содержание .. 6 7 8 9 ..

Цитогенетика эмбрионального развития - часть 8

Цитогенетика эмбрионального развития человека

визуализации определенного типа сегментации (см. Приложение).

В настоящее время разработано также множество методов, позволяю-

щих не только подробно изучить тонкую структуру отдельных районов

хромосом, но и получить информацию об их функциональной активно-

сти. Так, метод NOR-окраски с использованием азотнокислого серебра

позволяет судить о транскрипционной активности р-генов и степени

их функционирования, метод ник-трансляции in situ и использование

специфических антител — о функциональной активности некоторых

блоков генов (см. главу 10).

Протоколы получения различных типов дифференциальной ок-

раски (их световые и люминесцентные варианты), наиболее широко

используемые в практике, а также метода неизотопной гибридизации

ДНК–ДНК in situ (FISH) приведены в Приложении.

2.2. особенности кариотипа человека

Для характеристики кариотипа используют систематизированные

определенным образом видеоизображения гомологичных хромосом

всего хромосомного набора — кариограммы (рис. 2.1, б; 2.2, б), либо

схематичные изображения каждого гомолога — идеограммы (см. При-

ложение).

При кариотипировании обычно руководствуются критериями и

правилами, установленными Международным комитетом по стандар-

тизации цитогенетических исследований, последняя версия которых

опубликована в 2005 году [510]. Результатом хромосомного анализа

является описание кариотипа в виде формулы с указанием числа хро-

мосом, набора половых хромосом и хромосомных аберраций (если

они выявлены). Некоторые из символов и сокращений, принятых в

цитогенетике человека, приведены в приложении. Более подробно с

основными правилами международной цитогенетической номенклату-

ры, переведенными на русский язык, можно ознакомиться в изданиях

отечественных авторов [38, 124].

В норме кариотип человека содержит 46 хромосом. Такое диплоид-

ное (удвоенное) число возникает в результате объединения родитель-

ских гамет, каждая из которых содержит половинное, гаплоидное чис-

ло хромосом, равное 23. Таким образом, зародыш человека со стадии

зиготы имеет 23 пары хромосом, 22 из которых являются аутосомами

Глава 2.

Нормальный кариотип человека

и 1 пара — половыми хромосомами, или гоносомами (Х и Y). Наличие

двух половых Х-хромосом (кариотип 46,ХХ) соответствует женскому

полу, наличие Х- и Y-хромосом (кариотип 46,ХY) — мужскому.

Хромосомы отличаются между собой размерами, формой и строго

индивидуальным для каждой пары хромосом рисунком дифференци-

альной исчерченности.

Форма хромосомы определяется локализацией центромеры (пер-

вичной перетяжки) — участка хромосомы, входящего в состав кине-

тохора, к которому прикрепляются микротрубочки веретена деления

(митотического или мейотического). В зависимости от центромерного

индекса, то есть соотношения короткого плеча к длине всей хромосо-

мы, хромосомы человека подразделяются на три группы — метацен-

трические (размеры короткого (p) и длинного (q) плеч практически

одинаковы), субметацентрические (центромерный индекс 26–46

и акроцентрические (центромерный индекс 15–30

%). Особенностью

коротких плеч всех акроцентрических аутосом человека является на-

личие спутничных нитей и спутников.

Согласно Международной номенклатуре хромосом человека (ISCN),

аутосомы человека пронумерованы в порядке уменьшения их разме-

ров (от 1 до 22) и подразделены на 7 групп (от А до G):

группа А (1–3) — большие метацентрические хромосомы 1, 3 и

субметацентрическая хромосома 2;

группа В (4 и 5) — большие субметацентрические хромосомы;

группа С (аутосомы 6–12 и половая Х-хромосома) — средние суб-

метацентрические хромосомы;

группа D (13–15) — большие акроцентрические хромосомы;

группа Е (16–18) — малые субметацентрические хромосомы;

группа F (19–20) — малые метацентрические хромосомы;

группа G (21–22) — малые акроцентрические хромосомы.

Y-хромосома относится к акроцентрическим, однако в отличие от

5 пар акроцентрических аутосом ее короткое плечо не содержит спут-

ничных нитей и спутников, а размеры длинного плеча варьируют от

хромосом группы G до группы D.

Хромосомы человека состоят из линейно расположенных участ-

ков (сегментов, блоков, англ. — band), отличающихся по структур-

ным характеристикам и молекулярной композиции. Свойственная

Цитогенетика эмбрионального развития человека

всем хромосомам блочная организация выявляется при использова-

нии различных методов дифференциального окрашивания. Центромер-

ные районы (С-сегменты) являются обязательным структурным компо-

нентом любой хромосомы в кариотипе человека. Однако по величине

С-блоков наблюдается выраженный межиндивидуальный полиморфизм,

обусловленный различными размерами прицентромерных областей.

С-полиморфизм наиболее характерен для прицентромерных районов

длинных плеч хромосом 1, 9, 16 и коротких плеч хромосом 15 и 22,

а также для варьирующего по величине дистального участка длинного

плеча Y-хромосомы. В состав С-сегментов входят простые и более слож-

ные нуклеотидные повторы сателлитной ДНК. Каждой паре хромосом

человека свойственна своя, присущая только ей альфоидная ДНК, со

своим типом тандемных повторов. На основе альфоидных ДНК были

созданы и получили широкое применение в цитогенетике хромосом-

специфические ДНК-зонды, позволяющие вести подсчет индивидуаль-

ных хромосом и идентифицировать центромерные районы гомологов не

только в метафазных, но и в интерфазных клетках.

Другим важным структурным компонентом каждой хромосомы

являются теломеры — концевые участки хромосом, которыми в ин-

терфазном ядре хромосомы прикрепляются к внутренней ядерной

мембране. Теломерные районы (Tel-блоки) всех хромосом образованы

многократно повторенными (несколько тысяч раз) простыми шести-

нуклеотидными фрагментами (TTAGGG).

Плечи хромосом проявляют характерный для каждой пары хромо-

сом рисунок из чередующихся темных (ярких) и светлых (тусклых)

полос. Выявляющиеся участки хромосом обозначаются в зависимости

от типа окраски Q-, G- и R-сегментами, а поперечная исчерченность

хромосом — соответственно Q-, G- и R-рисунком. Q- и G-рисунки

идентичны, R-рисунок (reverse) им комплементарен.

)-сегменты обогащены АТ-нуклеотидами и содержат сравни-

тельно мало генов. По некоторым данным, в этих сегментах преиму-

щественно находятся гены, ответственные за тканевую (терминаль-

ную) дифференцировку клеток (см. главу 11).

R-сегменты обогащены CG-парами оснований ДНК. В них сосре-

доточено основное число генов, в том числе генов «домашнего хозяй-

ства» (housekeeping genes), продукты которых обеспечивают жизне-

способность клеток (дыхание, энергетический обмен и др.). В одном

Глава 2.

Нормальный кариотип человека

сегменте, выявляемом при окраске прометафазных хромосом, содер-

жится в среднем около 1 млн пар нуклеотидов, что примерно соответ-

ствует 10–15 генам (см. главу 11).

Согласно номенклатуре [510], каждая хромосома человека подразде-

ляется на районы, границами которых являются регулярно наблюдаемые

морфологические маркеры. В свою очередь, районы подразделяются на

сегменты, заметно отличающиеся от соседних по интенсивности окраски.

Нумерация всех сегментов начинается от центромеры к теломере отде-

льно для каждого плеча хромосомы. Запись индивидуального сегмента

включает информацию о хромосоме, плече и районе, в котором он нахо-

дится. На менее спирализованных хромосомах сегменты могут подраз-

делиться на несколько частей — субсегментов, для обозначения которых

вводятся новые ряды цифр. Например, запись 7q21.1 обозначает субсег-

мент 1 первого сегмента в районе 2 длинного плеча хромосомы 7. Число и

расположение сегментов строго специфично для каждой пары гомологов,

что позволяет не только проводить их точную идентификацию, но и ши-

роко использовать при анализе структурных хромосомных перестроек.

В приложении приведены стандартные идеограммы хромосом человека

для пяти уровней разрешения — 300, 400, 550, 700 и 850 сегментов на

гаплоидный геном.

Структурными компонентами коротких плеч пяти пар акроцентри-

ческих аутосом в кариотипе человека являются спутники (s) и спут-

ничные нити (stk) (англ. satellites и satellite stalks соответственно). Ва-

рьирующая в широких пределах величина спутников, а также длина и

толщина спутничных нитей приводят к выраженному гетероморфизму

гомологов хромосом групп D и G. Среди полиморфных вариантов

встречаются также хромосомы с двойными спутниками и двойны-

ми ядрышкообразующими районами (ЯОР). Спутники представле-

ны сатДНК. Спутничные нити (вторичные перетяжки), являясь по

существу ядрышкообразующими районами, обозначаются N- или

Ag-NOR блоками. В ЯОР локализованы многократно повторяющи-

еся кластеры рибосомных генов. Каждая акроцентрическая хромо-

сома содержит различное число р-генов. Наряду со спутниками и

спутничными нитями неравномерное распределение копий генов

рРНК, а также различный уровень их экспрессии лежат в основе

структурного и функционального полиморфизма индивидуальных

ЯОР (см. главу 10).

Цитогенетика эмбрионального развития человека

2.3. Полиморфизм хромосом человека

Хромосомный полиморфизм является одной из отличительных

особенностей кариотипа человека. Под полиморфизмом понимают

нормальную изменчивость хромосом набора, которая заключается

в различиях между гомологичными хромосомами (гетероморфизм)

по отдельным сегментам, районам и даже целым плечам. К поли-

морфным вариантам относят такие изменения хромосом, которые

сохраняются в процессе онтогенеза, стабильно наследуются при

митотическом делении клетки и передаются как простой менделев-

ский признак от родителей к детям, не оказывая влияния на фено-

тип. Существование различных вариантов характерно практически

для каждой хромосомы человека, а неограниченное число сочета-

ний таких вариантов приводит к уникальности кариотипа каждого

человека, за исключением монозиготных близнецов.

Полиморфизм хромосом у человека крайне богат по своим

проявлениям. Правила кариотипирования предусматривают учет

полиморф ных вариантов хромосом с помощью специальной систе-

мы символов (табл. 2.1). Как уже упоминалось, в широких пределах

варьируют размеры С-блоков, особенно на хромосомах 1, 9, 15, 16,

19, 22 и Y. В популяции широко представлены варианты хромосом

9 и особенно 19, различия между которыми обусловлены не только

размерами, но и расположением прицентромерного гетерохромати-

на — на длинном или коротком плече хромосомы, или одновременно

на коротком и длинном плечах. Гетерохроматиновые блоки легко ви-

зуализируются практически при любом способе окраски хромосом,

однако наиболее четко — при специальных методах (CBG и DA/

DAPI). Иногда гетерогенность прицентромерных районов, напри-

мер, на хромосомах 3 и 4, выявляется лишь при люминесцентных

вариантах окрашивания (QFQ, QFH, DAPI). Некоторые варианты

хромосом, в частности, 17ps, наблюда емые на окрашенных красите-

лем Гимза препаратах, не будут зарегистрированы при окрашивании

флуорохромами. Подробная информация о полиморфизме хромо-

сом представлена в книге А. А. Прокофьевой-Бельговской [158], а

также в прекрасно иллюстрированном атласе хромосом человека

[64], которые с момента издания являются настольной книгой всех

цитогенетиков человека.

Глава 2.

Нормальный кариотип человека

1. Полиморфные размеры гетерохроматиновых сегментов, спутничных

нитей и спутников

9qh +

Увеличенный гетерохроматиновый блок на длинном

плече хромосомы 9

Yqh-

Уменьшенный гетерохроматиновый блок на длинном

плече Y-хромосомы

21ps +

Увеличенные спутники на коротком плече

хромосомы 21

22pstk +

Удлиненные спутничные нити на коротком плече

хромосомы 22

15cenh +

Увеличенный блок прицентромерного

гетерохроматина на хромосоме 15

1qh-, 13cenh + , 22ps +

Уменьшенный гетерохроматиновый блок на

хромосоме 1, увеличенный прицентромерный

гетерохроматин на хромосоме 13 и увеличенные

спутники на коротком плече хромосомы 22

15cenh + mat, 15s + pat

Увеличенный прицентромерный гетерохроматиновый

блок на хромосоме 15, унаследованной от матери,

и увеличенные спутники на хромосоме 15,

унаследованной от отца

14cenh + pstk + ps +

Увеличенный блок прицентромерного

гетерохроматина, длинные спутничные нити и

увеличенные спутники на коротком плече

хромосомы 14

2. Полиморфная локализация гетерохроматиновых сегментов, спутничных

нитей и спутников

17ps

Спутники локализованы на коротком плече

хромосомы 17

Yqs

Спутники локализованы на длинном плече

Y-хромосомы

9qhph

Локализация прицентромерного гетерохроматинового

блока на коротком и длинном плечах хромосомы 9

9ph

Гетерохроматиновый блок присутствует только на

коротком плече хромосомы 9

1q41

Гетерохроматиновый блок локализован в

сегменте 1q41

3. Полиморфизм числа спутников и спутничных нитей

21pss

Двойные спутники на коротком плече хромосомы 21

14pstkstk

Двойные спутничные нити на коротком плече

хромосомы 14

Таблица 2.1. Перечень символов, употребляемых при описании полиморфных вариан-

тов хромосом человека [510]

Цитогенетика эмбрионального развития человека

Несмотря на многочисленные попытки определить влияние тех

или иных вариантов хромосом на фенотипические или клинические

особенности их носителей, вопрос о функциональном значении хро-

мосомного полиморфизма по-прежнему далек от своего разрешения.

Устоявшимся с 1970-х годов в клинической генетике является мнение,

что гетероморфизм гомологов по районам 1qh, 9qh (в большей степе-

ни 9ph), 16qh и некоторые варианты Yqh могут негативно влиять на ре-

продуктивную функцию, а вариант Yqh + сопровождается и психоэмо-

циональными особенностями поведения [117, 134, 150]. Механизмы

этого влияния по-прежнему остаются на уровне гипотез. Результаты

многочисленных исследований на эту тему столь противоречивы, что

признать ассоциацию определенного полиморфного варианта хро-

мосомы с какой-либо фенотипической или клинической особеннос-

тью организма не представляется возможным. Справедливости ради

следует отметить, что исключительное большинство этих популяцион-

ных исследований проведено в постнатальном периоде онтогенеза че-

ловека, а выводы о повышенном риске невынашивания беременности

при наличии выраженного гетероморфизма у носителей или пороков

развития у их потомков основаны исключительно на анамнестиче-

ских данных. Что касается корреляций между хромосомным поли-

морфизмом и особенностями внутриутробного развития человека, то

единичные исследования медицинских и спонтанных абортусов [117]

вряд ли можно признать достаточными для доказательства влияния

столь изменчивых районов гетерохроматина и/или ядрышковых орга-

низаторов на жизнеспособность эмбриона или, к примеру, их влияния

на органогенез. Очевидно, что полученные данные не позволяют как

однозначно принять мнение о нейтральности структурного и функцио-

нального полиморфизма хромосом, так и согласиться с его вкладом

в те или иные патологические состояния на любом этапе онтогенеза

человека.

К сожалению, расшифровка генома человека не приблизила нас к

пониманию значения различного числа копий повторяющейся ДНК,

из которой, в основном, состоят полиморфные гетерохроматиновые

участ ки хромосом, в норме и при патологии. К обсуждению фундамен-

тальных и прикладных проблем, имеющих отношение к этим загадоч-

ным участкам генома человека, мы вернемся в главах 6,9–11.

Глава 2.

Нормальный кариотип человека

Особое место среди полиморфных вариантов хромосом занимают

хромосомы групп D и G. Помимо вариабельных по размеру прицен-

тромерных блоков, их короткие плечи отличаются разнообразием по

числу и размерам спутников. Для этих ядрышкообразующих хромосом

характерен не только структурный, но и функциональный полимор-

физм, регистрируемый с помощью окраски азотнокислым серебром.

Подробно молекулярные основы полиморфизма районов ядрышковых

организаторов и его роль в нормальном и патологическом эмбриогене-

зе человека рассмотрены нами в главе 10.

2.4. Краткая характеристика молекулярной

гетерогенности сегментов хромосом человека

В отличие от безуспешных попыток понять фенотипические прояв-

ления полиморфизма хромосом, молекулярная природа вариабельных

участков достаточно хорошо изучена. Главное, что отличает различные

сегменты хромосом — это богатая по проявлениям неоднородность их

структурной и функциональной организации (табл. 2.2).

Так, общим феноменом является наличие в каждой хромосоме двух

типов хроматина — эухроматина и гетерохроматина.

В отличие от гетерохроматина, структурно-функциональные свой-

ства эухроматиновых районов более или менее изучены. По крайней

мере, нуклеотидная последовательность молекулы ДНК эухромати-

новой части генома человека практически полностью расшифрована

[315]. Установлено, что эухроматин состоит из однокопийных после-

довательностей ДНК и содержит большую часть структурных генов

[203]. Эухроматин деконденсирован в метаболически активном интер-

фазном ядре и реплицируется в течение всего периода фазы синтеза,

что свидетельствует о его активном участии в процессе транскрипции.

Вместе с тем, относящиеся к эухроматину R-и G-сегменты отличаются

по насыщенности генами и их специфичности, нуклеотидному соста-

ву, конформации, времени репликации (подробнее см. главу 10).

В эухроматине выявлено несколько различных фракций ДНК длиной

около 300 т. п. н., названных изохорами [252]. Изохоры различаются по

процентному содержанию GC-пар: L — легкие изохоры с низким содер-

жанием GС-пар; Н1, Н2, Н3 — тяжелые изохоры, богатые GC-парами.

Изохоры распределены в хромосомах неслучайным образом. Так, легкие

содержание .. 6 7 8 9 ..