Биологическая химия - часть 38

ций кофакторов и явление  к о м п а р т м е н т а л и з а ц и и . Механизм компарт-

ментализации метаболических процессов играет, по-видимому, важную

биологическую роль, пространственно разъединяя с помощью биомембран

ферменты со своими субстратами (например, лизосомальные ферменты:

протеиназы, фосфатазы, рибонуклеазы и другие гидролитические фермен-

ты – с цитоплазматическими веществами, на которые они действуют). Кро-

ме того, облегчая независимую регуляцию, этот механизм позволяет

разделить несовместимые в одном и том же месте (и, возможно, в одно и то

же время) метаболические процессы. Примером последних могут быть пути

синтеза высших жирных кислот, протекающие в основном в растворимой

фракции цитоплазмы, и пути распада (окисления) жирных кислот, сосре-

доточенные в митохондриях. Необходимо указать, однако, что при ком-

партментализации возникает проблема транспорта как метаболитов, так

и восстановительных эквивалентов через биомембраны субклеточных ор-

ганелл. Эту задачу решает так называемый челночный механизм, позво-

ляющий перевод метаболитов в формы, способные переходить через

мембраны, и обеспечивающий внутриклеточный гомеостаз (см. главу 13).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Определение количественного содержания ферментов в биологических

объектах представляет известные трудности, поскольку, за редким ис-

ключением, ферменты в тканях присутствуют в ничтожно малых концент-

рациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализи-

руемой реакции в определенных, согласованных условиях измерения. При

оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении

фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна

концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по

скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции.

Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его

активности в условных единицах Комиссией по ферментам Междуна-

родного биохимического союза была рекомендована стандартная между-

народная единица (Е или U): за единицу  а к т и в н о с т и любого фер-

мента принимается то количество его, которое в оптимальных условиях

катализирует превращение 1 микромоля субстрата или образование 1 мик-

ромоля продукта в минуту (мкмоль/мин) *.

В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено

новое выражение активности фермента в  к а т а л а х (кат, kat): 1 кат

есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со ско-

ростью, равной 1 молю в 1 с (1 моль/с). Отношение международной

единицы (U) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат =

1 моль•с

–1

 = 60 моль•мин

–1

 = 60•10

6

 мкмоль•мин

–1

 = 6•10

7

 U, или:

1 U = 1 мкмоль•мин

–1

 = (1/60) мкмоль•с

–1

 = (1/60) мккат = 16,67 нкат.

Таким образом, 1 U фермента соответствует 16,67 нкат.

Рекомендовано, кроме того, измерять активность фермента при темпе-

ратуре 25°С, оптимуме рН и концентрации субстрата, превышающей

концентрацию насыщения. В этих случаях скорость соответствует нулевому

порядку реакции в отношении субстрата и будет зависеть только от

концентрации фермента.

* Мкмоль, 10

–6

 моль; единицы активности фермента выражают также в наномолях (10

–9

моль) и пикомолях (10

–12

 моль).

157

Для выражения активности в практической работе с ферментами часто

пользуются произвольными понятиями удельной и молярной активности.

У д е л ь н у ю  а к т и в н о с т ь фермента принято выражать числом единиц

ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг

активного белка). Количество молекул субстрата, подвергающихся пре-

вращению одной молекулой фермента в продукт в процессе реакции

в единицу времени при полном насыщении фермента субстратом, принято

называть числом оборотов фермента, или  м о л я р н о й  а к т и в н о с т ь ю

(молярная каталитическая активность выражается в каталах на 1 г-моль

фермента). Одна молекула каталазы эритроцитов способна, например,

расщепить в 1 с 44000 молекул перекиси водорода *.

ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Вопрос о локализации ферментов в структурных образованиях клетки

(ядро, митохондрии, лизосомы и др.) является чрезвычайно важным,

особенно в препаративной энзимологии, когда перед исследователем

поставлена задача изолировать и выделить фермент в чистом виде.

Сравнительно легко обнаружить локализацию фермента методами цито-

и гистохимии. Для этого тонкие срезы органа инкубируют с соответст-

вующими субстратами и после инкубации локализацию продукта реакции

устанавливают добавлением подходящих реактивов до появления специ-

фической окраски.

В препаративной энзимологии чаще пользуются методом дифферен-

циального центрифугирования гомогенатов тканей (рис. 4.26). Для этого

сначала разрушают клеточную структуру с помощью подходящего де-

зинтегратора и полученную квазиоднородную (гомогенизированную) массу

подвергают дифференциальному центрифугированию при температуре

0–4°С. Обычно распределение ферментов изучают в последовательных

индивидуальных фракциях, изолированных при дробном центрифугирова-

нии гомогенатов, в частности во фракции ядер, которую получают при

низкой скорости центрифугирования, во фракции митохондрий, которая

осаждается при средней скорости центрифугирования, во фракции микро-

сом (или рибосом), для изолирования которой требуется высокая скорость

центрифугирования, и, наконец, в оставшейся прозрачной надосадочной

жидкости (супернатант), представляющей собой растворимую фракцию

цитоплазмы. Следует отметить, что фракция митохондрий не является

гомогенной, поскольку из нее удается изолировать частицы, известные как

лизосомы, размер которых занимает промежуточное место между разме-

рами митохондрий и микросом. В свою очередь микросомальная фракция

также является гетерогенной, поскольку состоит в основном из элементов

эндоплазматической сети неоднородного строения.

При помощи метода фракционирования гомогенатов органов и тканей

в центрифугах было показано, что ядерная фракция печени и почек

содержит незначительное число ферментов, хотя известно, что в ядрах

осуществляется синтез некоторых белков. Основное место синтеза белка,

как теперь установлено,– фракция рибосом цитоплазмы. Показано, кроме

* Чтобы 1 атом неорганического железа, также катализирующий распад Н

2

О

2

, расщепил

такое число молекул Н

2

О

2

, которое расщепляет каталаза в 1 с, потребовалось бы несколько

лет. Этот пример является наглядным доказательством одного из главных свойств фермен-

тов – их высокой каталитической активности.

158

Рис. 4.26. Дифференциаль-

ное центрифугирование го-
могенатов ткани печени

(схема),
g - ускорение силы тяжести.

того, что ферменты гликолиза сосредоточены преимущественно в раство-

римой фракции цитоплазмы, в то время как цитохромоксидаза и ферменты

цикла Кребса локализованы во фракции митохондрий. С митохондриями

связаны также ферменты, катализирующие окислительное фосфорилиро-

вание и распад жирных кислот. Ферменты, катализирующие биосинтез

жирных кислот, наоборот, содержатся в растворимой фракции цитоплазмы.

Для изолирования и выделения ферментов из биологических объектов

в чистом (гомогенном) состоянии используют весь арсенал методов выде-

ления белков в индивидуальном виде (см. главу 1).

КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ

Современные классификация и номенклатура ферментов были разработаны

Комиссией по ферментам Международного биохимического союза и ут-

верждены на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г.

в Москве *.

* В работе Комиссии принимали участие крупнейшие энзимологи мира, от нашей

страны – акад. А.Е. Браунштейн.

159

Гомогенизация

в 0,25 М

растворе

сахарозы

Измельчение

Ткань

Гомогенат

600

 g

10

 мин

Ядра;

неразрушенные

клетки

Супернатант

10000

 g

20

 мин

Митохондрии

Супернатант

105000 g

60

 мин

Микросомы

Растворимая

фракция

белков

Необходимость систематики номенклатуры диктовалась прежде всего

стремительным ростом числа вновь открываемых ферментов, которым

разные исследователи присваивали названия по своему усмотрению. Более

того, одному и тому же ферменту часто давали два или несколько названий,

что вносило путаницу в номенклатуру. Некоторые названия ферментов

вообще не отражали тип катализируемой реакции, а при наименовании

фермента исходили из названия субстрата, на который действует фермент,

с добавлением окончания -аза: в частности, амилазы (ферменты, гидро-

лизирующие углеводы), липазы (действующие на липиды), протеиназы

(гидролизирующие белки) и т.д.

До 1961 г. не было и единой классификации ферментов. Трудности

заключались в том, что разные исследователи за основу классификации

ферментов брали различные принципы. Комиссией были рассмотрены

3 принципа, которые могли служить основой для классификации ферментов

и их обозначения. Первый принцип – химическая природа фермента, т.е.

принадлежность к флавопротеинам, пиридоксальфосфатпротеинам, гемо-

протеинам, металлопротеинам и т. д. Однако этот принцип не мог служить

общей основой для классификации, так как только для небольшого числа

ферментов известны простетические группы, доступные идентификации

и прямому определению. Второй принцип – химическая природа субстрата,

на который действует фермент. По этому принципу трудно классифи-

цировать фермент, так как в качестве субстрата могут служить разнообраз-

ные соединения внутри определенного класса веществ (белки, углеводы,

липиды, нуклеиновые кислоты) и бесчисленное множество промежуточных

продуктов обмена. В основу принятой классификации положен третий

принцип – тип  к а т а л и з и р у е м о й реакции, который является специфич-

ным для действия любого фермента. Этот принцип логично использовать

в качестве основы для классификации и номенклатуры ферментов.

Таким образом, тип катализируемой химической реакции в сочетании

с названием субстрата (субстратов) служит основой для систематического

наименования ферментов. Согласно Международной классификации, фер-

менты делят на шесть главных классов, в каждом из которых несколько

подклассов: 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы; 4) лиазы;

5) изомеразы; 6) лигазы (синтетазы) (табл. 4.5).

Оксидоредуктазы. К классу оксидоредуктаз относят ферменты, ката-

лизирующие с участием двух субстратов окислительно-восстановительные

реакции, лежащие в основе биологического окисления. Систематические

названия их составляют по форме «донор: акцептор оксидоредуктаза».

Например, лактат: НАД

+

 оксидоредуктаза для лактатдегидрогеназы

(ЛДГ).

Различают следующие основные оксидоредуктазы: аэробные дегидро-

геназы или оксидазы, катализирующие перенос протонов (электронов)

непосредственно на кислород; анаэробные дегидрогеназы, ускоряющие

перенос протонов (электронов) на промежуточный субстрат, но не на

кислород; цитохромы, катализирующие перенос только электронов. К это-

му классу относят также гемсодержащие ферменты каталазу и пероксидазу,

катализирующие реакции с участием перекиси водорода.

Трансферазы. К классу трансфераз относят ферменты, катализирующие

реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов

и радикалов. Наименование их составляется по форме «донор: транспор-

тируемая группа – трансфераза».

Различают трансферазы, катализирующие перенос одноуглеродных ос-

татков, ацильных, гликозильных, альдегидных или кетонных, нуклеотидных

160