содержание .. 2 3 4 5 ..

Руководство по иммунофармакологии - часть 4

Ней/профильные лейкоциты

В то же время глюкоза метаболизируется

Компоненты реакции стимулированных

через гексозомонофосфатный шунт; при этом

нейтрофилов

регенерируется НАДФН, который используется

О2-образующим ферментом и глутатион-

Адгезия, хемокинез и хемотаксис, фагоцитоз,

зависимой системой, обезвреживающей Н202. В

высвобождение содержимого гранул, дыхатель-

течение дыхательного взрыва клетка секре-

ный взрыв и метаболическая активность, со-

тирует протоны.

провождающая эти эффекты, могут быть выз-

Основным стимулом дыхательного взрыва

ваны одинаковыми стимулами в различных

обычно служит фагоцитоз, однако в условиях

условиях. Характеризуя реакции нейтрофилов,

эксперимента он не является обязательным

особенно на описанные стимулы, которые ана-

атрибутом. К эффекторным стимуляторам

логичны наблюдаемым in vivo, необходимо

дыхательного взрыва относятся форболмирис-

выяснить, каким образом запускаются эти

тилацетат, аналоги диацилглицерола

(напри-

реакции, участвуют ли в них стереоспецифи-

мер,

1-олеоил-2-ацетилглицерол), кальциевые

ческие рецепторы и какие события следуют за

ионофоры, растворимые хемотаксины и другие

взаимодействием лиганд- рецептор. Для ответа

мембранные лиганды. Для стимуляции необ-

на эти вопросы ниже приводятся результаты

ходимы высокие концентрации этих веществ, за

исследований реакций нейтрофилов на группу

исключением форболовых эфиров, а некоторые

синтетических пептидов и рассматриваются

стимуляторы

(например,

растворимые

механизмы передачи сигналов в клетке.

хемотаксины) требуют совместного их приме-

нения с цитохалазином В. Следует признать,

Взаимосвязь структура - активность

однако, что нефагоцитарные стимулы являются

синтетических ф. мет-пептидов,

артефактами in vitro и не дают точного

стимулирующих нейтрофилы.

представления о ситуации in vivo. Увеличение

Специфические рецепторы ф.мет-пептидов

потребления кислорода необходимо также при

процессах внеклеточной гибели.

В 1975 г. было установлено, что некоторые

Хемолюминесценция вследствие выхода

простые формилированные пептиды в очень

протонов, которая сопровождает дыхательный

низких концентрациях обладают свойствами

взрыв, может использоваться для регистрации

нейтрофильных хемотаксинов

(см. главу

18).

этого типа клеточной реакции.

Данное исследование основывалось на следу-

Образующиеся супероксиды и перекись во-

ющем предположении: поскольку бактериаль-

дорода, а затем

(что более важно) и гипо-

ные продукты являются хемотаксинами, то и

хлорид

(возникающий при катализируемом

пептиды, сходные с бактериальными, также

миелопероксидазой окислении Сl- перекисью

могут быть хемотаксинами. (Бактерии начинают

водорода), гидроксильные радикалы и синг-

синтез белка с формилметионина; у человека

летный кислород являются основными ве-

этого не наблюдается.) Впоследствии было

ществами, используемыми нейтрофилами для

обнаружено, что эти пептиды в определенных

уничтожения микроорганизмов. Важным мик-

условиях,

помимо хемотаксиса,

могут

робицидным механизмом предположительно

стимулировать другие реакции нейтрофилов.

является и ощелачивание фаголизосом.

Были исследованы различные ди-, три-и

Перечисленные метаболиты кислорода

тетрапептиды

(формилированные и нефор-

участвуют и в повреждении тканей при раз-

милированные), причем для каждой формы их

личных патологических состояниях, например

активности вычисляли ЕД501 Сравнительная

при нарушениях иммунных комплексов. Как

активность некоторых из этих пептидов как

было показано, повреждение молекул IgG су-

факторов хемотаксиса и экзоцитоза показана в

пероксидом, образованным активированными

табл.

3, где за единицу активности принята

нейтрофилами, приводит к агрегации IgG. Эти

активность формилметионинлейцина

(ф.мет-

агрегаты могут сами стимулировать дальней-

лей). Самым активным пептидом оказался

шее образование перекисей и в то же время

ф.мет-лей-фен (ФМЛФ), у которого ЕД50 при

способны действовать как аутоантигены. Та-

стимуляции экзоцитоза кроличьих нейтрофилов,

ким образом, неадекватная активация нейтро-

обработанных цитохалазином В, соста-

филов

(при дыхательном взрыве) послужит

основой для самоподдерживающегося повреж-

дения тканей, наблюдаемого при ревматоид-

1 ЕД50-концентрация препарата, которая необходима для

ном артрите (см. главу 31).

получения 50% максимального эффекта.

4-1134

Глава 3

Таблица 3. Относительная стимулирующая нейтрофильная

му для возникновения данной реакции необхо-

активность синтетических пептидов

димо связывание пептидов лишь с небольшой

Пептиды

Относительная активность

частью рецепторов-явление, часто наблюдаемое

при взаимодействии препарат

- рецептор на

хемотаксиче-

высвобождение

ское действие

содержимого азу-

других типах клеток. Оптимальное связывание

рофильных гранул

отмечается при рН

6,75. Относительная

активность пяти пептидов при конкурентном

Ф. мет

0,0003

0,0001 1

Ф. мет-лей

0,82 0,28

вытеснении меченого лиганда из мест связы-

Ф. мет-фен

1,3

4470

вания коррелирует с их относительной актив-

Ф. мет-мет

0,57

0,23 41,9

ностью как хемотаксинов. IC50 1 для ингиби-

Ф. мет-лей-фен

5050

1380 3,6

рования связывания составила 4,5*10-5 М, а для

Ф. мет-лей-глу

0,37

1,3 0,17

Ф. мет-мет-мет-мет

760

0,29

ингибирования хемотаксиса-приблизительно 10-

Ф. мет-мет-фен

1900

5 М.

Ф. лей-три-мет

В одном из исследований показано, что при

Мет-лей-фен

0,48

взаимодействии нейтрофилов с пептидами

Мет-мет-мет-мет

0,19

Мет-мет-фен

0,7

происходит расщепление пептидов на состав-

ляющие их аминокислоты. Ингибиторы про-

теаз или избыток субстрата тормозят этот

процесс, на основании чего можно предполагать

существование пептидазы, связанной с

вила 7*10-11 M. В других исследованиях по-

рецептором. Не исключено, однако, что боль-

казано, что ф.норлей-лей-фен обладает почти

шинство пептидных лигандов интернализиру-

такой же активностью, что и ф.мет-лей-фен. В

ется перед деградацией (см. ниже).

природе норлейцин не встречается, но по своей

Совершенно очевидно, что на поверхности

структуре он близок к метионину и может

нейтрофилов имеются рецепторы для неболь-

замещать его в белковом синтезе бактерий.

ших ф.мет-пептидов, а в недавних исследо-

Очень специфическая зависимость струк-

ваниях было показано, что данные пептиды

тура-активность для реакции на пептиды

являются природными хемотаксинами, проду-

предполагает их взаимодействие со специфи-

цируемыми бактериями. Проводимые в на-

ческими рецепторами на плазматической мем-

стоящее время исследования направлены на

бране нейтрофилов; в пользу этого свидетель-

выделение и структурное определение этих ре-

ствует способность биологически неактивных

цепторов.

пептидов конкурировать с активными пепти-

дами в ряде биологических систем. К таким

пептидам-антагонистам относятся карбобен-

Механизмы передачи сигнала

зокси-фен-мет (КБ-фен-мет) и 5-бутоксикарбо-

нил-фен-лей-фен-лей-фен

(БК-фен-лей-фен-лей-

Роль полифосфоинозитидов

фен). Хотя построение графика Шилда и вы-

В клетках многих типов частью процесса со-

числение значений рА2 не производились, было

пряжения

«сигнал-активация» является опи-

показано, что КБ-фен-мет, использованный в

санный Nishizuka (1984) и Berridge, Irvine (1984)

одной концентрации, вызывает параллельный

распад полифосфоинозитидов. После стиму-

сдвиг кривой доза-эффект для выделения ли-

ляции рецептора происходит гидролиз очень

зоцима и для хемотаксиса, причем без умень-

небольшого компонента клеточной мембраны-

шения максимального ответа.

фосфатидилинозитолдифосфата

(ФИФ2)-при

При определении связывания с нейтро-

участии кальцийнезависимой фосфолипа-зы С.

филами человека ф.норлей-лей-фен-норлей-

В результате гидролиза образуются два

[125I]тир-лиз, ЕД50 которых для хемотаксиса

внутриклеточных посредника: инозитолтри-

составляет 4 10 "М, было получено быстрое и

фосфат (ИФА мобилизующий внутриклеточный

обратимое насыщаемое связывание при 24°С с

кальции, и диацилглицерол

(ДАГ), ак-

константой равновесной диссоциации

1,3*10-9

тивирующий протеинкиназу С. Подобные про-

М, а количество мест связывания достигало

цессы протекают и в нейтрофилах, что было

120000. Сходные значения получены на

найтрофилах кролика при использовании

ф.норлей-лей-фен. Следует отметить, что ЕД50

для хемотаксиса составила 7*10-11 М, поэто-

1 1С50-концентрация ингибитора, которая необходима

для 50% уменьшения максимального ответа.

Нейтрофильные лейкоциты

Рис. 16. Влияние 10 7 М ф.мет-лей-фен на распад 4,5-

дифосфата фосфатидилинозитола.

Клетки предварительно метили 32Р. Результаты выражены

в процентах изменения меченого фосфолипида. Показаны

отсутствие (светлые кружки) и присутствие (темные

кружки) кальция во внешней среде [Dougherty и соавт.-

Biochem J., 1984, 222, 307].

1,5 г-

Рис. 17. Влияние Ю-7 М ф.мет-лей-фен на образование

инозитол-трифосфата в клетках, предварительно меченных

[3Н]-инозитолом. Результаты представлены в процентах

от радиоактивности, связанной с фосфатидилинозитолом,

которая составила примерно 70 000 cpm/мг белка. Кривая

с темными кружками-контрольные клетки; кривая со

светлыми кружками-клетки, стимулированные в нулевое

время ф.мет-лей-фен. По Dougherty и соавт., 1984.)

Время, с

■

показано достаточно четко. При стимуляции

Роль кальция

нейтрофилов ФМЛФ происходит распад

ФИФ2, даже в отсутствие внеклеточного каль-

Кальций-важная внутриклеточная передаточная

ция

(рис. 16), и образуются ИФ3 и ДАГ

молекула для таких реакций нейтрофилов, как

(рис. 17).

хемотаксис и дегрануляция. При движении

Глава 3

Рис. 18. Распределение кальция в покоящихся и активированных клетках.

Числа в полосе обозначают наномолярные концентрации [Ca2 + ]j. А-нестимулированная клетка. [Ca2 +

]j в теле клетки составляет 74 нм, в ламеллоподии- 69 нм (п = 17). Б-нейтрофил, мигрирующий к

опсонизированной частице зимозана (стрелка). [Са2 + ]( в теле клетки- 108 нм, в ламеллоподии- 146 нм

(п = 12). В-нейтрофил, фагоцитирующий опсонизированную частицу зимозана. [Ca2 + ]i в теле клетки-

106 нм, в псевдоподийной области- 161 нм (п = 31). Ламеллоподии определен как передняя треть

клетки, тело-как ее средняя треть, а область псевдоподия-как часть (клетки), окружающая

опсонизированную частицу. (Адаптированный рис. 1 из работы Slawier и соавт. Science, 1985, 230,

663, где измерение Са2+ определено по кальцийзависимой флюоресценции клеток, меченных Quin-2.)

Рис. 19. Влияние ИФ3 на выделение Са2+ проницаемыми

клетками [Prentki и соавт.,-J. Biol. Chem., 1984, 259, 1377].

ИФ3, мкМ

клетки к микроорганизму и при его после-

непосредственно перед началом процесса и

дующем фагоцитозе отмечается весьма четко

тесно коррелирует с клеточной реакцией (см.

локализованное повышение концентрации ци-

рис.

17). Однако в отсутствие внеклеточного

тозольного кальция в переднем конце клетки

кальция реакция не определяется, что свиде-

(рис. 18). Такое повышение происходит двумя

тельствует о необходимости повышения кле-

путями. Первоначальная фаза роста обеспе-

точной проницаемости для кальция при дегра-

чивается

мобилизацией внутриклеточного

нуляции. Увеличение кальциевой проницаемос-

кальция, выходящего из немитохондриального

ти происходит после образования ИФ3. Окон-

депо под действием ИФ3, образующегося из

чательная мобилизация внутреннего кальция

ФИФ2 (см. выше и рис. 19). ИФ3 синтезируется

также определяется ИФ3. Показано, что на-

Нейтрофильные лейкоциты

чальныи подъем цитозольного кальция опре-

in vivo, так как естественный активатор про-

деляется кальциевым каналом плазматической

теинкиназы С

(ДАГ) очень быстро метабо-

мембраны. В этом процессе принимают участие

лизируется в клетке и, следовательно, доступен

инозитолтетрафосфат (ИФ4), производное ИФ3.

лишь при низких концентрациях, локально и

Местное увеличение цитозольного кальция

только после стимуляции рецепторов. При

обычно необходимо для активации «двигателя».

хемотаксисе, вызванном растворимыми хемо-

Повышение концентрации кальция активирует

таксинами, ДАГ синтезируется при распаде

гельзолин- актинфрагментирующий белок,

ФИФ2 и может присутствовать в клетке лишь

вызывающий местные изменения соотношения

непродолжительное время. Для дыхательного

геля и золя. Необходимо также участие в этом

взрыва, стимулом для которого in vivo является

процессе кальмодулина, который активирует

фагоцитоз, необходимо более длительное

киназу

легкой

цепи

миозина,

присутствие ДАГ, поэтому в последующем

фосфорилирующую миозин. Миозин взаимо-

может иметь место гидролиз фосфатидилино-

действует с F-сетью актина, образуя главный

зитола с участием кальцийзависимой фосфо-

силовой элемент клетки (см. главу 18). К дру-

липазы С.

гим эффектам кальция в клетке относятся ак-

Nishizuka (1984) предположил, что синергизм

тивация фосфолипазы А2 (см. ниже) и, воз-

между кальцием и протеинкиназой С должен

можно, активация кальцийзависимой фосфо-

иметь большое значение для клеточных реакций.

липазы С, гидролизирующей фосфатидилино-

Такой синергизм показан у ней-трофилов при

зитол и монофосфат фосфатидилинозитола с

использовании синтетического диацилглицерола

образованием ДАГ (но не ИФ3).

(1-олеоил-2-ацетоглицерол,

ОАГ)

для

Увеличение концентрации кальция в цито-

стимуляции протеинкиназы С и нонофора

золе служит необходимым и достаточным

двухвалентных ионов А23187 с целью

стимулом для экзоцитоза и, возможно, для

повышения концентрации кальция в цитозоле.

хемотаксиса и фагоцитоза (хотя частицы, оп-

ОАГ быстро метаболизируется в клетке теми же

сонизированные С3bi, могут фагоцитироваться

ферментами, что и ДАГ, поэтому он считается

независимо от изменений [Са2+]), но не для

более

физиологичным

стимулятором.

дыхательного взрыва, для которого главным

Подпороговые концентрации ОАГ действуют

передаточным механизмом является активация

синергично с А23187, вызывая дозозависимый

протеинкиназы С.

сдвиг влево кривой «концентрация - эффект»

для А23187 в отношении образования OJ, а

Роль протеинкиназы С

также выраженное увеличение максимального

ответа (рис. 20, а). Аналогично этому, низкая

Протеинкиназа С- это фермент, активируемый

концентрация А23187 усиливает эффект ОАГ

кальцием. Он обычно присутствует в цитозоле,

(рис. 20, б).

но при активации клетки связывается с мем-

Протеинкиназа С оказывает комплексное

бранными фосфолипидами, например с фос-

влияние на передачу сигнала. Как и в других

фатидилсерином. ДАГ повышает аффинитет

клетках, этот фермент является разнонаправ-

протеинкиназы С к кальцию, поэтому он ста-

ленным регулятором некоторых процессов. Так,

новится активным уже при нормальной кон-

если активаторы протеинкиназы С си-нергичны

центрации кальция в клетке. Эксперименталь-

с рецепторными стимуляторами дыхательного

но показано, что даже при поразительно низ-

взрыва, то они же подавляют ре-цепторную

ких концентрациях внутриклеточного кальция

стимуляцию дегрануляции (рис. 21), вызванную

активация протеинкиназы С

(ПКС) служит

ф.мет-лей-фен и ЛТВ4, а также стимуляцию

мощным стимулом для дыхательного взрыва.

хемотаксиса под действием С5а. Подавление

ПКС фосфорилирует цитохром В-245 одиг из самых

сопровождается снижением содержания кальция

компонентов НАДФН-оксидазы. Следует, од-

в цитозоле (рис. 22) и, вероятно, происходит на

нако, отметить, что в большинстве экспери-

уровне рецептора или ассоциированного с ним

ментов, показавших влияние ПКС на дыха-

белка G, поскольку А23187 и подобные ему

тельный взрыв, применялись неприродные со-

агенты, вызывающие повышение

[Са2

]; в

единения, например ФМА. ФМА, относящийся

обход рецепторов, проявляют синергизм с ФМА

к соединениям с высокой жирорастворимостью,

в отношении экзоцитоза. Подавление, по-

очень медленно метаболизируется в клетке;

видимому, затрагивает лишь рецепторы к

результаты, полученные при использовании

растворимым хемо-таксинам, но не СЗЬ- и Fc-

ФМА, могут никак не соотноситься с данными

рецепторы, участ-

Глава 3

Рис. 20. Синергизм активации протеинкиназы С

(ОАГ) и увеличения [Ca2+]j (A23187) при

образовании перекиси водорода.

а-А23187 (квадраты ), А23187 с 1,1 х 10 -5 М ОАГ

(светлые кружки) и А23187 с 2,3 х Ю-5 М ОАГ

(темные кружки); точечная линия - результаты,

полученные при низкой концентрации ОАГ,

пунктирная линия-при высокой концентрации

ОАГ; б-ОАГ (ромбы) и ОАГ с 10"6 М А23187

(треугольники); пунктирная линия - результаты

действия с 1С"6 М А23187 [Penfield, Dale-

Biochem. Biophys. Res. Commun., 1984, 125, 332].

вующие в фагоцитозе и дыхательном

взрыве. ПКС также активирует кальциевый

А23187, М

насос, выкачивающий Са2

+ из клетки, что

способствует

уменьшению цитозольного

липокортином, поэтому фосфорилирование

кальция и может замедлить обмен ФИФ2.

Следующим эффектом ПКС является ак-

этого пептидного медиатора действия глюко-

кортикоидов может «выключать» липокортин и

тивация системы сопряженного обмена Na+/H + ,

т.е. выведения наружу протонов и введения

способствовать его активации при повышении

внутрь Na + , что приводит к ощелачиванию

уровня кальция в цитоплазме, которое

сопровождает активацию ПКС.

цитозоля (см. ниже). Точное значение активации

ПКС при стимуляции нейтрофилов до сих пор

Поскольку ПКС обладает как положитель-

ной передающей, так и негативной модули-

неизвестно, и, хотя показано фосфорилирование

ряда белков (31, ЗК, 40К, 50К, 55К, 64К, 70К и

рующей функциями, эффекты ингибиторов

ПКС трудно поддаются интерпретации. Не-

90К), их природа и функция еще не совсем

ясны. Возможно, что белок

31, ЗК является

которые из них, например Н7Н9 и Cl, более

активны в отношении цАМФ-зависимой ки-

цитохромом В-245 компонентом НАДФН-

оксидазы. Протеин 40К может быть

назы, которая сама по себе обладает отри-

цательным модулирующим действием на ней-

трофилы, и менее активны в отношении ПКС. В

качестве активатора ПКС обычно используется

ФМА; об отрицательных свойствах

Рис. 21. Ингибиторное действие

предварительной инкубации (3 мин)

нейтрофилов кролика с ФМА на

экзоцитоз, индуцированный 2 х Ю-9 М

ф.мет-лей-фен [Naccache и соавт.-J. Biol.

Chem., 1985, 260, 2125].

Форбол-12-миристил-13-ацетат, нг/мл

Нейтрофильные лейкоциты

Рис. 22. Влияние предварительной

инкубации (3 мин) при различных

концентрациях ФМА на индуцированную

ф.мет-лей-фен флюоресценцию кроличьих

нейтрофилов, нагруженных Quin-2.

Стрелкой показано добавление 2 х 10~9 М

ф.мет-лей-фен [Naccache и соавт.-J. Biol.

Chem, 1985, 260, 2125].

ФМА как биологического зонда уже упоми-

Транспорт натрия и изменения

налось выше. В качестве более специфичных

внутриклеточного рН

ингибиторов ПКС, по крайней мере при изуче-

Ф.мет-пептиды активируют амилоридчувстви-

нии дыхательного взрыва, предложены сфин-

гоидные основания.

тельную систему сопряженного транспорта

Na+/H + , которая обеспечивает вход Na и выход

Гуаниннуклеотид-регуляторный белок

Н +

что приводит к повышению внут-

В передаче сигнала в нейтрофилах, как пра-

риклеточного рН с 7,2 до

7,8. Этот эффект,

вило, участвует стимулирующий гуаниннук-

вероятно, связан с активацией ПКС (см. выше).

леотид-регуляторный белок (ГНРБ). Преинку-

Изменение рН модулирует образование О2

бация нейтрофилов с коклюшным токсином

(которое при подавлении ощелачивания

(который в других типах клеток дает АДФ-ри-

снижается на 55-75%) и, по имеющимся дан-

бозилирование таких белков, устраняя их ак-

ным, может регулировать активность нейтро-

тивность) приводит к ослаблению реакции

филов, например хемотаксис. Ф.мет-лей-фен не

нейтрофилов на ф.мет-лей-фен, но не влияет на

вызывает какого-либо определимого повышения

пострецепторные механизмы активации (ФМА

проводимости Na+.

для протеинкиназы С и А23187 для кальция). В

Фосфолипиды и метаболизм арахидоната

нейтрофилах ГНРБ (называемый Ср или Np)

активирует не аденилатциклазу, а фосфолипазу

Ряд данных свидетельствует об участии про-

С. Это было показано при использовании ана-

цесса метилирования фосфолипидов в стиму-

логов ГТФ, которые активируют нейтрофилы и

ляции передачи сигналов. Этот процесс заклю-

вызывают распад полифосфоинозитидов в

чается в ступенчатом присоединении метиль-

мембранах нейтрофилов. ГНРБ уменьшает за-

ных групп к фосфатидилэтаноламину на внут-

висимость от Са2 фосфолипазы С, которая

ренней стороне плазматической мембраны. В

необходима для гидролиза ФИФ2, так что

результате образуется фосфатидилхолин, ко-

фермент осуществляет свою функцию при

торый по механизму «качелей» появляется на

нормальной концентрации внутриклеточного

внешней стороне мембраны. Препараты, уг-

кальция. Дополнительный внутриклеточный

нетающие данный процесс, подавляют и хемо-

ГНРБ принимает участие в экзоцитозе азуро-

таксис, вызванный ф.мет-лей-фен.

фильных гранул.

Формилированные пептиды могут усиливать

Уже давно фториды известны как особенно

деградацию метилированных фосфолипидов,

сильные стимуляторы дыхательного взрыва.

что сопровождается накоплением лизо-

(Влияние фторидов на экзоцитоз трудно оп-

фосфатидилхолина и выделением арахидоно-

ределить, поскольку они могут использоваться

вой кислоты, в основном за счет активации

лишь при крайне низких концентрациях вне-

фосфолипазы А2. Степень активности различ-

клеточного Са2 + .) Предполагают, что фториды

ных пептидов одинакова по отношению к хе-

стимулируют ГНРБ, активирующий фос-

мотаксису и выделению арахидоната. Для

фолипазу С.

ф.мет-лей-фен ЕД50 (для последнего) состав-

Глава 3

ляет примерно 10"10 М, а кривая доза- эффект

нако точная роль циклических нуклеотидов в

смещается вправо при использовании специ-

нормальном функционировании нейтрофилов

фических пептидных антагонистов. Мепакрин,

пока не определена.

антагонист фосфолипазы А2, подавляет хемо-

таксис и выделение арахидоната, причем кри-

Влияние на плотность рецепторов

вые доза-эффект для обоих видов активности

практически идентичны. Следует, однако, от-

Инкубация нейтрофилов с ф.норлей-лей-фен

метить, что мепакрин обладает и другими

или ф.норлей-лей-фен-норлей-тир-лиз умень-

эффектами на клеточном уровне.

шает последующее связывание с теми же ме-

Какова же значимость подобных изменений

чеными пептидами. Это обусловлено не сни-

фосфолипидов плазматической мембраны?

жением аффинитета рецепторов, а уменьшением

Арахидоновая кислота служит субстратом для

их количества. Данное явление, называемое

синтеза лейкотриенов под действием липокси-

«обратной регуляцией», зависит от дозы (рис.

геназы, а лейкотриены оказывают глубокое

23) и наблюдается также у пептидных

влияние на нейтрофилы. Лейкотриен В4, в

рецепторов других типов клеток. У нейтро-

частности, является очень сильным хемотак-

филов потеря рецепторов происходит очень

сином и вызывает агрегацию нейтрофилов (см.

быстро и может достигнуть плато уже через 15

главу

10). По некоторым данным, продукты

мин. Ультраструктурные исследования других

липоксигенации арахидоновой кислоты могут

типов клеток показали, что обратная регуляция

быть внутриклеточными регуляторами нейт-

включает интернализацию комплекса ли-ганд-

рофилов: 11-ОЭТЭ и 5-ОЭТЭ присутствуют в

рецептор. Интернализация этого комплекса

мембранах клеток, и их концентрация уве-

была обнаружена и у нейтрофилов. Ис-

личивается при стимуляции формилирован-

следования с хемотаксическим пептидом, ме-

ными пептидами или другими хемотаксинами.

ченным флюоресцеином, показали, что при 4 °С

Арахидоновая кислота, как было показано,

рецепторы диффузно рассеяны по клеточной

стимулирует дыхательный взрыв и деграну-

мембране, а при 37 °С они образуют кластеры с

ляцию и сама может быть внутриклеточной

последующей интернализацией агрегатов в

передающей молекулой. Лизофосфатидил-

небольших везикулах, которые затем исчезают.

холин, обладающий сурфактантными способ-

Возможно, существуют механизмы рас-

ностями, может участвовать в локальном из-

щепления комплекса лиганд- рецептор с ре-

менении текучести мембран, что имеет место

циклингом рецепторов. Так, постоянное ко-

при трансметилировании. При активации фос-

личество рецепторов на мембранах устанав-

фолипазы А2 повышается уровень фактора,

ливается через 15 мин после начала инкубации

активирующего тромбоциты и являющегося

нейтрофилов с 10'7 М ф.норлей-лей-фен, а к 90-й

исключительно мощным хемотаксическим ве-

минуте количество интернализирован-ного

ществом и медиатором воспалительных реакций

пептида на 300% превышает число рецепторов,

(см. главу 16). Таким образом, стимулированные

первоначально определяемых на мембране. В

нейтрофилы

образуют

два

мощных

исследованиях с ф.нор-лей-лей-фен-норлей-тир-

хемогаксина-ФАТ и ЛТВ4, которые могут

лиз

получены

доказательства

активировать другие нейтрофилы и усиливать

протеолитического распада пептидов. При от-

реакцию.

мывании от пептидов клетка восстанавливает

первоначальную способность к связыванию, а

Роль циклических нуклеотидов

количество доступных рецепторов возвращается

к нормальному уровню через 20 мин. Очевидно,

Недавно было показано, что при экзоцитозе

белковый синтез не принимает участия ни в

происходит раннее, но кратковременное по-

обратной регуляции, ни в восстановлении,

вышение уровня циклического АМФ. Концен-

поскольку циклогексимид в концентрациях,

трация цАМФ достигает своего пика в самом

снижающих синтез белка на 92%, не влияет на

начале выброса содержимого гранул и воз-

эти процессы.

вращается к исходному уровню на фоне про-

Приведенные данные были получены на

должающейся дегрануляции. Предполагается,

статичных клетках, находящихся в среде с рав-

что увеличение цАМФ модулирует реакции

номерной концентрацией хемотаксина. Явление

нейтрофилов, в основном через протеинкиназу

обратной регуляции и рециклинга рецепторов

А. Вещества, повышающие уровень цАМФ,

может быть важным аспектом реакции

снижают реакции нейтрофилов (см. далее), од-

Нейтрофильные лейкоциты

Рис. 23. Кривая доза-эффект регуляции по принципу

обратной связи.

Процент потери насыщаемых рецепторов после 30-

минутной инкубации при 37°С с немеченым пептидом

отложен против концентрации немеченого пептида.

Потеря рецептора определена как процент насыщаемого

связывания 2 х 10 ~8 М ФНЛЛФ, меченного тритием, при

инкубации без добавления немеченого пептида [Sullivan

S.J., Zigmond S.H.-J. Cell. Biol., 1980, 85, 703].

ФМЛФ, М

нейтрофилов и в градиенте хемотаксина. Как

дана упрощенная схема взаимодействия пере-

отмечалось выше, на мембранах клеток после

дающих механизмов при хемотаксисе и фаго-

селективного экзоцитоза секреторных гранул

цитозе. Ключевым внутриклеточным посред-

возрастает количество рецепторов для ф.мет-

ником в этих процессах, вероятно, является

лей-фен. Вполне вероятно, что подобный про-

кальций, а активация протеинкиназы С мо-

цесс имеет место и при хемотаксисе. В этом

дулирует преимущественно отрицательные

случае на клетке, особенно на ее головном

эффекты. «Двигатель» имеет важное значение

конце, после активации экспрессируется боль-

как для хемотаксиса, так и для фагоцитоза (см.

ше рецепторов, чем в неактивном состоянии

главу

18). В дополнение к активации гель-

(см. рис.

14). Показано, что специфические

золина и киназы легкой цепи миозина, которые

гранулы служат хранилищем рецепторов для

регулируют полимеризацию и перекрестное

ф.мет-лей-фен

(и для других поверхностных

связывание актина, необходимо увеличение

лигандов, например для С3bi); количество со-

количества актина, связанного с клеточным

держащихся в них рецепторов в 30 раз пре-

скелетом. Как было показано, этот процесс

вышает число рецепторов на плазматических

протекает быстро при стимуляции нейтрофилов

мембранах. При движении клетки по градиенту

хемотаксином, таким как ф.мет-лей-фен.

хемотаксина

поверхностные

рецепторы,

Установлено, что индуцированный лигандом

взаимодействующие с хемотаксинами, интер-

обмен полифосфоинозитидов сам по себе слу-

нализируются, комплекс лиганд-рецептор

жит сигналом к началу полимеризации, а ФИФ2

распадается, а пептиды деградируют в азуро-

вызывает быструю и эффективную дис-

фильных гранулах. В то же время по мере

социацию профилактина (комплекс профилин-

слияния мембран специфических гранул с

актин-неполимеризованная форма актина) с

плазматической мембраной на головном конце

последующей полимеризацией. Однако взаи-

клетки появляются другие свободные рецеп-

модействие ФИФ2, кальция и гельзолина яв-

торы.

ляется достаточно сложным. Недавние иссле-

дования в лаборатории Stossel показали, что

Сопряжение сигнал-активация

способность гельзолина к фрагментированию

при различных реакциях нейтрофилов

нитей актина

(см. главу

18) выше при от-

сутствии кальция и что ФИФ2, связываясь с

Из вышеизложенного следует, что различные

гельзолином, может подавлять эту способность.

реакции нейтрофилов обеспечиваются разны-

С другой стороны, при микромолярной

ми передаточными механизмами. На рис. 24

концентрации кальция гельзолин связывает

Глава 3

мономеры актина и в этой форме стабилизирует

Фармакологическая регуляция

ядра, уже начавшие полимеризацию актина;

функций нейтрофилов

однако в тех же условиях гельзолин может

Препараты, повышающие уровень

блокировать обмен мономеров с быстрым

циклического аденозинмонофосфата (цАМФ)

ростом

«бородатых» концов нитей актина.

Удаление кальция и(или) присутствие ФИФ2

Дибутирил цАМФ, теофиллин и другие ве-

приводят к отделению актиновых мономеров от

щества, повышающие уровень цАМФ, угнетают

гельзолина, что блокирует последний эффект

различные функции нейтрофилов, включая

гельзолина

и,

следовательно,

ускоряет

хемотаксис,

антителозависимую

цитоток-

полимеризацию актина.

сичность и экзоцитоз, вызванный опсонизиро-

Протеинкиназа С, по-видимому, является

ванным зимозаном у нейтрофилов, обрабо-

главным активатором дыхательного взрыва. Об

танных цитохалазином В. Среди веществ, об-

этом свидетельствует угнетение дыхательного

ладающих этими свойствами, следует отметить

взрыва при использовании сфингоидных

гистамин, простагландины Е,, Е2 и 12, а также

оснований, селективных ингибиторов фермен-

агонисты адренорецепторов.

тов. Однако не исключено участие двух (или

Агонисты адренорецепторов, такие как

более) метаболических путей; по имеющимся

изопреналин, изменяют реакции нейтрофилов,

данным, арахидонат также может играть здесь

воздействуя на клетки через

0-рецеп-торы.

определенную роль.

Однако условия проведения фармакологических

На рис. 25 схематически представлены не-

исследований по идентификации рецепторов не

которые функциональные возможности нейт-

всегда

строго

соблюдались,

поэтому

рофилов при реакциях клетки in vivo.

полученные результаты трудновос-

Рнс. 24. Возможные взаимосвязи различных передаточных механизмов хемотаксиса.

ФХ - фосфатидилхолин; ФЭ- фосфатидилэтаноламин; МФЭ- монометилфосфатидилэтаноламин;

ФЛ - фосфолипид; ГНРБ - гуаниннуклеотид-регуляторный белок; ФИ - фосфатидилинозитол;

ФИФ- фосфатидилинозитол-фосфат; ФИФ2 - фосфатидилинозитол-дифосфат; ИФ3 -

инозитолтрифосфат; ДАГ- диацилглицерол; ИФ4 - инозитолтетрафосфат; ФК-фосфатидиловая

кислота; ФАТ-фактор активации тромбоцитов; ЛТВ4 - лейкотриен В4.

Нейтрофильные лейкоциты

производимы. Однако исследования связывания

на трансформацию лимфоцитов, которое на-

с радиоактивным антагонистом, которые

блюдается при концентрации в 10 000 раз более

проводились после предварительной обработки

низкой.)

нейтрофилов лизосомотропными препаратами

для предупреждения распада аминов в

Вещества, повышающие уровень циклического

лизосомах, указывают на возможное сущест-

гуанозин-3,5-монофосфата (цГМФ)

вование р-адренорецепторов.

Гистамин уменьшает экзоцитоз, вызванный

Агонисты холинергических рецепторов повы-

зимозаном у нейтрофилов, стимулированных

шают уровень цГМФ в нейтрофилах и умень-

цитохалазином В; однако данные, полученные

шают внеклеточную гибель клеток-мишеней,

при воспроизведении в разных лабораториях,

покрытых антителами. Результаты исследова-

весьма вариабельны.

ний связывания хиналдинилбензилата указы-

Простагландин Е2 вызывает дозозави-симое

вают на возможность существования мест свя-

подавление

экзоцитоза;

при

высокой

зывания ацетилхолина на нейтрофилах; однако

концентрации 2,8- Ю-4 М отмечается 37% по-

доказательства наличия холинергических ре-

давление. (Это контрастирует с его дйствием

цепторов на нейтрофилах в целом неубедительны.

Хемотаксис

Фагоцитоз и гибель микроорганизмов

Взаимодействие хемотаксин

- рецептор:

Высокие концентрации хемотаксина замедляют

локализованный гидролиз ФИФ, вызывает

движение. Повторные взаимодействия рецепторов

образование ИФ ,+ДАГ на головном конце клетки.

к СЗЬ и Fc с опсонинами и микроорганизмами

ИФ мобилизует Са2*, обусловливая вход Са2*.

приводят к трехмерному эффекту «молнии»,

[Са

[активирует киназу легкой цепи миозина,

причем каждое взаимодействие вызывает

которая стимулирует «двигатель», в результате

местный обмен ИФ2 с образованием ИФ3и ДАТ.

чего происходит движение клетки вперед. ДАТ

ИФ3 мобилизует Са2*, который контролирует

быстро удаляется ДАГ-киназой, поэтому

"двигатель- поглощающих псевдоподий, а также

активация ПКС минимальна. Фосфорилирование

активирует ФЛА2 генерирующую АК и

липокортина ПКС или другой киназой: активация

лизофосфатидилхолин. Азурофильные гранулы

Ф/^ при повышении Са2*, вследствие чего

сливаются с фагосомами, образуя фаголизосомы.

происходит образование ФАТ и ЛТВ4 в переднем

Высокий уровень [ДАТ] поддерживается

конце клетки, что повышает градиент (для этого

распадом ФИ при участии ФЛС. ДАТ активирует

необходимо примирование другими цитокинами).

ПКС, которая в синергизме с Са2* (и, возможно, с

ПКС и Са2* обладают синергизмом при индукции

АК) стимулирует NADPH-оксидазу. Повышенная

повторных слияний специфических гранул с

активность ПКС уменьшает обмен ФИФ2 и

мембраной, что приводит к экспрессии скрытых

снижает [Са2*]за счет активации выхода Са2*.

хемотаксических рецепторов на переднем конце

ПКС активирует NaVH'-противоток и

клеток. Комплексы лиганд -рецептор

ощелачивает фаголизосомы. Микроорганизмы

интернализуются и расщепляются, а рецепторы

убиваются токсическими продуктами Ог и др., а

рециклируют. При слиянии специфических

впоследствии перевариваются лизосомными

гранул с плазматической мембраной

ферментами.

увеличивается также экспрессия рецепторов к

СЗЬ и, возможно, к Fc.

Рис. 25. Схема некоторых функций нейтрофилов, участвующих в первой линии защиты от

микроорганизмов in vivo.

ПКВ-посткапиллярные венулы; ФИФ2-фосфатидилинозитол-дифосфат; ДАГ-диацилглицерол; ПКС-

протеинкиназа С. Остальные сокращения см. на рис. 24.

Глава 3

Препараты, влияющие на микротрубочки

рофилы снабжены множеством различных ре-

цепторов, которые позволяют им реагировать на

Колхицин и винбластин вызывают растворение

градиент хемотаксина, распознавать бактерии и

микротрубочек, связываясь с тубулином и

многие чужеродные вещества, взаимо-

препятствуя его полимеризации; однако

действовать с ними. На примере взаимодействия

окончательная интерпретация эффектов этих

нейтрофилов с синтетическим пептидом ф.мет-

препаратов осложняется тем, что под их дей-

лей-фен показано, что для реакции клетки

ствием может нарушаться процесс мембранного

необходимо участие стереоспецифических

транспорта. Какое же влияние на функции

рецепторов, активация которых вызывает обмен

нейтрофилов оказывают препараты данной

полифосфоинозитидов,

увеличение

внут-

группы? Колхицин и винбластин уменьшают

риклеточного пула обмениваемого кальция и

экзоцитоз, но при концентрациях, практически

активацию протеинкиназы С. Передаточный

элиминирующих микротрубочки, дегрануля-ция

механизм может включать активацию фосфо-

снижается только на 40%. Микротрубочки, по-

липазы А2 с последующим образованием фак-

видимому, более специфически вовлекаются в

тора, активирующего тромбоциты, арахидо-нат

пространственные

взаимоотношения

и лейкотриен В4; возможно также участие

внутриклеточных органелл и плазматической

локального увеличения текучести мембраны.

мембраны. Препараты, вызывающие сборку или

После образования комплекса лиганд-ре-

дезагрегацию микротрубочек, могут влиять на

цептор последний интернализируется, рецеп-

вероятность контакта между гранулой и

торы подвергаются рециклингу и вновь по-

плазматической мембраной, однако ясно, что в

являются на мембране. Одним из эффектов

экзоцитозе принимают участие и другие

повышения концентрации кальция является

факторы. Микротрубочки, по общему мнению,

активация «мотора» - микрофиламентной сети

участвуют в ориентации и стабилизации клеток

актин- АСБ с миозином, которая включает

во время движения. При электронной

активность гельзолина и стимуляцию киназы

микроскопии

клетки,

обработанной

легкой цепи миозина. Клеточная подвижность,

хемотаксинами, выявляется увеличение поли-

фагоцитоз и экзоцитоз зависят также от эле-

меризации. Участие микротрубочек в этом

ментов, генерирующих силовое напряжение.

процессе до конца не ясно. Хотя в некоторых

Микротрубочки участвуют в стабилизации

исследованиях отмечается снижение хемотак-

клеток во время их реакции, а циклические

сиса под действием винбластина и колхицина, в

нуклеотиды модулируют активность нейтро-

ряде других работ обнаруживается лишь слабый

филов. Однако доказательства существования

эффект этих препаратов. Прямое наблюдение

специфических рецепторов для фармпрепаратов,

показало, что после обработки указанными

обычно вызывающих изменения уровня

препаратами движение нейтрофилов по

циклических нуклеотидов, весьма неоднознач-

градиенту хемотаксина напоминает прогулку

ны. Нейтрофилы обладают запасом гликогена и

пьяного.

получают энергию главным образом при

Не менее противоречивые данные получены

метаболизме углеводов. Фагоцитоз и индукция

при изучении влияния колхицина на индукцию

внеклеточной гибели сопровождаются увели-

внеклеточной гибели: отсутствие эффекта в

чением потребления кислорода с образованием

одном исследовании и

50% подавление-в

перекисей и других токсических продуктов

другом.

кислорода; те же эффекты наблюдаются при

других видах активации нейтрофилов.

Заключение

Список литературы

Нейтрофил-конечная клетка, неспособная к

Berridge M.J. & Irvine R.F. (1984) Inositol trisphosphate,

делению, с ограниченными возможностями

a novel second messenger in cellular signal transduction.

Nature 312, 315. K/ebanoffM.J. & Clark R.A. (1978) The

синтеза белка; тем не менее диапазон ее реакций

Neutrophil: Function

весьма широк и включает хемотаксис,

and Clincia/ Disorders. North Holland, Amsterdam.

фагоцитоз, экзоцитоз, индукцию как внутри-

Nishizuka Y. (1984) The role of protein kinase С in cell

клеточной, так и внеклеточной гибели. В

surface signal transduction and human promotion. Nature

308, 693. Snyderman R.

(1984) Contemporary Topics in

нейтрофилах имеется по крайней мере два типа

Immunology,

гранул, содержимое которых обладает микро-

vol. 14. Academic Press, London. Wilkinson P. С (1982)

бицидной активностью и оказывает действие на

Chemotaxis and Inflammation, 2nd ed.

другие клетки и компоненты тканей. Нейт-

Churchill-Livingstone, Edinburgh.

Тромбоциты

Дж. К. Формен (J. С. Foreman)

Целью данной главы является краткая харак-

крови содержится 105 - 5*106 тромбоцитов. Из

теристика структуры, стимулов, биохимии и

одного мегакариоцита образуется

3000-4000

фармакологии тромбоцитов с учетом их воз-

тромбоцитов; их продукция, по-видимому,

можной роли в воспалительной реакции. От-

контролируется тромбопоэтином, гуморальным

дельная глава (см. главу 16) будет посвящена

фактором печени или почек.

медиатору, известному как фактор активации

Интактный тромбоцит имеет вид диска

тромбоцитов.

диаметром 0,75-2,25 мкм. Несмотря на отсут-

Представления о роли тромбоцитов в вос-

ствие ядра цитоплазма содержит некоторое

палении или других иммунных реакциях весьма

количество РНК, поэтому тромбоциты спо-

противоречивы. Участие тромбоцитов в

собны к ограниченному белковому синтезу.

подобных реакциях не вызывает особых со-

Мембрана, окружающая цитоплазму, состоит из

мнений; вопрос заключается в определении их

двух слоев фосфолипидов, между которыми

значимости и пользы либо в констатации от-

располагаются белки

(трехслойная структура,

сутствия какого-либо их вклада в эти процессы.

типичная для клеток-эукариотов). Внешняя по-

Утверждается, что устранение тромбоцитов не

верхность мембраны покрыта аморфным слоем

изменяет воспалительных реакций, однако это

толщиной 20 нм, который состоит из белков и

не означает обязательного отсутствия активной

сульфатированных протеогликанов. Функ-

и функциональной роли тромбоцитов в таких

циональное значение аморфного слоя опреде-

процессах. Из последующих глав станет

ляется тем, что среди всех прочих веществ в нем

очевидным,

что

воспаление-это

содержатся факторы свертывания.

многокомпонентный процесс с множеством

В результате инвагинации поверхностной

альтернативных и перекрещивающихся связей.

мембраны в цитоплазме образуется сложная

Следовательно, выпадение какого-то одного

система канальцев, которые сообщаются с по-

компонента может не повлиять на исход про-

верхностью тромбоцита. Возможно, что ве-

цесса, поскольку выпавший компонент нередко

щества, выделяемые гранулами тромбоцитов,

замещается. В дополнение к этому следует

сначала попадают в эту систему канальцев и

сказать, что тромбоциты активируются мно-

лишь затем окончательно высвобождаются во

жеством различных стимулов, что объединяет

внешнюю среду. С системой канальцев,

их с тучными клетками и нейтрофилами; более

сообщающихся с поверхностью, тесно связана

того, они выделяют значительное количество

плотная тубулярная система. Подобно сарко-

медиаторов воспаления с широким спектром

плазматическому ретикулуму мышц, плотная

действия. Все это чрезвычайно усложняет за-

тубулярная система может участвовать в сек-

дачу определения истинного участия тромбо-

вестрации и хранении кальция в тромбоцитах.

цитов в иммунных и воспалительных реакциях.

Значительная часть цитоплазмы тромбоцита

заполнена гранулами, которые разделяют на три

основных типа:

1) плотные гранулы;

2) а-

Структура тромбоцитов

гранулы;

3) гранулы, содержащие кислые

гидролазы.

Тромбоциты ввиду отсутствия в них ядра не

Кроме того, цитоплазма содержит некоторое

могут быть определенно отнесены к клеткам.

количество гранул гликогена и немного

Они являются фрагментами больших мегака-

митохондрий.

риоцитов костного мозга и обнаруживаются в

циркулирующей крови, а не в тканях

(за

Плотные гранулы

исключением патологических состояний).

Продолжительность жизни тромбоцитов в

Эти гранулы содержат АТФ, АДФ, пирофос-

циркуляции составляет

8-14 дней; в

1 мкл

фат, бивалентный катион (кальций либо маг-

содержание .. 2 3 4 5 ..