ГЛАВА 3

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА АКУШЕРСКИХ И ПЕРИНАТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ

 

 

В диагностике акушерских инфекций важное место занимает лабораторное обнаружение возбудителя.

Диагностика инфекционного процесса может проводиться как на основе выделения чистой культуры или прямого обнаружения антигена в пробе, так и на основе обнаружения специфических антител. Выбор метода зависит от того, насколько легко можно обнаружить предполагаемый микроорганизм. В частности, при бактериальных инфекциях новорожденного, вызываемых стрепто­кокками В или Neisseria gonorrhoeae, в качестве материала для исследования отдается предпочтение гемокультуре или спинно­мозговой жидкости младенца одновременно с мазком выделений гениталий у матери. Для обнаружения других микроорганизмов типа Toxoplasma gondii и Treponema pallidum основным методом исследования является обнаружение антител.

Методы выявления возбудителя

Метод культивирования

Традиционно «золотым стандартом» в выявлении возбудителя считается культуральный метод диагностики. Заключается он в за-

 

---------------------------------------                 --------------------------------------------

ражении культуры клеток L-929, Mc Coy или эпителиальных кле­ток оболочек желточных мешков 6-8-дневных куриных эмбрионов и выделении возбудителя с использованием моноклональных анти­тел. Преимуществом метода является высокая специфичность и чувствительность. Метод не дает ложноположительных результа­тов. К недостаткам относят его трудоемкость и дороговизну, что ограничивает его применение в повседневной практике. Как пра­вило, этот метод используется в научных целях.

Цитологический метод

Основан на микроскопическом исследовании мазка после окра­ски красителями. Чувствительность данного метода составляет 10-40%.

Это наиболее доступный и технически простой метод. Но его ди­агностическая ценность снижается из-за субъективной оценки ре­зультата.

Посев на специфическую среду

С целью выявления возбудителей можно использовать различ­ные посевы на специальные среды. Таким способом выделяют бактерии, грибы, микоплазму, уреаплазму. Метод позволяет опре­делить концентрацию микроорганизма в полученной среде, что во многих случаях является очень важным. Диагностически значи­мое количество микроорганизмов, выявляемых этой методикой, соответствует 10⁴ КОЕ /мл и более.

Молекулярно-биологические методы

Не так давно были разработаны молекулярно-биологические методы, основанные на анализе нуклеотидной последовательнос­ти, которые способны повысить титры чувствительности до 1:10 микроорганизмов. К ним относятся: метод ДНК-зондов, лигазная цепная реакция, полимеразная цепная реакция.

Метод ДНК-зондов. Метод точечной гибридизации нуклеино­вых кислот на твердой фазе с использованием ДНК-зонда, мечен­ного биотином. Тесты, основанные на этой методике, имеют множество преимуществ с точки зрения транспортировки, обработ­ки и скорости исследования. Чувствительность метода — 78-90%, специфичность — 98%. Материалом для исследования является любая биологическая среда организма.

 

______________________         -        ------------------------------------------

Лигазная цепная реакция. Основана на зависимой от мишени амплификации с использованием термостабильной ДНК-лигазы.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР была открыта в 1986 году американским биохимиком Кэри Мюллисом. ПЦР поз­воляет выявить в исследуемом материале наличие специфического участка ДНК, характерного для исследуемого организма, и много­кратно размножить его. В основе метода лежит многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК (так назы­ваемая направленная амплификация ДНК). Специфичность мето­да составляет 100%, преимуществом является также быстрота получения результатов.

Серологические реакции

Принцип этих реакций основан на выявлении антигенов с помощью специфических антител — либо поликлональных, по­лученных при иммунизации животных антигенами, либо моно-клональных, полученных с помощью гибридомной технологии. В основе этих методов лежит реакция специфического связывания антиген-антитело. Различия методов заключаются в способах ре­гистрации и учета этой реакции. К основным серологическим ре­акциям относятся:

—  реакция связывания комплемента (РСК);

—  реакция нейтрализации (РН);

—  реакция непрямой геммаглютинации (РНГА);.

—  реакция иммунофлюоресценции (РИФ);

—  радиоиммунный анализ (РИА);

—  иммуноферментный анализ (ELISA, ИФА).

В настоящее время классические серологические реакции типа РСК, РН, РПГА в силу их низкой чувствительности, высокой тру­доемкости, малой пригодности к автоматизации отступили на вто­рой план. Все большее распространение получили РИФ и ИФА.

Метод иммунофлюоресценции. Как в прямой, так и в непрямой модификации позволяет выявить возбудителя по содержанию в них антигена с помощью моноклональных антител. Метод быст­рый, простой и недорогой, но оценка результата является субъек­тивной и требует высокого уровня подготовки. Недостаточная чувствительность отмечена у больных с вялотекущей и асимптома-тической инфекцией.

Иммуноферментный метод. Полученный материал обрабаты­вается специальной тест-системой. Метод основан на определении антигена с помощью моноклональных антител.

 

---------------------------------------         -        -------------------------------------------

На положительный результат в этих случаях указывает измене­ние окраски пробы, которое измеряется спектрофотометрпческим способом. Данный метод позволяет одновременно проводить иссле­дование большого количества проб и объективно оценивать резуль­таты.

Однако в течение 1-1,5 месяца после излечения происходит слущивание разрушенных клеток, содержащих поверхностный антиген, с которым реагируют моноклональные антитела. Поэто­му в течение этого времени контрольный анализ может быть поло­жительным.

Выделение вирусов

Количество вируса в организме обычно бывает максимальным в первые несколько дней после заражения. К моменту появления первых симптомов у больного нередко бывает уже слишком поздно выделять вирус, вызвавший заражение. У некоторых людей, одна­ко, может наблюдаться длительное выделение вируса. Поэтому це­лесообразно пытаться выделять его у больных с подозрением на вирусную этиологию заболевания. Однако если вирус не найден, то это не исключает вероятности вирусной инфекции.

Выделение вируса у новорожденных с подозрением на врожден­ную инфекцию следует проводить как можно быстрее после рожде­ния, чтобы не спутать случаи с неонатальной инфекцией или инфекцией более позднего детского возраста.

Для правильной диагностики инфекционного процесса очень важно производить правильный забор материала. При подозрении на вирусную инфекцию пораженные органы не всегда являются те­ми участками организма, в которых легче всего выделить вирус. Мазки из носа и мокрота обычно непригодны для выделения виру­са. Моча также в ограниченной степени пригодна для этих целей, однако она является предпочительной пробой при исследовании на цитомегаловирусную инфекцию (ЦМВ). При вирусных заболева­ниях, вызывающих образование везикулярной сыпи, для выделе­ния вируса необходимо брать мазок содержимого везикул.

Выделение бактерий

Для того, чтобы максимально увеличить вероятность выделе­ния бактерий, необходимо отбирать материал для исследования до начала антибиотикотерапии. Материалом для бактериологическо­го исследования являются глоточные мазки, мазки из половых ор-

 

---------------------------------         -        --------------------------------------------

ганов, гемокультура. Необходимо отметить, что при заборе матери­ала нужно учитывать, что некоторые возбудители являются внут­риклеточными паразитами (Chlamydia). Поэтому важно, чтобы были отобраны клетки, наиболее вероятно содержащие данные микроорганизмы.

Обнаружение специфических антител

По свойствам антител различают два понятия: аффинность (или аффинитет) и авидность (или авидитет).

Аффинность — это степень специфического сродства активного центра к антигенной детерминанте; авидность — это степень проч­ности связывания молекулы антитела с молекулой антигена. Чем выше аффинность (степень сродства), тем выраженнее и авидитет (прочность связывания). Кроме того, авидитет тем сильнее, чем больше связывающихся центров.

Антитела, реагирующие на инфекцию, впервые появляются примерно через неделю после заражения. Вначале вырабатывают­ся антитела класса IgM, затем начинают вырабатываться антитела класса IgG. После появления антител класса IgG начинается сни­жение титров IgM-антител. Через некоторый промежуток време­ни, длительность которого зависит от особенностей возбудителя и организма больного, антитела IgM уже не определяются. Нараста­ние уровня IgG происходит в течение нескольких недель. IgG обла­дают наиболее высокими аффинностью и авидностью. В начале иммунного ответа образуются низкоаффинные антитела. Позже в процессе вырабатывания иммунного ответа в организме появляют­ся высокоаффинные IgG-антитела. Высокоаффинные IgG-антитела остаются в организме в течение длительного времени.

В случаях, когда IgM обнаруживаются в крови, необходимо раз­делять первичную инфекцию и обострение. Для этого рекомендует­ся определять авидность антител IgG. Если в крови при наличии IgM обнаруживаются IgG с низкой авидностью, то это свидетельст­вует о первичной инфекции. Наличие же высоко авидных антител IgG (в присутствии IgM) говорит о вторичном иммунном ответе в случае попадания возбудителя в организм или обострения (реакти­вации) инфекции.

У новорожденных выявление IgM-антител имеет диагностиче­ское значение, так как материнские IgM, в отличие от IgG, не проникают через плаценту. Появление IgM у новорожденных на­блюдается только при их инфицировании, в то время как обнару­жение IgG может быть следствием пассивного переноса от матери.

 

---------------------------------------         -        -------------------------------------------

Материнские антитела могут персистировать у ребенка до одного года. Поэтому целесообразно одновременно исследовать сыворот­ку матери и младенца, что позволяет исключить пассивный пере­нос антител.

Антитела определяют с помощью серологических реакций, принцип которых заключается в выявлении антител с помощью специфического антигена. Реакция основана на специфическом связывании антиген—антитело.

Для выявления антител используют классические серологичес­кие способы (РСК, РПГА, РН, РИФ), а также ИФА, чувствитель­ность которого на 2-4 порядка выше по сравнению с классическими серологическими методами.

Важными понятиями в серодиагностике являются: сероконвер-сия антител, титр антител, серая зона.

Сероконверсия — появление специфических антител в сыворот­ке крови или увеличение их титра в 2-4 раза.

Титр антител — способ полуколичественного выражения со­держания специфических антител в сыворотке крови. Титр выра­жается в виде дроби, представляющей собой степень разведения исследуемой сыворотки, при котором анализ дает результат (1:100; 1:200 1:400 и т. д.). Более современные тест-системы позволяют оп­ределять количественное значение антител, которое выражается в Международных единицах (ME) или нанограммах на литр.

Серая зона — это диапазон концентраций специфических анти­тел, в который с равной вероятностью могут попадать как положи­тельные, так и отрицательные пробы. В этом случае для уточнения результата необходимо повторить исследование с новой сыворот­кой, полученной через 1-2 недели.

Хламидийная инфекция

Chlamydia trachomatis — внутриклеточный микроорганизм, тропный к цилиндрическим эпителиальным клеткам, поэтому по­лученные пробы должны содержать как можно больше эпители­альных клеток. Некачественно отобранный материал приводит к появлению ложноотрицательных результатов.

Материалом для исследования на Chlamydia trachomatis явля­ются мазки конъюктивы, шейки матки.

Традиционно «золотым стандартом» считают культуральный метод диагностики, предложенный в 1965 году J.B. Gordon и A.L. Quan. Это чувствительный и достоверный метод диагности­ки, который не дает ложноположительных результатов. Однако

 

______________________ -        -------------------------------------------------

данный метод трудоемкий, дорогой и требует наличия необходи­мого оборудования и используется в настоящее время в исследо­вательских целях.

Исторически первым было открытие телец Гельберта-Прова-чека в цитоплазме пораженных клеток конъюнктивы, церви-кального канала, уретры, парауретральных ходов. Данный метод используется и в настоящее время. Недостатками его является то, что он информативен при острых формах и при инфекции нижне­го полого тракта. Чувствительность данного метода составляет от 10 до 40%.

Распространенным методом диагностики хламидийной инфек­ции является метод прямой и непрямой иммунофлюоресценции. Он относительно простой и недорогой, основан на определении антигена Chlamydia trachomatis. Меченные флюоресцином моно-клональные антитела прикрепляются к элементарным тельцам, присутствующим в исследуемом материале. Чувствительность дан­ного метода составляет 90-100%, специфичность — 85-100%. Од­нако данный метод, как и цитологический, информативен при инфицировании нижних отделов урогенитального тракта, а субъ­ективизм в оценке результатов анализа ограничивает его диагнос­тическую ценность.

Метод иммуноферментного анализа основывается также на выявлении антигена хламидий в пораженных клетках. Преиму­ществами его в диагностике хламидийной инфекции являются простота транспортировки и хранения полученных материалов, объективности оценки результатов, возможности автоматизации и одновременного исследования большого количества проб. К недо­статкам относят высокий показатель ложноотрицательных и ложноположительных результатов, особенно при обследовании «бессимптомных» групп низкого риска, отсутствие возможности оценки качества забранного материала. Использование данного метода информативно также при инфекции нижнего отдела уроге­нитального тракта. В настоящее время этот метод не рекомендует­ся для исследования материала из конъюнктивы, однако он все чаще применяется при изучении материала из шейки матки и уретры в лабораториях, исследующих большое количество проб.

К молекулярным методам диагностики относятся все виды ПЦР, при которой выделяют возбудителя по нескольким копиям ДНК. Этот высокочувствительный метод позволяет с достовер­ностью определять хламидийную инфекцию,  однако есть опас-

49

—------------------------------------         -        -------------------------------------------

ность гипердиагностики хламидиоза при широком использовании этого метода для скринингового обследования пациентов вследствие невозможности дифференцирования мертвых и живых хламидий.

Наряду с выявлением антигенов или возбудителя в биоматери­але достаточно широко используются серологические методы, основанные на выявлении противохламидийных антител и опре­деления их титров в сыворотке больного. При неосложненных инфекциях половых органов специфические антитела не выраба­тываются, однако повышенные уровни этих антител часто выявляются у женщин с воспалением тазовых органов или с пери-гепатитом.

Определение классов специфических иммуноглобулинов (IgM, IgA, IgG) в сыворотке крови пациентов позволяет выявить как ран­ние стадии инфекционного процесса верхнего отдела полового тракта женщины (IgM), так и обострение хронического (IgA, IgG), а также контролировать эффективность лечения по изменению уровня специфичных антител. В сомнительных случаях полезным может быть исследование увеличения титра антител, проведенное через 2 недели после первого исследования.

Определение специфических антител также информативно у новорожденных, поскольку обнаружение IgM у младенца с пнев­монией указывает на хламидийную этиологию.

Говоря о методах диагностики хламидийной инфекции, необхо­димо отметить, что ни один из них не является универсальным. По­этому рекомендуется проводить исследование на хламидийную ин­фекцию, используя одновременно как минимум два метода.

Цитомегаловирусная инфекция

Вирус может быть выделен из амниотической жидкости, гло­точного мазка или мочи инфицированного младенца. Наиболее достоверно выделение в материале самого вируса или его ДНК. «Золотым стандартом» до сих пор остается вирусологический метод. Для выявления антигена используют реакцию иммунофлю-оресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), ДНК-гибридизацию, полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Специфи­ческие антитела IgM и IgG класса определяют иммуноферментным методом. Обнаружение ЦМВ-специфических IgM-антител в еди­ничной пробе крови указывает на недавнюю первичную или теку­щую (рецидивирующую) инфекцию. Определение IgG CMV должно

50

_--------------------------------- —        -        --------------------------------------------

осуществляться одновременно с определением IgM, особенно для диагностики первичной инфекции. Однократно определенный по­вышенный титр специфических антител класса IgG CMV не явля­ется диагностическим критерием острой фазы инфекции. Опреде­ление IgG-антител необходимо проводить в парных сыворотках с интервалом не менее 10 дней. Сероконверсия в период между дву­мя пробами крови может свидетельствовать о текущей инфекции.

Первичную инфекцию при беременности можно выявргть с по­мощью лабораторного исследования крови. После первичного ин­фицирования IgM-антитела персистируют до 16 недель, поэтому специфические IgM-антитела могут обнаруживаться в ранние сро­ки беременности, если инфицирование произошло еще до зачатия.

Врожденная инфекция может быть подтверждена либо путем выделения вируса из глоточного мазка или пробы мочи, взятых в течение первых трех недель жизни новорожденного, либо путем вы­явления ЦМВ-специфических IgM-антител в крови младенца или в пуповинной крови. В более поздние периоды жизни поставить диа­гноз врожденной ЦМВ-инфекции не представляется возможным. Определение IgM-антител после трех недель жизни может указы­вать на недавно развившуюся неонатальную или постнеонаталь-ную инфекцию, а выделение вируса в среду происходит постоянно у детей как с приобретенной, так и с врожденной инфекцией.

Энтеровирусы

Энтеровирусные инфекции обычно диагностируют путем выде­ления в клеточной культуре вируса из испражнений, глоточных мазков, спинномозговой жидкости, крови, мазков кожных пора­жений или секционного материала. Выделение вируса возможно только в тех лабораториях, где имеются условия для обнаружения возбудителя в культуре ткани. Таким способом могут быть выяв­лены вирусы Коксаки группы В и ECHO, некоторые штаммы Коксаки группы А. Серологический анализ, выявляющий IgM-антитела против энтеровирусов, может иметь определенное ретро­спективное значение, особенно при вспышках, но он мало приго­ден на острой стадии инфекций у новорожденных. Следует иметь в виду возможность перекрестных реакций между различными се-ротипами вирусов, поэтому зачастую трудно или невозможно се­рологическим путем установить, каким именно типом вируса вызвано заболевание.

51

---------------------------------------         -        -------------------------------------------

Escherichia coli

Материалом для исследования у беременной женщины может быть среднесуточная порция мочи, кровь, амниотическая жид­кость, полученная путем амниоцентеза, выделения из влагалища (заднего свода). У младенцев (при подозрении на инфицирование) материалом для исследования может быть кровь, желудочный ас­пират, мазок из уха, моча, пробы с других участков.

Е. coli легко выделяется в бактериальной культуре наряду с дру­гими потенциально патогенными бактериями, включая разновид­ности энтеробактерий и анаэробы.

При культивировании микроорганизмов экспресс-методы идентификации энтеробактерий могут обеспечить результат в тот же день. Более важным преимуществом данного метода является то, что в тот же день, когда выделена гемокультура или другая культу­ра E.coli, могут быть получены результаты определения антибио-тикочувствительности, поскольку чувствительность к антибиоти­кам иногда может быть определена после 8-часовой инкубации.

При септицемии или менингите, вызванных грамотрицатель-ными бактериями, в крови или спинномозговой жидкости может быть обнаружен эндотоксин. Высокочувствительным методом об­наружения эндотоксина является тест с лизатом Limulus.

Многие различные типы E.coli можно идентифицировать путем анализа антигенов, которые находятся в клеточной стенке (О-серо-типы) и капсуле (К-антигены). Эти типы имеют большое значение, так как могут коррелировать со специфическими инфекциями. Методами обнаружения является латексная агглютинация.

Среди других лабораторных тестов используют количественное определение С-реактивного белка (СРБ) как ориентировочный по­казатель бактериальной инфекции у младенцев, которые находят­ся в тяжелом состоянии, но без признаков явного сепсиса. Высокие (> 80 мг/л) или возрастающие уровни СРБ могут служить основа­нием для срочного назначения антибиотикотерапии, а серийные пробы позволяют осуществлять мониторинг противомикробной терапии.

К числу других неспецифических показателей наличия сепсиса, вызванного E.coli, относятся следующие: нейтропения, нейтропе-ния с наличием незрелых форм лейкоцитов и тромбоцитопения; увеличение продуктов деградации фибрина; удлинение протромби-нового времени. О наличии тяжело протекающего сепсиса могут свидетельствовать также повышение билирубина и трансаминаз.

52

—-----------------------------------         -        -------------------------------------------

Вирусный гепатит В (HBV)

Диагностика вируса гепатита В основывается на серологичес­ком исследовании крови. Маркерами вирусного гепатита В явля­ются следующие:

—  поверхностный антиген гепатита В (HBsAg) и антитела к не­му (анти-HBs);

—  антитела к ядерному антигену гепатита В (анти-НВс, анти-НВс IgM);

—  е-антиген гепатита В (HBeAg) и специфические антитела к нему (анти-НВе).

Пациенты, у которых обнаруживается HBsAg (HBsAg — поло­жительны), трактуются как инфицированные вирусом гепатита В; его обнаружение в крови на протяжении 6 месяцев и более свиде­тельствует о хроническом течении процесса. Этот маркер не несет информации об активности гепатита. Поэтому его выявление в крови служит только основанием для исследования других марке­ров гепатита В. Те, у кого обнаруживаются HBeAg, расцениваются как высоко инфекционные и опасны для окружающих. HBeAg — маркер фазы размножения (репликации вируса), который может выявляться как при остром, так и при хроническом гепатите В. На­личие этого показателя учитывается при решении вопроса о прове­дении противовирусного лечения. Как только пациент начинает выздоравливать, происходит потеря е-антигена, и начинают обра­зовываться антитела НВе и антитела HBs.

Анти-HBs — это антитела, которые обнаруживаются у лиц, вы­здоровевших или вакцинированных от гепатита. Это показатель иммунной защиты организма от вируса гепатита В. О степени на­дежности этой защиты свидетельствует количественный уровень анти-HBsAg в крови пациента.

Анти-НВе — антитела появляются в крови после исчезновения HBeAg и, как правило, свидетельствуют о прекращении размноже­ния вируса. Однако существует измененная (мутантная) разновид­ность вируса гепатита В, при инфицировании которой активное размножение вируса сохраняется при наличии анти-НВе. Беремен­ная женщина с положительным HBsAg должна параллельно обследоваться на анти-HBs, которые указывают на наличие пере­несенной инфекции. Если HBsAg сохраняются в течение более 6 месяцев, это свидетельствует о хроническом течении болезни. Да­же после выздоравливания пациенты могут быть носителем анти­гена в течение года и более. Исследование уровня трансаминаз

53

---------------------------------------        -        -------------------------------------------

печени необходимо для дифференцирования между симптоматиче­ским хроническим течением, хроническим персистирующим гепа­титом и хроническим активным гепатитом. Результаты скрининга на гепатит В у беременной могут указывать на то, что новорожден­ному необходимо как можно скорее после рождения ввести имму­ноглобулин и вакцину против гепатита В.

Существуют разнообразные тесты, применяемые при HBV-ин-фекции. В настоящее время в основном применяют серологические исследования крови (РИА или ИФА).

Вирусный гепатит С (HCV)

Диагностика вируса гепатита С также основывается на сероло­гическом исследовании крови. Маркерами вирусного гепатита С являются: антитела HCV и прямое обнаружение вируса гепатита С в сыворотке крови.

Для обнаружения антител HCV используют иммуноферментные технологии (ELISA). Недостатком данного метода является тот факт, что пациенты с HCV-инфекцией могут вырабатывать антите­ла до года. Кроме того, количество вырабатываемых организмом антител может быть незначительным и не обнаруживаться данным методом даже при наличии активной, инфекционной болезни. Результаты HCV, следовательно, должны интерпретироваться с учетом анамнеза и объективного статуса, а также результатов вспо­могательных лабораторных исследований.

Для подтверждения тест-положительных результатов иммуно-ферментного анализа используется рекомбинантный иммуноблот-метод (Western blot).

Наиболее специфическим диагностическим методом на сегод­няшний день является ПЦР, которая заключается в полимеразном цепном увеличении вирусного антигена в клинических экземпля­рах для его прямого обнаружения.

Вирусный гепатит Д (HDV)

Лабораторная диагностика HDV-инфекции обычно основывает­ся на определении антител в сыворотке пациента (анти-HDV). В острой фазе болезни специфический анти-HDV IgM может опреде­ляться, хотя IgM может оставаться в низких титрах в случаях пер-систирующей HDV-инфекции. Анти-HDV IgG появляются позже. Для определения антител в сыворотке применяется Western blot, методика которого более чувствительна, чем иммуноферментные

54

---------------------------------------        -        --------------------------------------------

методы. В научно-исследовательских лабораториях используется метод молекулярной гибридизации, что позволяет обнаружить РНК HDV в клинических экземплярах. Следует отметить, что об­следованию на HDV подлежат пациенты с гепатитом В, поскольку HDV — маленькая круглая полоска РНК, которая связана со спе­цифическим антигеном (HDVAg), покрытым HbsAg.

Вирусный гепатит Е (HEV)

Диагноз HEV-инфекции ставится на основании исключения другого инфекционного гепатита.

Вирус простого герпеса

Вирус может быть обнаружен в жидкости везикул, спинномозго­вой жидкости (СМЖ) и тонких срезах инфицированных тканей на секции; у новорожденных — на коже, в полости рта, глотки, носо­вой полости, глаз и СМЖ. Достоверным методом лабораторной ди­агностики инфекции является культуральное выделение вируса. Однако для этого нужны специализированные микробиологичес­кие лаборатории.

Обнаружение антигенов ВПГ в биологических жидкостях или в клетках является прямым доказательством активной репликации вируса и, следовательно, однозначно подтверждает этиологию забо­левания. Для выявления антигенов ВПГ широко применяется ме­тод РИФ. Характеризуя метод РИФ, следует подчеркнуть как его преимущества (специфичность, экспресс-метод, доступность, невы­сокую стоимость), так и недостатки (относительно невысокую чув­ствительность, зависимость диагностической эффективности от стадии заболевания, высокий уровень субъективности при учете результата).

Цитоморфологические методы позволяют выявить индуциро­ванные вирусом морфологические изменения в клетках и тканях пораженных органов. Эти методы делятся на две группы: в одних используется световая, в других — электронная микроскопия. При использовании световой микроскопии в зонах поражения отмеча­ется типичный для герпеса метаморфоз клеток и ядер. К недостат­кам световой микроскопии следует отнести их неспецифичность, невозможность дифференцирования первичной инфекции от реци­дивирующей, невозможность дифференцирования типа ВПГ.

Электронно-микроскопическое исследование позволяет обнару­жить в биопробах характерные по морфологии частицы ВПГ. Огра-

55

---------------------------------------        -        --------------------------------------------

ничениями при использовании электронно-микроскопических методов является их неспецифичность, невозможность дифферен­цирования первичной и рецидивирующей инфекции и типа ВПГ, труднодоступность оборудования и отсутствие подготовленного персонала. Новейшим методом диагностики генитального герпеса является метод ПЦР.

Для выявления антител к антигену ВПГ используют классичес­кие серологические методы, а также ИФА, чувствительность которого на 2-4 порядка выше по сравнению с классическими серо­логическими методами.

Обнаружение ВПГ-специфических IgM-антител в единичной пробе крови указывает на недавнюю первичную или текущую (рецидивирующую) инфекцию. Определение IgG ВПГ должно осуществляться одновременно с определением IgM, особенно для диагностики первичной инфекции. Однократно определенный повышенный титр специфических антител класса IgG ВПГ не яв­ляется диагностическим критерием острой фазы инфекции. Опре­деление IgG-антител необходимо проводить в парных сыворотках с интервалом не менее 10 дней. Сероконверсия в период между дву­мя пробами крови также свидетельствует о текущей инфекции.

Исследование же сыворотки новорожденных на антитела к ВПГ не информативно, поскольку невозможно интерпретировать факт обнаружения IgG-антител к ВПГ из-за присутствия материнских антител, прошедших через плаценту. В этом случае диагностичес­кую ценность приобретает определение специфических IgM-анти­тел в сыворотке новорожденного.

Листериоз

Подозрение на листериоз может возникнуть в тех случаях, ког­да беременные страдают атипичным лихорадочным состоянием, а также при преждевременных родах. Следует брать пробы влага­лищных секретов, мочи и крови для бактериологического анализа и посева. Для этих целей обычно требуются специальные среды.

В последние годы разработана методика фаготипирования, од­нако 36% штаммов являются нетипируемыми.

При гистологическом исследовании плаценты выявляются та­кие характерные изменения, как микроабсцессы диаметром до 10 мм, воспаление ворсин и пуповины, а также хориоамнионит.

Анализ материнской крови на наличие антител обычно бывает малоэффективным, но его можно применять для определения Listeria как вероятной причины недавнего выкидыша.

56

--------------------------------------- -        -------------------------------------------------

У новорожденных Listeria могут быть высеяны из прямой киш­ки, с поверхности кожи, из крови и спинномозговой жидкости. Возбудитель может быть также высеян из первых порций выделен­ного мекония. При окраске по Граму мазков желудочного аспирата, взятых у младенца при болезни с ранним началом, обычно обнару­живаются полиморфно-ядерные лейкоциты и грамположительные микроорганизмы.

Neisseria gonorhoeae

Диагноз гонореи может быть легко поставлен с помощью мето­дов культивирования возбудителя. В этих случаях следует брать материал из уретры, шейки матки и прямой кишки. Другие методы выявления возбудителя дают менее удовлетворительные результа­ты, а исследование крови совершенно не эффективно. Методы культивирования обладают высокой чувствительностью, но при этом требуется, чтобы забранный материал был направлен в лабо­раторию в соответствующих транспортных средах. Необходимо от­метить, что ни в одной транспортной среде гонококки полностью не сохраняются на протяжении более 24 часов. Культуральная иден­тификация возбудителя включает оксидазную реакцию и реакцию расщепления декстрозы. Преимуществом культурального метода обнаружения гонококка является возможность одновременно проводить определение антибиотикоустойчивости, поскольку в на­стоящее время у больных циркулируют штаммы, устойчивые к пенициллину и другим антибиотикам. Обнаружение гонококка по­средством выявления антигена с помощью ИФА или РИФ менее эффективно, чем культуральный метод. Окраска препаратов мети-леновым синим и по Граму имеет только указательный характер и не может использоваться для постановки диагноза. В последнее время для обнаружения Neisseria gonorrhoeae используют молеку-лярно-биологические методы — ПЦР и ЛЦР.

Корь

Клинические симптомы кори делают в большинстве случаев не­нужной лабораторную диагностику. Антитела, выявляемые при ИФА, увеличиваются по мере нарастания сыпи и достигают пика к десятому дню (около четырех недель после вакцинации).

IgM и IgG появляются одновременно, но IgM исчезает к 90-му дню от начала заболевания, a IgG снижаются к шестому ме­сяцу и остаются на стабильном уровне.

57

—------------------------------------ -        -------------------------------------------------

Парвовирус В19

Не существует традиционных методов исследования клеточных культур для парвовируса В19. Однако разработаны специальные методики, основанные на использовании первичных культур кле­ток-предшественников кроветворного ряда из костного мозга чело­века или печени плода. Однако эти методы применяются только при научных исследованиях. На практике используется метод ДНК-гибридизации, основанный на выделении нуклеиновых кис­лот. Для подтверждения тестов на вирус В19 могут применяться некоторые другие тесты. Надежным средством для обнаружения вируса является электронная микроскопия, поскольку при данной инфекции часто отмечается В19-виремия и достаточное количество частиц вируса может быть визуально определено при негативной окраске. Данный метод может быть использован для исследования тканей.

Для обнаружения антигена В19 используют ряд методов — в час­тности, реакцию встречного иммуноэлектрофореза и радиоимму-ноанализа. Реакция вируса В19 в тестах по определению антигена может быть снижена или блокирована за счет одновременного при­сутствия специфических антител в пробах сыворотки или тканей.

Наиболее широко используемыми тестами на IgM и IgG к В19 в настоящее время являются разные варианты радиоиммуноанали-за. Количественное определение IgM-антител к В19 необходимо для диагностики недавно развившейся инфекции. Количественные по­казатели IgG к В19 определяют в целях получения доказательства ранее перенесенной инфекции и наличия иммунитета.

Наиболее информативным диагностическим тестом является выявление IgM-антител к В19. Диагноз В19-инфекции при бере­менности должен основываться на обнаружении у матери IgM-антител к В19. Беременных женщин, которые имели контакт с больными, следует тестировать на IgM и IgG-антител к В19. Для вы­явления инфицированных эмбрионов применяются такие методы, как определение уровней сывороточного альфа-протеина, ультра­звуковая диагностика и исследование крови плода на IgM-анти-тела к В19. При выкидышах или гибели плода в результате материнской инфекции необходимо проводить исследование пла­центы и тканей плода на наличие В19.

Можно исследовать с помощью прямых тестов на обнаружение вируса В19 пуповинную кровь, глоточные мазки и другие пробы, взятые у новорожденного. Но очень часто имеют место отрицатель-

58

---------------------------------------        -        -------------------------------------------

ные результаты. В этих случаях проводят исследование ребенка в возрасте 1 год. К этому времени титры антител, пассивно передан­ных плоду от матери, падают до невыявляемого уровня и при нали­чии инфекции определяются собственные антитела.

Краснуха

Весьма важно, чтобы беременные женщины с заболеваниями, похожими на краснуху или контактировавшие с такими больны­ми, были обследованы как можно быстрее. Материалом для иссле­дования является сыворотка крови.

Существует ряд методик выявления антител против вируса краснухи, которые позволяют проводить количественную оценку уровней антител и тем самым использовать ее для диагностики ин­фекции при нарастании титров антител. К методикам, чаще всего применяющимся для скрининга антител при краснухе, относятся радиальный гемолиз (РГ), иммуноферментный анализ (ИФА) и ла­текс-агглютинация (ЛА). Для выявления нарастания титров анти­тел часто применяют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) и ИФА.

Серологическая диагностика краснухи может быть проведена путем обнаружения значительного подъема титров антител IgG (более чем в 4 раза) или выявления специфических IgM-антител к вирусу краснухи.

Существенный подъем титров антител может быть выявлен в те­чение первых 4-7 дней после появления симптомов, хотя иногда серологический ответ может задержаться до 10 дней. При обследо­вании беременной женщины важно подтвердить полученные результаты с помощью альтернативного метода (например, опреде­ление специфических IgM-антител или путем исследования второй пробы сыворотки).

Специфические IgM-антитела обычно обнаруживаются в тече­ние 6-8 недель после контакта, в отдельных случаях они могут быть выявлены к четвертой неделе после начала болезни.

Пренатальная диагностика имеет значение для решения вопро­са о том, произошло ли инфицирование плода. Теоретически име­ются три возможных метода постановки пренатального диагноза врожденной инфекции:

1. Обнаружение вируса, вирусных антигенов или нуклеиновой кислоты в биоптатах хориона.

59

---------------------- —-------------         -        -------------------------------------------

2.   Обнаружение вируса, вирусных антигенов или нуклеиновой кислоты в амниотической жидкости.

3.   Обнаружение специфических IgM-антител в крови плода, по­лученной при кордоцентезе.

Диагноз врожденной краснухи обычно ставят путем исследова­ния пуповинной крови, а также сыворотки новорожденного или младенца на наличие специфических IgM-антител. Отсутствие спе­цифических IgM-антител в неонатальный период, по существу, ис­ключает диагноз врожденной краснухи.

Диагноз можно поставить на основании выделения вируса крас­нухи из глоточных мазков или мочи. При этом вирус обнаружива­ется у большинства новорожденных с врожденной инфекцией. Обнаружение специфических IgG-антител в период от 1 года до 2-х лет жизни ребенка указывает на вероятность врожденной ин­фекции, так как инфицирование детей краснухой в этом возрасте происходит довольно редко.

Стрептококк группы В

Материалом для исследования у беременной женщины может быть среднесуточная порция мочи, кровь, выделения из влагалища (заднего свода). У младенцев (при подозрении на инфицирование) материалом для исследования может быть кровь, желудочный ас­пират, мазок из уха, моча, пробы с других участков, спинномозго­вая жидкость.

Штаммы стрептококка группы В быстро и постоянно растут на средах, обогащенных глюкозой, кровью или сывороткой. К другим методам диагностики относится обнаружение антигена в крови, спинномозговой жидкости и моче. Имеется ряд наборов промыш­ленного производства, основанных на разнообразных иммунологи­ческих методах выявления стрептококкового антигена группы В. Точные данные о проценте ложноположительных и ложноотрица-тельных результатов у разных авторов варьируют, однако в целом эти тесты являются достаточно надежными. Особенно пригодны они в тех случаях, где высока вероятность их обнаружения. Как правило, методы обнаружения антигена — это экспресс-тесты, ко­торые занимают 30 минут. Многие современные полуавтоматичес­кие методы позволяют получить культуру грамположительных кокков во флаконе в течение суток. Обнаружение антигена груп­пы В во флаконе дает возможность быстро поставить ориентиро­вочный диагноз.

60

—-----------------------------------         -        --------------------------------------- —

Сифилис

Для установления диагноза сифилиса используют как бактерио-скопическое, так и серологическое исследование крови.

Наиболее убедительным доказательством трепонемной природы заболевания является прямая визуализация трепонемы. При пер­вичном сифилисе на бледную трепонему исследуют отделяемое эро-зивно-язвенных папулезных элементов в области половых органов, полости рта, в пунктате из регионарных лимфатических узлов. При вторичном сифилисе используется материал из различных поражений кожи и слизистых оболочек. Для диагностики врож­денного сифилиса может быть использована амниотическая жидкость. При отрицательных результатах микроскопическое ис­следование повторяют либо до обнаружения бледной трепонемы, либо до подтверждения диагноза результатами серологического ис­следования. В последнее время для обнаружения ДНК бледной тре­понемы применяют ПЦР.

Серологические исследования крови основаны на определении антител, которые вырабатываются при сифилисе и классифициро­ваны как неспецифические и специфические антитела против тре-понем.

Специфические антитела против трепонем вырабатываются в ответ на инфекцию, вызываемую трепонемами. Как и при других инфекциях, вначале появляются антитела класса IgM, а затем — IgG-антитела. IgM-антитела можно выявить у пациентов с первич­ным, вторичным или врожденным сифилисом, а также при реин-фекции. В целом титры IgM-антител снижаются после лечения, однако скорость снижения зависит от стадии болезни, при которой проводилось лечение; антитела снижаются быстрее после ранее на­чатого лечения. При позднем или неполном лечении антитела мо­гут персистировать в течение длительного периода.

Образование IgG-антител следует за выработкой IgM-антител и обычно достигает более высокого уровня. Хотя титры IgG-антител могут со временем снижаться, они персистируют в течение всей жизни пациента даже при адекватном лечении.

Неспецифические антитела против трепонем включают анти­тела против группового антигена и кардиолипина (антилипидные антитела). Антилипидные антитела выявляются на ранних стади­ях течения инфекции и достигают высоких уровней к началу вторичного периода. После проведенного лечения титры антител снижаются до уровня, который зависит от стадии, при которой бы-

61

-------------------------------        -        ------------------------------

ло начато лечение. Данные уровни могут снижаться по мере про-грессирования инфекции до поздней стадии (даже при отсутствии терапии). Реинфекция приводит к увеличению титров антител.

Существует множество тестов для количественной оценки анти­тел против липидов. Тесты фиксации комплемента (например, ре­акция Вассермана) в настоящее время в мире применяются очень редко, так как они не имеют преимуществ по сравнению с совре­менными тестами флоккуляции, тестом Venereae Disease Research Laboratory (VDRL) или экспресс-тестом, основанным на микропре­ципитации с кардиолипиновым антигеном с плазмой крови (RPR), которые более простые, быстрые, а также дешевле в исполнении.

Скрининговые и подтверждающие тесты на сифилис представ­лены в таблице 3.1. Серологический скрининг проводится с помощью анализа крови, взятого в первый визит пациентки, с при­менением стандартных тестов — нетрепонемных, таких как VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) или RPR (Rapid Plasma Reagin). Эти тесты обнаруживают нетрепонемные антитела и явля­ются неспецифическими, поэтому все положительные или сомни­тельные результаты должны быть подтверждены с помощью специфических трепонемных тестов, таких как тест иммобилиза­ции Treponema pallidum (Treponemapallidum immobilization test — TPI) и реакция иммунофлюоресценции-абсорбции (FTA-ABS — fluorescent treponemal antibody absorption).

После того, как получен первичный положительный результат какого-либо теста по определению антилипидных антител, необхо­димо определить титры этих антител. Данные тесты обладают огра­ниченной специфичностью, но они пригодны для диагностики трепонемной инфекции, поскольку дают положительный результат в начальной стадии и являются достоверными маркерами активно­сти инфекционного процесса.

Достоверным способом оценки активности болезни является тест на IgM-антитела.

Кардиолипины широко распространены в природе, поэтому ан-тилипидные антитела не являются специфическими при трепонем­ной инфекции: позитивные результаты могут наблюдаться при других заболеваниях, а иногда и у здоровых людей.

В 1982 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) ре­комендовала применение двух тестов для скрининга на сифилис. Один из них предназначался для обнаружения липидного (VDRL), а второй — трепонемного антигена (RPR). Данная комбинация представляет собой оптимальный способ выявления всех стадий трепонемной инфекции — как леченной, так и не леченной. В то

62

----------------------------        -        ----------------------------------

Таблица 3.1. Серологические тесты, применяемые для диагностики и эффективности лечения сифилиса

 

Тест	Тип теста	Клиническое применение
Rapid plasma regain (RPR)	Нетрепонемный (неспе­цифический). Карточный тест Rapid plasma regain «на месте». Макроскопический тест, может быть использован в клиниках. Недорогой	Диагноз активности, применяется в скринин­ге и для диагностики ак­тивности заболевания. Количественный. Успешность лечения/ре-инфекция
Veneral Disease Research Laboratory (VDRL)	Нетрепонемный (неспе­цифический). Не является тестом «на месте». Более чувствительный, так как микроскопиро-вание позволяет опреде­лить флоккуляцию. Должен быть проведен в лаборатории	Диагноз активности, применяется в скринин­ге и для диагностики ак­тивности заболевания. Количественный. Успешность лечения /ре-инфекция
Тест микроагглю­тинации Т.pallidum (MHA-TP)	Трепонемный. Специфический. Не является тестом « на месте». Дорогой	Исключает ложнополо-жительные результаты нетрепонемных тестов «serofast» (+ на протя­жении жизни). Качественный тест
Флюоресцентный тест абсорбции ан­тител Т.pallidum (FTA-ABS)	Трепонемный. Специфический. Не является тестом «на месте». Дорогой	Исключает ложнополо-жительные результаты нетрепонемных тестов «serofast» (+ на протя­жении жизни). Качественный тест. IgM может быть поло­жительным на ранних стадиях сифилиса

63

---------------------------------------        -        --------------------------------------------

же время тесты VDRL и RPR — взаимозаменяемые и оказываются недостаточными для выявления ранней первичной инфекции.

При подозрении на первичную инфекцию у беременной необхо­димо проводить определение FTA. Однако диагноз первичной инфекции в большинстве случаев можно поставить путем тщатель­ного клинического обследования, сбора анамнеза и темнопольной микроскопии материала, взятого из любых участков поражения. Тест FTA применяется также в качестве контрольного теста для подтверждения результатов, полученных при исследовании мате­риала каким-либо из скрининг-тестов.

Современные серологические методики непригодны для диагно­стики сифилиса у плода.

Имеющиеся у матери антилипидные и антитрепонемные анти­тела могут пассивно проходить через плаценту; следовательно, об­наружение антител в крови плода не обязательно подразумевает наличие инфекции. Поэтому, учитывая эффективность лечения ин­фекции у матери, следует ориентироваться именно на это лечение в сочетании с регулярными серологическими обследованиями ново­рожденного для подтверждения эффективности терапии.

Окончательный диагноз сифилиса у новорожденного может быть поставлен при выявлении возбудителя — обычно путем тем-нопольного микроскопического исследования материала, получен­ного из пораженных участков тела. Серологическая диагностика у младенцев проблематична, так как антилипидные и антитрепонем­ные антитела IgG-антитела, имеющиеся у матери, могут пассивно передаваться плоду через плаценту. Антитела, полученные от матери, могут персистировать у младенца в течение нескольких месяцев, но, как правило, исчезают к 6-месячному возрасту. Ново­рожденный может быть обследован на наличие IgM-антител. Мате­ринские IgM-антитела не проходят через плаценту, и позитивный результат в этом случае позволяет предположить врожденную ин­фекцию. Однако при этом могут наблюдаться как ложноположи-тельные, так и ложноотрицательные результаты, и младенцы с врожденной инфекцией могут не быть IgM-позитивными вплоть до 3-месячного возраста. Кроме того, инфицированные младенцы могут быть и серонегативными при рождении, если мать была инфи­цирована в третьем триместре беременности. Поэтому рекоменду­ется проводить повторный скрининг младенцев, подверженных риску инфекции, вплоть до 6-месячного возраста.

В постнеонатальном периоде и в раннем детском возрасте кли­нический диагноз врожденного сифилиса может быть подтвержден путем серологического обследования.

64

--------------------------------------- -        -------------------------------------------------

Токсоплазмоз

Материалом для исследования у беременной женщины являет­ся сыворотка крови. Диагноз основывается на определении специ­фических антител. Наиболее достоверным подходом в этом случае является выявление специфической IgG-сероконверсии (т. е. пере­ход отрицательных результатов исследования в положительные). Точно установленная IgG-сероконверсия может быть подтвержде­на выявлением специфических IgM-антител. В этом случае стано­вится очевидным, что речь идет об острой инфекции, создающей риск внутриутробной передачи токсоплазмоза.

Если серологические тесты в первом триместре беременности указывают на наличие инфекции у матери, необходимо обследо­вать плод с помощью ультразвуковой эхографии и кордоцентеза. В крови плода, полученной путем кордоцентеза, можно измерить уровень IgM-антител

Принятым «эталонным» методом для количественной оценки антител против токсоплазм является тест окрашивания. Ввиду технической сложности и высокой его стоимости, выполняется только в специализированных центрах. Традиционные варианты метода ELISA при количественном определении IgM-антител часто дают ложноположительные результаты, связанные с избытком специфических IgG-антител, и ложнопозитивные реакции, связан­ные с присутствием ревматоидного и антинуклеарного фактора в сыворотке.

У новорожденных с выраженными поражениями предположи­тельный диагноз может быть поставлен на основании клинических данных. При выделении паразита из ткани плаценты диагноз врожденной инфекции становится весьма вероятным, но и отрица­тельные результаты исследования не исключают такого диагноза. Выделение Т.gondii из крови новорожденного имеет диагностичес­кое значение, но, как и при культивировании ткани плаценты, отрицательные результаты могут быть получены при наличии врожденной инфекции, особенно если проводилось пренатальное лечение. Для выделения паразитов из крови плода требуется ускоренная и высокочувствительная методика. Заражение живот­ных является высокочувствительным методом, однако оконча­тельные результаты могут быть получены только через 45 дней. Более быстрым методом является выращивание токсоплазм в куль­туре ткани, но при этом не обеспечивается достаточный уровень чувствительности. Эти проблемы можно преодолеть с помощью мо­лекулярной биологии в целях обнаружения специфической ДНК.

65

---------------------------------------        -        --------------------------------------------

Серологическое обследование младенца осложняется при нали­чии у ребенка (как инфицированного, так и неинфицированного) пассивно приобретенного материнского иммуноглобулина G. Титр материнских антител, выявленных у младенца после родов, про­грессивно снижается. Если не считать случаев обнаружения чрез­вычайно высоких исходных титров, то материнские антитела обычно исчезают из крови младенца к 10-месячному возрасту. На­личие специфических IgM-антител свидетельствует о врожденной инфекции, но лишь у 1/3 новорожденных с врожденной инфекци­ей вырабатываются IgM-антитела в определяемых уровнях. Накопленный до настоящего времени опыт свидетельствует о боль­шом значении определения IgA-антител для постнатальной диаг­ностики врожденного токсоплазмоза.

Ветряная оспа

Клинический диагноз ветряной оспы можно подтвердить серо­логическими методами путем обнаружения четырехкратного нарастания титров антител в парных сыворотках, взятых в опреде­ленные периоды, и выявления специфических IgM-антител к виру­су ветряной оспы. IgG и IgM-антитела появляются через 2-5 дней после возникновения сыпи, их уровни достигают пика через 3-5 дней, затем титры IgM-антител снижаются, и через несколько месяцев эти антитела уже не выявляются; IgG-антитела персисти-руют в течение всей жизни. Уровни антител можно достоверно оп­ределить с помощью реакции связывания комплемента (РСК), иммунофлюоресценции (РИФ) и иммуноферментными методика­ми (ИФА). Нарастание титров IgG-антител может быть у пациентов с первичными поражениями, вызванными вирусом простого герпе­са, а также у пациентов с опоясывающим лишаем.

Для подтверждения неонатальной инфекции используют опреде­ление специфических IgM-антител. У некоторых IgM-негативных больных ретроспективные доказательства врожденной инфекции были получены путем выявления персистенции специфических IgG-антител в течение первого года жизни. Сообщения об антена­тальной диагностике врожденной инфекции ветряной оспы путем выявления специфических IgM-антител в крови плода отсутствуют.

Лабораторное подтверждение ветряной оспы у взрослого или но­ворожденного можно осуществлять путем идентификации вируса ветряной оспы в жидкости везикул. Частицы вируса эффективно выявляются путем электронной микроскопии. Обнаружение спе­цифических антигенов в везикулярной жидкости методом мечен-

66

---------- —------------------------        -        --------------------------------------------

ных флюоресцином антител осуществляется гораздо быстрее. Попытки выделить вирус у младенцев с синдромом врожденной ветряной оспы обычно оказываются безуспешными.

ВИЧ

С 1984 года основой диагностики ВИЧ-инфекции являются им­мунологические методы.

Специфический диагноз можно поставить путем тестирования крови на наличие антител против ВИЧ (анти-ВИЧ). У большинства пациентов сероконверсия отмечается в течение 6-8 недель после инфицирования, хотя в некоторых случаях антитела выявляются только через 6-9 месяцев. Поэтому отрицательный тест на наличие антител может считаться достоверным, если пациент не имел экс­позиции к вирусу в течение приблизительно 6 месяцев. При нали­чии постоянного риска инфекции отрицательный тест не имеет существенного значения.

Иммуноферментный анализ является первым скрининговым этапом обследования. Он позволяет определить в сыворотке крови суммарные антитела к ВИЧ. Если в ELISA получен положитель­ный результат, проводят два повторных исследования данного образца тем же методом; при двух отрицательных результатах по­вторных исследований кровь считается неинфицированной. Если одно или оба исследования повторяют ранее полученный резуль­тат, его перепроверяют на втором этапе — стадии подтверждающей диагностики. На этом этапе осуществляется исследование сыворот­ки крови с помощью метода иммуноблотинга, позволяющего уста­новить наличие антител к отдельным протеинам ВИЧ.

Выявление в сыворотке антител к поверхностным протеинам ВИЧ (gpl60, gpl20, gp41), как правило, обнаруживающихся в со­четании с антителами к ядерному белку р24, свидетельствует о на­личии ВИЧ-инфекции. Положительными считаются пробы, в которых обнаруживаются антитела к 2-3 гликопротеидам ВИЧ.

Среди антигенов ВИЧ наиболее часто определяют белок р24, Антиген р24 не связан с антителами только в начальный период за­болевания и в стадии СПИДа, поэтому он может быть использован для диагностики ВИЧ только в эти периоды. Высокой специфично­стью обладает метод ДНК-зондов, или молекулярной гибридизации, или полимеразная цепная реакция (ПЦР). Этот метод позволяет оп­ределять генетический материал вируса даже в начальный период

67

---------------------------------------         -        -------------------------------------------

болезни. Кроме того, ПЦР выявляет количество РНК-копий виру­са в 1 мл крови («вирусная нагрузка»), что является одним из ос­новных лабораторных маркеров прогрессирования ВИЧ-инфекции.

Теоретически решающим для уточнения вопроса об инфициро-ванности организма ВИЧ является выделение культуры вируса. Од­нако на практике возможности применения этого метода ограниче­ны из-за дороговизны исследования, низкого количества копий вируса в крови больных в некоторые периоды заболевания, что де­лает невозможным выделение вируса, и длительность получения ре­зультата. Таким образом, хотя выделение культуры ВИЧ является важным диагностическим тестом, но он практически не применя­ется из-за большой трудоемкости исследования, необходимости специально оборудованной лаборатории, высокой стоимости, дли­тельности получения результата (2-4 недели).

Для определения глубины иммуносупрессии и прогнозирования развития тех или иных вторичных заболеваний применяют опреде­ление уровня CD4+T-лимфоцитов. У здоровых взрослых людей ми­нимальное количество СD4+Т-лимфоцитов составляет 1400 в 1 мкл. При ВИЧ-инфекции количество этих клеток снижается до 500 в 1 мкл. В стадии СПИДа их менее 200 в 1 мкл.

В настоящее время нет никаких данных об эффективной диаг­ностике инфекции у плода. Результаты проводимых тестов трудно интерпретировать, и даже самый чувствительный из них — ПЦР — не может считаться достоверным на самых ранних этапах жизни. Обнаружение антител против вируса как традиционный подход достаточно трудно применять для диагностики внутрима-точной и/или неонатальной инфекции. Эти трудности связаны с наличием материнских антител, перенесенных через плаценту. Поэтому необходимо регулярно обследовать ребенка, чтобы вы­явить исчезновение или постоянное наличие антител. На практике это означает, что последующее наблюдение должно продолжаться не менее 15-18 месяцев.

Эпидемический вирус паротита

Основным методом лабораторной диагностики эпидемического паротита является определение IgM к вирусу паротита в сыворот­ке. IgM-антитела появляются в острый период инфекции (первые дни) и сохраняются до 2-х лет.

68

---------------------------------------         -        -------------------------------------------

Урогенитальные микоплазмы

Учитывая то, что урогенитальные микоплазмы, к которым от­носятся Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, могут являться коменсалами вагинального тракта здоровых женщин, оценка уровня контаминации ими должна всегда носить количест­венный характер. Поэтому для диагностики урогенитальных ми-коплазм приемлем культуральныи метод. Количество бактерий оценивают в КОЕ/мл исследуемого материала. Концентрация микоплазм, в которой они не вызывают патогенное действие, со­ставляет 10³ КОЕ/мл. Для сбора исследуемого материала и его транспортировки используют специальные питательные среды. Культивирование, идентификация и количественный учет мико­плазм могут быть осуществлены при помощи стандартных систем Mycoplasma DUO, Mycoplasma 1ST. Эти же тест-системы могут быть использованы и для определения чувствительности выделенных штаммов микоплазм к антибиотикам.

Материалом для исследования являются пробы со слизистой уретры, сводов влагалища, пробы мочи, абортированные или мер­творожденные плоды, амниотическая жидкость, пробы с плаценты.

Папилломавирусная инфекция

Для диагностики ВПЧ-инфекции используют цитологический метод при окраске мазков по Папаниколау и метод ДНК-гибриди­зации с применением нуклеиновых кислот. Определение типа ви­руса осуществляется с помощью эндонуклеазного анализа ДНК. Другие методы диагностики папилломавирусной инфекции, такие как серологические и ПЦР, как правило, не используются, по­скольку они не исключают процент ложноположительных резуль­татов и не дают возможности определить тип вируса. Материалом для исследования являются мазки-соскобы, взятые со слизистой шейки матки.

Кандидоз

Принимая во внимание возможность кандидоносительства, ди­агноз кандидоза устанавливается при наличии клинических про­явлений заболевания и микроскопического выявления грибов рода Candida с преобладанием вегетирующих форм. Наиболее достовер­ным методом лабораторного исследования является культуральныи метод с количественным определением колоний грибов.

69

---------------------------------------         -        -------------------------------------------

Туберкулез

Основным методом диагностики туберкулеза является бактерио­логическое исследование, Традиционная микробиологическая диа­гностика туберкулеза с помощью посева на плотные яичные среды дает визуальный результат через 6-8 недель, а с учетом определе­ния лекарственной резистентности микобактерий туберкулеза — через 10-12 недель при наличии в посеянном материале не менее 100 жизнеспособных клеток.

В настоящее время разработаны полностью автоматизирован­ные системы для выявления микобактерий на жидких средах, что дает возможность получить результаты, начиная с четвертого дня после поступления диагностического материала. Приблизительно третья часть пациентов с бактериовыделением может быть выявле­на при первичной микроскопии окрашенного мазка мокроты.

Определение антител к возбудителю туберкулеза в сыворотке — новый и перспективный метод серологической диагностики этого заболевания. В пуле специфических антител при туберкулезе у взрослых обычно превалируют IgG. Реже подавляющая часть пула бывает представлена IgA. Антитела IgM у взрослых больных встре­чаются довольно редко и более характерны для начальных стадий заболевания. У детей высокие титры специфических антител IgA и IgM отмечаются гораздо чаще. Причем высокий уровень IgM иног­да может сохраняться длительное время и даже при относительно низких уровнях IgG- и IgA-антител.

Выводы

1.   По способности выявления возбудителя инфекции методы лабораторной диагностики могут быть разделены на две группы: прямые, позволяющие выявить в биологических жидкостях или тканях матери (плода) вирусы или микроорганизмы; непрямые, позволяющие зарегистрировать специфический иммунный ответ матери (плода) на возбудителей инфекции.

2.   К прямым методам относятся:

 

—  микроскопия (электронная или прямая — например, в тем­ном поле);

—  выявление вирусных или бактериальных антигенов (в т. ч. одноэтапными иммуноферментными и иммунохроматографичес-кими методами);

—  полимеразная цепная реакция (ПЦР);

—  культуральный метод.

70

—-----------------------------------         -        -------------------------------------------

3.    Лабораторная диагностика инфекции у беременной женщи­ны, как правило, базируется на данных серологических исследова­ний (сероконверсия специфических антител в сыворотке крови IgG и наличие IgM).

4.    У новорожденных выявление IgM-антител имеет диагности­ческое значение, так как материнские IgM, в отличие от IgG, не проникают через плаценту.

5.    Серологические обследования могут давать как ложнополо-жительные, так и ложноотрицательные результаты.

ЛИТЕРАТУРА

Адаскевич В.П. Заболевания, передаваемые половым путем. — Ви­тебск: Изд-во Витебского медицинского института, 1997. — 310 с.

Врожденные перинатальные и неонатальные инфекции / Пер. с англ.; Под ред. А. Гриноу, Дж. Осборна, Ш. Сазерленд. — М.: Медицина, 2000. — 288 с.

Кузьмин В.Н. Акушерская тактика у беременных с герпетической ин­фекцией. — М.: Информполиграф, 2000. — 31 с.

Кулаков В.И., Гуртовой Б.Л., Орджоникидзе Н.В., Тютюник В.Л. Цито-мегаловирусная инфекция в акушерстве. — М.: Гэотар-Мед, 2001. — 32 с.

Энциклопедия клинических лабораторных тестов / Пер. с англ.; Под ред. проф. Норберта У. Тица — М.: Лабинформ, 1997. — 942 с.

Obstetric and Gynecologic Infectious Disease / Joseph G. Pastorek. — New York: Raven Press, 1993. — 798 p.