Молекулярные основы тотипотентности генома ЭСК

Молекулярные основы тотипотентности генома ЭСК

Геном зиготы и ЭСК находится в так называемой "нулевой точке", откуда стартуют две главные программы эмбриогенеза:

2) рестрикционное созревание дифференцированных клеточных линий.

Эти две программы задействуют примерно 5000 генов эмбриогенеза. Каким образом реализуется тотипотентность генома, т.е. способность выбирать одну из многих траекторий развития? Серийный анализ генной экспрессии (SAGE) в культуре ЭСК, мезенхимальной, нейрональной и гематогенной стволовой клетки выявил важнейшую закономерность (Kelli D.L., Rizzino A, 2000; Xiong J.W., Battaglino R., Leahy A. et al.,1998). Во всех перечисленных стволовых клетках присутствовали сходные наборы предсинтезированных мРНК следующих классов генов (Рис 1-8).

Рис 1-8 Молекулярные основы тотипотентности стволовых клеток

2) набор мРНК гомеотических (Нох) генов, контролирующих сегментацию и трехмерную карту зародыша

3) пять наборов мРНК генов тотипотентности. Каждый набор факторов тотипотентности увязан с комплементарным набором факторов и рецепторов пролиферации на прогениторных клетках в клоне. Особенно существенны спаренные блоки генов, контролирующие пролиферацию соседних слоев прогениторных клеток в клоне (типа Delta/Notch)

4) мРНК генов апоптоза, контролирующие численность прогениторных клеток в клоне. Баланс клеток достигается за счет миграции и частичной гибели клеток в клоне. Пролиферация постоянно уравновешивается миграцией и апоптозом клеток.

5) набор мРНК контрольных генов (master genes) рестрикционного созревания специализированных клеточных линий (Terskykh A.,Easterday M., Linheng L. et al., 2001)

6) наборы мРНК генов миграции и навигации миграторных клеток

Таким образом, в основе тотипотентности ЭСК, МСК и других стволовых клеток выявлен универсальный механизм: направленная активация и последующий импорт мРНК в ядро. Детали импорта/экспорта информации между ядром и цитоплазмой в ЭСК плохо изучены. Эта концепция тотипотентности подтверждется новыми наблюдениями, выполненными на одиночных клонах мезенхимальных стволовых клеток специальной техникой MICRO-SAGE. Микрометод верифицировал присутствие мРНК 1200 ключевых генов эмбриогенеза в одном клоне МСК(Tremain N., Korkko J., Iberson D. еt al., 2001). Полученные данные поражают воображение. В клонах МСК из взрослой гематогенной ткани идентифицированы практически все наборы мРНК зародышевых листков, органогенеза, а также мРНК master-genes, контролирующих рестрикционное созревание линий мезенхимального, мезодермального происхождения, экто- и эндодермы. Клоны МСК по сути представляли собой библиотеки мРНК ранних этапов органогенеза и рестрикционного созревания специализированных линий. Если программы органогенеза обеспечивали направленный импорт мРНК в ядро для включения новых котранскриптаз, транскриптаз и транскрипционных комплексов, то рестрикционное созревание клеточных линий связано с экспортом мРНК из ядра в цитоплазму с последующей модификацией белкового фенотипа прогениторных клеток. В каждом клоне перераспределение мРНК между ядром и цитоплазмой составляет ключевую часть перестройки soft-сети. Репрограммирование генома плюрипотентных клеток наиболее эффективно изучают средствами протеомики. Тотальная реорганизация белковых сетей ЭСК, составляющих платформу hard-|software, по-видимому, содержит ключи к разгадке эпигенетических процессов у истоков развития (Guo X., Ying W., Wan J. еt al.,2001)

Мультипотентность МСК, выделенных из стромы гематогенной ткани взрослого человека, была верифицирована с помощью их трансплантации в пред- и постимплантационные зародыши овцы (Liechy K.W., MacKenzieT.C., Shaaban A.F. et al., 2000). Ростки трансплантированных МСК человека выявлялись как в плодах, новорожденных, так и в тканях животных через 1-1,5 лет после рождения. МСК человека преимущественно химеризовали хрящевую, жировую ткань, скелетные мышцы, сердце, строму гематогенной ткани и вилочковой железы. Часть донорских МСК накапливалась в виде перицитов в адвентиции аретриол и мелких венул (Flake A.W., 2001). По-видимому, сосудистая циркуляция играет незаменимую роль в миграции и диссеминации МСК в зародыше. Циркулирующие в крови МСК выявлялись в зародышах человека до 15 нед развития (Compagnoli C., Fisk N., Tocci A. etal, 1999). МСК человека активно химеризовали зародыш овцы, если донорские клетки вводили в амниотическую полость. МСК человека легко преодолевали гематоэнцефалический барьер и детектировались в в разных отделах мозга.

Особый интерес пересадки МСК привлекают в связи с проблемой иммунотолератности реципиентов – химер. Особое внимание уделялась химеризации донорскими МСК стромы тимуса реципиента. Стромальные клетки используют для локального подавления иммунного ответа (на уровне антиген-презентирующих клеток). Наиболее яркий практический пример – это добавление клеток Сертоли в клеточный нейтрансплантат для блокирования иммунного отторжения (Willing A.E., Cameron D., Sanberg P.R., 1998).

Рост клонов ЭСК в культуре зависит от состава среды, набора факторов пролиферации. Важно,что рост клонов не контролируется факторами мезенхимы, разобщен с работой Нох-генов и генов органогенеза, регулирующих численность клеток в растущем зародыше. Поэтому клоны ЭСК удается нелимитированнно размножать in vitro, чего не бывает в самом зародыше.

Особенности фенотипа ЭСК

В отличие от специализированных клеток ЭСК сохраняли уникальную потенцию наборами мРНК «ранних» генов эмбриогенеза. Редакторуя мРНК, ЭСК обходятся без многих блоков транссигнализации, которые используют дифференцированные клетки. ЭСК для контакта с микроокружением используют минимальное число рецепторов, сигнальных белков, транскриптаз хроматина . Между тем наборы " housekeeping genes", обслуживающих потоки энергии, веществ, метаболизм экспрессированы на уровне дифференцированных клеток. Второй важнейшей характеристикой незрелых ЭСК в культуре является высокий потенциал пролиферации. На поверхности пролиферирующих ЭСК экспонирован уникальный общий рецептор для LIF, SCF, IL-6 . Эта тройка сигналов через трансмембранную субъединицу GP-130 и соответственно Jak-Stat-3 транскрипционный комплекс процессирует сигналы в ядро, стимулируя вхождение G0 клеток в митоз. Схема событий между рецептором с ядром выглядят следующим образом. Высокоаффинное селективное связывание LIF, SCF, IL-6 с внешним рецептором активирует латентный фактор транскрипции Stat-3. Далее домен Stat-3 –SIE DNA binding –специфически взаимодействует с промотером c-fos на уровне ДНК хроматина (Рис 1-8). Примечательно, что активный Stat-3 не выявляли в эмбриобласте in situ. Активированный Stat-3 в комплексе с фактором тотипотентности Oct–4 запускал митозы и самообновление клонов ЭСК. Интенсивное самообновление ЭСК в культуре сопряжено с активацией тирозинфосфатазы SHP-2 Этот регуляторный фермент дефосфорилирует фосфотирозины разных белков (включая цитоплазматический сигнальный домен GP-130). Удаление фосфорных групп с тирозинов вызывает стойкую активацию проводящей субъединицы GP-130. Активация GP-130 стимулирует следующую киназу ERK (extracellular regulated kinase). SHP-2- зависимая активация ERK необходима в качестве кофактора для устойчивого самообновления ЭСК in vitro. Сохранение тотипотентности пролиферирующих мышиных линий ЭСК связано с присутствием в этих клетках дополнительного регуляторного белка Gab-1 - кофактора экспрессии главного белка тотипотентности Oct-4.

Похоже, что белок Oct4 выполняет разные функции в ранних зародышах млекопитающих. Избыток Oct4 в эмбриобласте и ЭСК блокирует развитие клеток трофобласта, поддерживая тотипотентность пролиферирующих незрелых клеток. С началом органогенеза Oct4 контролирует начало рестрикционного созревания многих клеточных линий. Oct4 необратимо исчезает в созревающих клетках. В неактивном виде Oct-4 выявлен о зрелых ооцитах, зиготе и эпибласте. В фетусе Oct-4 выявляется в половом бугорке и примордиальных половых клетках. Если в ЭСК увеличить экспрессию Oct-4, клетки спонтанно дифференцируются в эндодерму и мезодерму. Оказалось, что Oct-4 активирует одни, ингибируя другие гены в зародышевых тканях.

Бластоцисты мыши Oct4-/- останавливаются в развитии после имплантации. Такие аномальные зародыши преимущественно содержат клетки трофобласта, тогда как клетки эмбриобласта подвергаются гибели (Nicols J., ZevnikB., Anastassiadis K. Et al., 1998). Однако клетки трофобласта также вяло пролиферируют, поскольку в зародышах отсутствует FGF4 (индуктором экспрессии гена FGF4 является Oct4). Все зародыши-гетерозиготы Oct4-/+ проходят фазу имплантации без аномалий, поскольку 30-50% уровня Oct4 в эмбриобласте достаточно для его превращения в эпибласт и первичную полоску. Уровень Oct4 не влиял существенно на постимплантационную гибель зародышей.

Особую роль рецептор LIF/ GP-130 играет в задержке развития бластоцист у мышей, других грызунов на стадии диапаузы. Такие «законсервированные» на 3-4 нед бластоцисты, переживающие в полости матки, содержат зрелые клетки эпибласта вместо эмбриобласта. У зародышей с поврежденным GP-130 блокировано созревание эпибласта в диапаузных бластоцистах (Smith A.G., 2001)

Jak-Stat-3 "кабель" транссигнализации используется региональными гематогенными, мышечными стволовыми клетками для самообновления клеток клонов. LIF - рецептор ЭСК существенно влияет на выживание прогениторных клеток в культуре. Michel Revel из Вайссмановского института в Израиле показал, что прогениторные клетки в гематогенных клонах теряют способность формировать димерный вариант рецептора, который способен связывать IL-6. Такие клетки немедленно элиминируются из клона апоптозом. Если стволовые клетки трансфицировать генетической конструкцией, содержащей ген лиганда IL-6 и ген GP-130 рецептора, то трансфицированным клонам возвращается потенция к неограниченному самообновления с минимальным апоптозом. Такие клоны долгосрочно обновлялись in vitro и in vivo (Kollet O., Aviram R., Chebat J. et al., 1999).

Рис 1-9. Система сигнализации LIF-рецептора в клеточное ядро

На следующем этапе прогениторные клетки пролиферуют под контролем спаренных рецепторов Delta/Notch в комплексе с фактором тотипотентности- продукта семейства генов Hes (Hes7 в клонах мезодермы, сомитах и клонах миогенных стволовых клеток скелетных мышц). В клонах стволовых клетках ЦНС экспрессирована пара Нes1, Hes5, тогда как один Hes5 экспрессирован в клетках- предшественицах олигодендроцитов.

"Минимальный фенотип" ЭСК и примордиальных половых клеток (ППК) проявлялся ошаренной формой клеток из-за отсутствия цитоскелета, белков и рецепторов адгезии на поверхности плазматической мембраны, а также многих кофакторов сигнализации, вмонтированных в компоненты цитоскелета. ЭСК и ППК имели высокую активность теломеразы и щелочной фосфатазы. В отличие от региональных стволовых клеток ППК не имели на поверхности бета1-интегрина. ППК вступают в дифференцировку, формируя вторичные агрегаты клеток в суспензии (эмбриоидные тельца).

В последние годы бессмертные тотипотентные линии ЭСК были выделены из эмбрионов крыс, коровы, приматов, свиней. Показательно, что все ЭСК имели не только близкое строение, но и практически универсальный набор антигенов-маркеров, (SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-81, TRA-1-60). (Таблица 2)

Таблица 2. Сравнительные характеристики фенотипа ЭСК разных видов
Название маркёра	ЭСК/ППК/ТК Мыши	ЭСК приматов	ЭСК человека	ППК человека	ТК человека
SSEA-1	+	-	-	+	-
SSEA-3	-	+	+	+	+
SEA-4	-	+	+	+	+
TRA-1-60	-	+	+	+	+
TRA-1-81	-	+	+	+	+
Щелочная фосфатаза	+	+	+	+	+
Oct-4	+	+	+	Данные отсутствуют	+
Высокая активность теломеразы	+ ЭСК, ТК	Данные отсутствуют	+	Данные отсутствуют	+
Зависимость от фидера	ЭСК, ППК, некоторые ТК	Имеется	Имеется	Имеется	Небольшая, низкая клоногенность
Факторы, способствующие самообновлению стволовых клеток	LIF и другие факторы, действующие через gp130- рецептор, способны замещать фидер	Сокультивирование с фидерными клетками; другие факторы не выявлены	Фидерные клетки + сыворотка; фидер + бессывороточная среда + bFGF	LIF, bFGF, форсколин	Факторы не выявлены, утеря тотипотентности в пассажах
Характеристики роста in vitro	Округлой формы, многослойные агрегаты ЭТ	Агрегаты ЭТ уплощённой формы	Агрегаты ЭТ уплощённой формы	Округлой формы, многослойные агрегаты ЭТ	Агрегаты ЭТ уплощённой формы
Формирование тератом in vivo	+	+	+	-	+
Образование химер	+	Данные отсутствуют	+	-	+

Рис 1-8 Молекулярные основы тотипотентности стволовых клеток

ЭСК человека