разных типах

обусловлено неудачными попытками создания

шока и при регуляции артериального давле-

специфических ингибиторов калликреинов и

ния.

аналогов брадикининов, которые позволили бы

оценить вклад кининов в биологические

процессы.

Карбоксипептидаза N (кининаза I,

карбоксипептидаза В, инактиватор

Рецепторы для кининов идентифицированы

на различных клетках, они достаточно специ-

анафилатоксина)

фичны и обладают высокой константой диссо-

Металлофермент, содержащий цинк, с молеку-

циации (10-9 М). Эти рецепторы модулируются

лярной массой около 300000, присутствует в

стероидными гормонами. Механизм влияния

плазме в концентрации 30-40 мкг/мл. Он от-

кининов на клеточные функции пока неясен.

щепляет С-концевые основные аминокислоты

Однако вследствие взаимодействия с клетками

у некоторых биологически активных пепти-

(предположительно

через

специфические

дов-брадикинина, лиз-брадикинина, фибрино-

рецепторы)

брадикинин

стимулирует

пептидов, СЗа, С4а и С5а. Вероятно, карбокси-

метаболизм фосфатидилинозитола, а также

пептидаза N является главным инактиватором

арахидоновый обмен и метаболизм циклических

СЗа, С4а и С5а в плазме, но кинины инакти-

нуклеотидов. В вызываемых брадикини-ном

вируются ею значительно медленнее.

изменениях в клетке принимает участие

Другие клеточные пептидазы также могут

кальций, однако механизмы внутриклеточной

инактивировать брадикинин или ангиотензин;

передачи сигнала еще не определены.

их значимость еще предстоит определить.

Действие кининов на кровеносные сосуды

осуществляется, по крайней мере частично,

через метаболизм арахидоновой кислоты. Так,

Фармакологические эффекты кининов

взаимодействие кининов с рецепторами кле-

Кинины могут давать расслабление или со-

точной поверхности приводит к активации

кращение гладких мышц различных органов,

ацилгидролаз

(например, фосфолипазы А2),

увеличивать проницаемость сосудов и вызы-

которые высвобождают арахидоновую кислоту

вать боль. Кроме того, кинины обладают ря-

из фосфолипидов. По-видимому, кинины

дом других эффектов (см. Fujii et al., 1979):

влияют и на другие этапы метаболического пути

например, они стимулируют пролиферацию

арахидоновой кислоты, так как они изби-

различных типов клеток in vivo и in vitro,

рательно увеличивают образование ПГЕ (ва-

144

Глава 13

зодилататор) в артериях и ПГF (вазоконстрик-

действие. Кинины влияют также на метабо лизм

тор) в венах. Такое различие обусловлено,

мышц, репродуктивные органы, функция

вероятно, активацией ПГЕ

9-кеторедуктазы

желудочно-кишечного тракта и центральную

кининами в венах. Возможно, что внутрисосу-

нервную систему.

дистые кинины не достигают гладкомышечных

клеток, поскольку эндотелиальные клетки об-

Брадикинин при воспалении и патологии

разуют относительно непроницаемый слой с

высокой кининазной активностью. В то же

Хотя кинины способны вызывать классические

время между эндотелиальными и подлежащими

признаки воспаления (отек, покраснение, жар и

гладкомышечными клетками существуют

боль), технически невозможно прямо дока-зать,

тесные контакты. Так, кинины могут вызывать

что они являются важными медиаторами

сокращение или расслабление мышц посред-

воспаления. Отсутствие необходимой инфор-

ством внутриклеточных сигналов, например

мации в значительной мере обусловлено следу|

простагландинов. Эти передатчики действуют на

ющим: а) отсутствием специфических антаго-

протеинкиназы, зависимые от циклических

нистов кининов или ингибиторов ферментом

нуклеотидов, которые регулируют взаимодей-

генерирующих кинины, хотя в настоящее время

ствие актин-миозин-АТФ под влиянием

описаны предполагаемые антагонисты; б) не

кальмодулина.

возможностью изменения скорости и ампли

Влияние кининов на сосудистую проницае-

туды активации и инактивации кининов в об-

мость осуществляется на уровне посткапил-

ласти воспаления; в) вовлечением в большин-

лярных венул, что было установлено при

ство воспалительных явлений многих медиа-

электронной микроскопии и радиоизотопных

торных систем (например, кинины, метаболия

исследованиях. Увеличение проницаемости мо-

ты арахидоновой кислоты, гистамин, серото-

жет быть связано с сокращением эндотелиаль-

нин, ангиотензин, СЗа, С4а, С5а, свободные

ных клеток и расширением межклеточных

радикалы кислорода, продукты расщепления

сочленений и предупреждается агонистами (3-

фибрина, протеолитические ферменты и др.).

адренорецепторов. Этот процесс требует

Тем не менее существуют методы, позво-

определенной энергии и, по-видимому, опо-

ляющие оценить состояние кинингенерирую-

средуется простагландинами.

щих систем, например системы фактор Хаге-

Другие медиаторы

(такие, как гистамин),

мана- прекалликреин- высокомолекулярный

кининоген. Несмотря на относительную гру-

участвующие в воспалительном процессе, могут

сильно изменить нормальную реакцию клеток

бость этих методов, они дают возможность

определить генерирование кининов при ряде

на брадикинин. Поэтому эффекты бра-дикинина

при воспалении

нельзя

рассматривать

состояний.

изолированно: здесь следует учитывать

Наследственный ангионевротиче-ский отек-

сложную сеть взаимодействующих медиаторов.

это врожденное доминантное аутосомное

заболевание, проявляющееся по-вторными

эпизодами отека и обусловленное отсутствием

Физиологические эффекты кининов

(или наличием дефектного) ингибитора С1.

Ингибитор С1 является главным ингибитором

Роль калликреин-кининовой системы в органах

и в целостном организме животных изучена

активированного

фактора

Хаге-мана,

калликреина плазмы, а также Cls и С1г системы

недостаточно и представлена совокупностью

многих различных эффектов. Например, бра-

комплемента. Во время эпизодов отека

обнаруживается активация системы комп-

дикинин в сердечно-сосудистой системе оказы-

вает прямое действие на сердечную мышцу,

лемента и системы фактора Хагемана. Недавние

исследования показали, что независимо от

вызывает расширение артерий и сужение вен,

увеличивает число функционирующих капил-

вклада какой-либо из этих систем (или обеих) в

формирование отека особо важную роль в

ляров и повышает проницаемость сосудов.

Кроме того, брадикинин оказывает непрямое

развитии данного состояния играет контактная

влияние через выделение катехоламинов и через

система (фактор Хагемана).

Подагра- это острый воспалительный

нервные рефлексы, регулирующие частоту

сердечных сокращений и сосудистый тонус.

артрит, вызываемый известным специфическим

агентом-кристаллами уратов натрия. Кристаллы

Ранее отмечались подобные эффекты брадики-

нина в легких, включая бронхосуживающее

уратов натрия служат поверхностью для

активации системы фактора Хагема-

Кинины

145

на. По имеющимся данным, фактор Хагемана

мирование происходит преимущественно в

активируется при подагре, а в воспаленном

брюшной полости, что приводит к накоплению

суставе определяется высокий уровень кини-

перитонеальной жидкости и вызывает сильные

нов. Вместе с тем известно, что кристаллы

боли.

уратов натрия активируют комплемент, тром-

Активация in vitro системы фактора Хаге-

боциты и нейтрофилы. Действительно, воспа-

мана с последующим генерированием кининов,

ление, вызванное введением уратов натрия в

как и их внутрикожное введение, вызывают

суставы собак, может быть устранено удале-

воспаление. Всего лишь 2,5 нг активированного

нием нейтрофилов. Таким образом, роль раз-

фактора Хагемана повышает проницаемость

личных механизмов в активации системы фак-

сосудов. Такое количество фактора Хагемана

тора Хагемана остается неясной.

составляет 0,01% его содержания в 1 мл плазмы.

Гипотензию и внутрисосудистую коагуля-

Установлено, что система фактора Хагемана

цию при септическом шоке и сыпном тифе

является медиатором многих других состояний,

связывают с активацией фактора Хагемана. Ряд

включая аллергические реакции, карциноидный

данных свидетельствует в пользу активации

синдром, демпинг-синдром после гастрэктомии,

системы фактора Хагемана у человека и

заболевания

коронарных

артерий,

экспериментальных животных при данных

внутрисосудистую коагуляцию, нефротический

состояниях, что предполагает генерирование

синдром и мигрень. Однако определить

активных компонентов и кининов. Однако

конкретный вклад образования кининов в

вклад выделившихся кининов в развитие дан-

общую воспалительную реакцию удается не

ного синдрома неясен. Активированный фактор

всегда,

что

связано

отсутствием

Хагемана способен вызывать гипотензию, что

специфических антагонистов.

четко установлено у людей: при введении

Наконец, не следует забывать, что отсут-

концентратов альбумина, загрязненных акти-

ствие в циркуляции определяемых количеств

вированным фактором Хагемана, наблюдается

высоко- и низкомолекулярных кининогенов

резкое снижение артериального давления.

(аутосомно-рецессивное наследование) может

Недавно из жидкости, полученной при

не иметь клинических проявлений. Хотя таких

бронхиальном лаваже у больных бронхиальной

людей выявлено очень мало, у них нет явной

астмой, вместе с лиз-брадикинином был

тенденции к инфекциям или каким-либо симп-

выделен уникальный калликреин тканевого ти-

томам дефицита воспалительных реакций. Более

па. Постоянное образование кинина при забо-

того, лица с дефицитом фактора Хагемана или

леваниях бронхов может играть первостепен-

калликреина не страдают от кровотечений и не

ную роль в возникновении бронхоспазма и, как

имеют других явных признаков дефицита

правило, ведет к увеличению продукции мета-

защитных механизмов. В то же время следует

болитов арахидоната и важных бронхокон-

помнить, что первые описанные больные с

стрикторных лейкотриенов. Изучение аллерги-

дефицитом С2 были клинически здоровыми,

ческого ринита показало, что в его развитии

хотя в настоящее время известно, что 50% таких

принимают участие лиз-брадикинин и бради-

больных

страдают

аутоиммунными

кинин. После предъявления аллергена в на-

заболеваниями.

чальном лаваже обнаруживаются кинины и

калликреины, а также плазменные и тканевые

кининогены, присутствующие во время аллер-

Кинины немлекопитающих

гических симптомов.

Одним из главных симптомов острого пан-

В отличие от млекопитающих, у которых ки-

креатита является выраженная гипотензия. Она

нингенерирующие системы циркулируют в не-

вызывается сочетанием гиповолемии и

активной форме и активируются локально, в

выделения в циркуляцию гипотензивных ве-

ядовитом мешочке ос и шершней присутствуют

ществ. Два панкреатических фермента-трипсин

активные кинины. Кожа амфибий также

и калликреин- способны высвобождать ки-нин

чрезвычайно богата активными брадики-нинами.

из кининогена; активный калликреин под-

Неизвестно, правда, насколько важны такие

желудочной железы идентифицирован в крови

кинины, служат ли они для защиты организма,

больных острым панкреатитом. Как показы-

для транспорта или других целей.

вают клинические исследования и экспери-

Кинины немлекопитающих обладают час-

менты на собаках, данный кинин образуется

тичной гомологией с брадикинином.

при остром панкреатите, причем его фор-

146

Глава 13

Лейкокинин

в действии других гормонов. Рецепторы к БК не

выделены и не охарактеризованы биохими-

Лейкокинины представляют собой кислые ги-

чески.

потензивные полипептиды, содержащие

21-25

Предполагается существование более одно-

аминокислот, которые вызывают сокращение

го типа БК-рецепторов; некоторые авторы

или расслабление гладких мышц in vitro, a также

предполагают разделить их на подтипы В1 и

повышение сосудистой проницаемости. Они

В2. Выделение подтипа В1 основывается на

образуются из лейкотриенов клеточной кислой

данных о том, что дез-арг9-БК, неактивный во

протеиназой, которая почти определенно

многих тест-системах, значительно активнее

является лизосомным ферментом катепси-ном

БК в некоторых тканях (в аорте и мезентери-

D. Субстрат, лейкокиноген (молекулярная масса

альных сосудах кроликов). Более того, лей8, дез-

41 000), обнаруживается в асцитной жидкости и

арг9-БК обладает конкурентным антагонизмом

не определяется в нормальной плазме, где он

по отношению к БК и дез-арг9-БК в тех же

может образовываться при прогревании в

тканях, хотя в других тканях подобный

течение 30 мин при 57 °С. Предположение об

антагонизм не наблюдается. Одной из

участии лейкокинина было выдвинуто при ис-

особенностей реакций, опосредованных В1-ре-

следовании асцитной жидкости мышей-опухо-

цепторами, является то, что они не наблю-

леносителей, у которых введение пепстатина

даются сразу же после приготовления изоли-

(ингибитора катепсина D) подавляет увеличение

рованных препаратов in vitro, а усиливаются

асцита.

постепенно в течение нескольких часов в ре-

зультате процесса, определенно зависящего от

Заключение

синтеза белка [Bonthillier et al., 1987]. Посколь-

ку известно, что БК in vivo превращается

Вполне вероятно, что брадикинины участвуют в

в дез-арг9-БК, BI-рецепторы могут иметь не-

воспалительных реакциях, особенно в фор-

которое физиологическое значение. Предпола-

мировании отека и боли. Однако степень их

гается, что тканевая травма обусловливает по-

вклада еще предстоит определить.

степенное появление образующихся В1-рецеп-

торов, но имеющиеся сегодня доказательства

достаточно скудны и значимость данных ре-

цепторов остается предметом гипотез.

Постулировано, что В2-рецептор-это общее

понятие, используемое при описании лю-бой

реакции на БК, которая не вызывается дез-арг9-

БК или блокируется лей8,дез-арг9-БК. Эти

реакции входят в весьма широкий спектр

эффектов, вызывающих расширение или суже-

ние многих кровеносных сосудов, сокращение

гладких мышц внутренних органов, повышение

сосудистой проницаемости, увеличение се-

креции желудочно-кишечного и дыхательного

эпителия, стимуляцию ноцицептивных аффе-

рентных нейронов, митогенез и др. Как было

показано, эти реакции возникают в результате

II. Кининовые рецепторы

активации различных передающих систем в

разных тканях, поэтому нет оснований пред-

и сопряжение рецептор-эффектор

полагать, что во всех случаях участвует один и

X. П. РАНГ (Н.Р. RANG)

тот же тип БК-рецепторов. Действительно,

недавние исследования с использованием анта-

Имеются веские доказательства (основанные на

гонистов (см. ниже) подтвердили возможность

фармакологических исследованиях и опре-

существования нескольких разных подтипов

делении связывания) того, что брадикинин свя-

В2-рецепторов.

зывается со специфическими мембранными ре-

Показано, что у многих типов клеток бра-

цепторами и оказывает влияние на клеточном

дикинин активирует фосфолипазу С, что при-

уровне через одну или несколько биохимиче-

водит к образованию инозитолфосфатов и диа-

ских передающих систем, которые подобны или

цилглицерола из мембранных фосфолипидов.

даже идентичны системам, участвующим

Кинины

147

(Детальное описание механизма передачи при-

ничная модификация превращает БК в частич-

ведено в главах

3 и 4.) Эти вторичные

ный агонист, эффективность которого зависит

передатчики вызывают соответственно выде-

от используемой тест-системы. Последующие

ление кальция и активацию протеинкиназы С,

модификации, показанные в табл. 14, приводят к

а многие эффекты БК, например сокращение

образованию чистых антагонистов, наиболее

гладких мышц, вероятно, являются результа-

сильные из которых имеют рА2 порядка 6-7.

том данного процеса. Кроме того, БК во

Фармакологические исследования этих антаго-

многих тканях вызывает активацию фосфоли-

нистов показали, что они блокируют все эф-

пазы А2, что приводит к образованию арахи-

фекты БК без определенного уменьшения реак-

доновой кислоты и различных эйкозаноидов

ций на другие пептиды, например на ангио-

(см. главу 10). Многие эффекты БК ослабля-

тензин или вещество Р. Блокируются как В2-,

ются препаратами, подавляющими метабо-

так и В1-рецепторы. Исследования данных ан-

лизм арахидоновой кислоты (см. главы 24 и

тагонистов в кровеносных сосудах и препаратах

25), поэтому предполагается, что двойствен-

гладких мышц внутренних органов обнаружили

ность действия БК при активации этих двух

определенные качественные различия, что,

жпаз

(возможно, опосредуемой одним или

возможно, свидетельствует о некоторой

несколькими G-белками) необходима для мно-

гетерогенности БК-рецепторов, опосредующих

гих его эффектов. Дополнительным механиз-

разные реакции; однако для получения ясного

мом, весьма важным для расширения некото-

представления о них необходимы дальнейшие

рых (не всех!) сосудов, является выделение

исследования. Следует помнить о чувствитель-

РФЭ (см. главу 8). Являются ли рецепторы,

ности агонистов и антагонистов БК к инакти-

связанные с различными системами вторичных

вации тканевыми пептидазами, что может

мессенджеров, фармакологически различимы-

осложнить определение антагонизма обычными

ми, пока неясно.

фармакологическими методами. Предпола-

Интерес к БК-рецепторам в последнее вре-

гается, что антагонисты БК должны иметь

мя еще более возрос в связи с получением ряда

значительную клиническую ценность, посколь-

селективных конкурентных антагонистов, бло-

ку БК является медиатором ряда реакций при

кирующих многие эффекты, опосредованные

воспалении (особенно возникновения боли, по-

В2-рецепторами. Эти соединения были откры-

вышения сосудистой проницаемости и увели-

ты Stewart и соавт. при многостороннем иссле-

чения эпителиальной секреции), а также при

довании эффектов различных аминокислотных

карциноидном синдроме и демпинг-синдроме.

заместителей в отношении активности анало-

Соединения данного типа, представленные в

гов БК. Модификацией молекулы БК, необхо-

табл.

14, не имеют клинической значимости,

димой для получения антагонистов, является

поскольку их пептидная структура предполагает

замещение про7-ароматической D-аминоки-

быструю деградацию под действием пеп-тидаз

слотой, например D-фен (табл. 14). Эта еди-

плазменных и тканевых пептидаз и, сле-

Таблица 14. Пептидная структура ряда соединений

БК-брадикинин; тиэ-тиэнилаланин; гип-гидроксипролин.

148

Глава 13

довательно, кратковременность действия. Тем

не менее они служат ценным эксперименталь-

ным инструментом, который позволяет четко

определить роль (или ее отсутствие) БК при

различных патологических состояниях.

Лимфокины

Дж. Морлей, Дж. М. Хансон, В. М. Румьянек (J.

Morley, J. M. Hanson, V. М. Rumjanek)

Иммунная система регулируется сложной

филаксии, они предположили, что преформи-

сетью клеточных и гуморальных взаимодей-

рованный медиатор выделяется из лимфоцитов

ствий. Неантительные продукты лимфоцитов

при реакциях повышенной чувствительности

(лимфокины) и макрофагов (монокины) участ-

замедленного типа. Были предприняты попытки

вуют во всех фазах иммунного ответа. Лимфо-

охарактеризовать и последовательно очистить

кины и монокины являются белками или гли-

биологически

активный

материал

из

копротеинами, образуемыми лимфоцитами и

разрушенных лимфоцитов, причем особое вни-

макрофагами в культуре в ответ на антиген-

мание уделялось кожным реакциям, вызывае-

ную или митогенную стимуляцию. Они иден-

мым этим материалом, названным фактором

тифицируются по клеточному происхождению

проницаемости лимфатических узлов (ФПЛУ).

и эффектам, вызываемым в клетках-мишенях.

Препараты ФПЛУ были ограничены по спектру

Лимфокины и монокины сами не содержат

биологической активности, и изменения со-

антигенов или их фрагментов, что отличает их

судистой проницаемости, видимо, были связаны

от антител. Термины «лимфокины» и «моно-

с основными белками, присутствующими в этом

кины» не распространяются на низкомолеку-

материале.

лярные вещества, выделяемые лимфоцитами и

В то же время внимание ряда иммунологов

макрофагами при активации (например, про-

было направлено на проявления in vitro кле-

станоиды и нуклеотиды).

точного иммунитета. Хорошо установлено, что

селезеночные эксплантаты представляют in vitro

модель клеточного иммунитета, так как

Историческая справка

миграция клеток из селезеночного эксплантата

подавляется антигенами, вызывающими за-

Концепция гиперсенситивности замедленного

медленную гиперсенситивность у животных-

типа была неопределенной в течение длитель-

доноров. Ввиду трудоемкости и сложности этой

ного времени, до 1942 г., когда Landsteiner и

методики George и Vaughan предложили

Chase в классических экспериментах с кле-

капиллярный метод изучения in vitro миграции

точным переносом показали, что данный про-

популяций воспалительных клеток, полученных

цесс связан с лимфоцитами. Гистопатология

из перитонеальнои полости. Как и при

кожных реакций повышенной чувствительно-

использовании метода селезеночных эксплан-

сти замедленного типа характеризуется пери-

татов, миграция клеток селективно подавляется

васкулярным скоплением мононуклеарных

антигеном, когда донор клеток проявляет

клеток вокруг капилляров и небольших венул

замедленную гиперсенситивность к тому же

(особенно в поверхностной дерме), а также

антигену. Метод капиллярных трубочек позво-

нейтрофилов, эозинофилов и базофилов. Эти

ляет смешивать различные клеточные популя-

признаки отличают реакции повышенной чув-

ции, поэтому в 1964 г. David и соавт. смогли

ствительности замедленного типа от ответов

установить, что для получения реакции тре-

на неспецифические повреждения тканей. Ранее

буется лишь небольшой процент клеток от

предполагалось, что антиген цитотоксичен для

сенсибилизированного донора. Это наблюдение

сенсибилизированных мононуклеарных клеток

вместе с феноменом подавления антиге-

при замедленной гиперсенситивности

[Rich,

ниндуцированного торможения клеточной ми-

Lewis, 1932]. Первое предположение об участии

грации ингибиторами белкового синтеза по-

сенсибилизированных лимфоцитов в реакциях

служило отправной точкой для предположения

повышенной чувствительности замедленного

о существовании медиатора, обеспечивающего

типа было сделано Marks и James в 1953 г. По

усиление ответа на антиген. В 1966 г. David

аналогии с выделением гистамина из тучных

показал, что антигенная стимуляция вызывает

клеток после антигенной стимуляции при ана-

выделение в культуральную среду вещества,

II 1134

149

150

Глава 14

Рис. 64. Концепция лимфокинов:

лимфокины представляются такими же

иммунологически неспецифическими

медиаторами гиперсенситивности IV типа,

как и гистамин при гиперсенситивности I

типа.

тормозящего миграцию как сенсибилизиро-

Образование лимфокинов

ванных, так и несенсибилизированных клеточ-

ных популяций. Bloom и Bennet обнаружили,

Лимфокины образуются в процессе активации

что макрофаги, преобладающие среди мигри-

лимфоцитов. Активация лимфоцитов может

рующих клеток, вызывают торможение мигра-

быть достигнута специфическим антигеном

ции. Поскольку на сенсибилизированные лим-

или (гораздо чаще) неспецифическим (поликло-

фоциты, присутствующие вместе с антигеном,

нальным) стимулом, например митогеном

приходилась ничтожная часть

(<1%), было

конканавалином А. Возможно, что и другие

сделано предположение, что влияние антиген-

неспецифические стимулы активации лимфоци-

сенсибилизированных клеток на макрофаги

тов вызывают образование лимфокинов. Лим-

осуществляется через неспецифический фактор.

фоидные клетки получают из различных источ-

Таким образом, концепция лимфокинов разви-

ников, включая селезенку, лимфатические узлы

валась аналогично концепции дегрануляции

и воспалительные экссудаты, а также перифе-

тучных клеток, за исключением того, что ме-

рическую кровь или грудной проток. Кроме

диаторы клеточного иммунитета находятся не в

того, лимфокиноподобная активность может

преформированном виде, а образуются через

генерироваться спонтанно лимфоидными кле-

несколько часов и обладают более длительными

точными линиями в культуре. Такие лимфоид-

эффектами (рис. 64).

ные клетки, задержанные в G1-фазе клеточного

Лимфокины

151

цикла, продуцируют большее количество лим-

фокинов, чем клетки, приступившие к митозу.

Это совпадает с наблюдением более выражен-

ного синтеза специфического белка (меланин,

коллаген, миозин и др.) в неделящихся клетках

по сравнению с делящимися. Для получения

лимфокинов обычно культивируют примерно

1 млн клеток в 1 мл в течение ночи в присут-

ствии индуцирующего стимула. Выход биоло-

гически активного материала чаще всего очень

низок, так что в процессе работы приходится

заготавливать удачные партии материала для

серийных исследований.

Следует отметить, что тщательно контро-

лируемые условия культивирования не обяза-

тельно приводят к образованию сравнимых

препаратов лимфокинов. Таким образом, от-

носительная активность, а также соотношение

различных форм активности в удачных препа-

ратах могут варьироваться в широких пре-

делах.

Методы, используемые для отделения ин-

дуцирующего антигена от лимфокинов, зави-

сят от применяемого антигена. При использо-

вании бычьего у-глобулина в качестве антигена

добавление в супернатанты культур кристал-

лического сульфата аммония для получения

40% конечной концентрации приводит к от-

делению лимфокина от антигена с небольшой

потерей биологической активности. Напротив,

при колоночной хроматографии и подобных ей

методах потеря общей биологической активно-

сти бывает значительной. Препараты лимфо-

кинов, полученные посредством лиофилиза-

ции, относительно стабильны, однако полу-

Рис. 65. Кривая доза-эффект стимуляции синтеза ДНК

чаемые таким способом стандартные препара-

лимфоцитов in vitro стандартным препаратом лимфокина.

ты пока недоступны. Для получения белковых

Синтез ДНК определяется здесь по захвату 3Н-тимидина

компонентов ряда лимфокинов и монокинов

(распады в минуту, среднее значение и стандартное

используются скорее методы генной инжене-

отклонение) [Bray и соавт.- Clin. Exp. Immunol., 1976, 23,

333].

рии с клонированием кДНК и ее экспрессией в

бактериях. Такие белки обладают биологи-

ческой активностью, но отличаются от лимфо-

кинов, образуемых активированными клетка-

Лимфоциты

ми, отсутствием в них Сахаров, обычно до-

Первоначальное описание митогенного дей-

бавляемых при гликозилировании. Цитокины,

ствия лимфоцитов было дано Kasakura и Lo-

полученные таким методом, используются в

wenstein (1965), отметившими появление мито-

клинике.

генного материала в смешанной культуре лим-

фоцитов, a Dumonde и соавт. в 1968 г. впервые

Проявление биологической активности

назвали эту наблюдавшуюся активность «лим-

фокином». Данная стимулирующая активность

на разных клетках-мишенях

определялась путем подсчета митозов или по

включениям тимидина, меченного тритием, как

Обычно биологическая активность лимфоки-

индекс синтеза ДНК

(рис.

65). Активация

нов описывается (по возможности) в контексте

лимфоцитов может наблюдаться и без их кле-

с их клетками-мишенями.

точного деления. В этом случае увеличенный

152

Глава 14

синтез белка, который измеряется по включе-

ниям лейцина, меченного тритием, может слу-

жить индексом активации лимфоцитов, по-

скольку с его помощью можно определить

синтез лимфокинов, клеточную дифференциа-

цию и пролиферацию.

В течение какого-то времени общепринятым

было мнение о том, что митогенный компонент

препаратов

лимфокинов

является

поликлональным митогеном. Недавно было

показано, что лимфокины представляют собой

необходимый кофактор активации лимфоцитов

и что активный материал

(стимуляция

митогенной активности тимоцитов, костиму-

лирующая активность, хелперная активность

клеток-киллеров или вторичная активность,

индуцирующая цитотоксические Т-клетки)

принадлежит одному веществу-интерлейки-ну-

2. Интерлейкин-2 и монокин - интерлей-кин-1

(см. главу

15) являются хемотаксически-ми

факторами лимфоцитов. Напротив, супрес-

сорные Т-клетки выделяют ингибиторный

лимфокин, растворимый супрессор иммунного

ответа (РСИО), который угнетает синтез антител

и ДНК при стимуляции клеток Т- и В-ми-

тогенами, а также подавляет реакцию смешан-

ных лимфоцитов. Лимфокины принимают уча-

стие в регуляции антительного ответа на анти-

ген. Например, детально изучена регуляция

синтеза IgE В-лимфоцитами. Т-помощники

секретируют IgE-связывающий фактор (IgE-СФ)

и фактор, усиливающий гликозилирова-ние, а Т-

супрессоры секретируют фактор, подавляющий

гликозилирование. Контроль синтеза IgE

достигается относительным вкладом этих

факторов, так как IgE-СФ стимулирует синтез и

Рис. 66. Кривая доза-эффект подавления миграции

секрецию IgE В-лимфоцитами, а гли-

макрофагов in vitro стандартным препаратом лимфокина (с

козилированный IgE-СФ их подавляет.

учетом среднего значения и стандартного отклонения). (По

Вгау и др., 1976.)

Макрофаги

становления метода ингибирования миграции

Лимфокинами инициируется широкий спектр

макрофагов в качестве классического опреде-

функций макрофагов, включая подавление ми-

ления активности лимфокинов (рис. 66) выяс-

грации, нарушение электрофоретической по-

нялась способность лимфокинов к имитации

движности, повышение цитотоксичности, хе-

хорошо известных функций макрофагов, свя-

мотаксис и пролиферацию. Лимфокины были

занных с клеточным иммунитетом, а именно-с

впервые описаны при использовании метода

активацией макрофагов. Эта активность про-

подавления миграции макрофагов, а соответ-

является усилением движения, фагоцитоза и

ствующий биологически активный материал

прилипания к стеклу, а также увеличением

был назван фактором, ингибирующим мигра-

бактерицидных и тумороцидных эффектов. Все

цию (ФИМ). Этот метод интенсивно применя-

эти формы активности связаны с другим лим-

ется при исследовании лимфокинов в связи с

фокином-фактором активации макрофагов

параллельной чувствительностью к антигену in

(ФАМ). ФАМ представляет первую стадию

vitro и in vivo и широко принят как индикатор

двухэтапного процесса примирования макро-

клеточного иммунитета in vitro. По мере

фагов для их стимуляции вторым сигналом,

содержание .. 9 10 11 12 ..