Цитогенетика эмбрионального развития - часть 2

12

2. МеТОДЫ АНАлИЗА НеОКРАшеННЫХ И РАВНОМеРНО

ОКРАшеННЫХ ХРОМОСОМ ....................................................................497

2.1. Фазово-контрастная микроскопия ......................................................497

2.2. Рутинная окраска хромосом ..................................................................497

3. МеТОДЫ ДИФФеРеНЦИАлЬНОй ОКРАСКИ ХРОМОСОМ.......498

3.1. Методы G-окраски хромосом ................................................................498

3.2. Методы R-окраски хромосом (RHG, RFA) ........................................ 500

3.3. Методы Q-окраски хромосом (QFQ, QFH) .........................................501

3.4. Методы избирательной окраски гетерохроматиновых

районов хромосом ........................................................................................... 504

4. СПеЦИАлЬНЫе МеТОДЫ ЦИТОГеНеТИЧеСКОГО 

АНАлИЗА .........................................................................................................506

4.1. Репликационные варианты G- и R-дифференциального

окрашивания хромосом .................................................................................507

4.2. Методы выявления ломкой Х-хромосомы .........................................511

5. ФлУОРеСЦеНТНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ in situ (FISH ) ..............510

5.1. ДНК-зонды .................................................................................................512

5.2. Приготовление препаратов хромосом и интерфазных ядер ..........517

5.3. Предгибридизационная обработка препаратов ................................520

5.4. Гибридизация in situ ................................................................................523

6. МеТОДЫ ИССлеДОВАНИЯ ФУНКЦИОНАлЬНОГО

СОСТОЯНИ Я ХРОМОСОМНЫХ РАйОНОВ ........................................533

6.1. Ag-окраска активных ядрышкообразующих районов хромосом ......533

6.2. Выявление районов, обогащенных метилцитозином ......................535

7. ПРОПИСИ БУФеРНЫХ РАСТВОРОВ

ДлЯ ЦИТОГеНеТИЧеСКИХ ИССлеДОВАНИй ................................538

7.1. Cтандартный фосфатный буфер Соренсена (рН 6,8) ........................538

7.2. Буферный раствор GKN, pH 7,8 (10-кратный) ..................................538

7.3. Буферный раствор SKN, pH 7,8 .............................................................538

7.4. Буферные растворы SSC .........................................................................539

7.5. Раствор версена .........................................................................................539

7.6. Na-фосфатный буфер (0,01 М) ...............................................................539

7.7. Насыщенный солевой буферный раствор Дюльбекко, рН 7,2 ....... 540

7.8. Цитратно-фосфатный буфер Мак-Ильвейна .................................... 540

Таблица 1. Характеристика методов дифференциального окрашивания 

хромосом, часто используемых в цитогенетике человека ............................541

Таблица 2. Сокращения при описании хромосом и 

хромосомных аномалий ..........................................................................................543

Рис.1. Идиограммы G-сегментации хромосом человека для уровней 

разрешения – 300, 400, 550, 700 и 850 сегментов на гаплоидный геном ...546

лИТеРАТУРА ..................................................................................................565

ПРеДМеТНЫй УКАЗАТелЬ .....................................................................611

Предисловие

подчеркнуть своевременность ее опубликования.

Закономерности  эмбрионального  развития  человека 

в  последние  годы  все  больше  и  больше  подвергаются 

тонкому генетическому анализу. Выявлены многие гене-

тические механизмы регуляции ранних этапов эмбриоге-

неза. Продолжаются интенсивные поиски транскрипци-

онных факторов, определяющих развитие определенных 

структур «в нужном месте и в нужное время».

Регуляция  эмбриогенеза  —  сложнейший  процесс. 

Расшифровка  его  осуществляется  на  генном,  хромо-

сомном и клеточном уровнях. Хромосомный уровень 

изучения  эмбриогенеза  —  назовем  его  цитогенети-

кой онтогенеза — мало освещен и в зарубежной, и в 

отечественной  литературе.  В  содержательной  книге 

С. А. Назаренко «Изменчивость хромосом и развитие 

человека» (Томск, 1993) были отражены лишь некото-

рые стороны цитогенетики эмбрионального развития. 

Пробел в этом важном разделе современной медицины 

и биологии восполняет настоящая монография.

Авторы  книги  хорошо  известны  по  многим  пер-

воклассным  публикациям,  и  неудивительно,  что  они 

написали  хорошую  книгу,  в  которой  отражен  собст-

венный большой опыт по цитогенетическим исследо-

ваниям эмбрионов и плодов (более 8000) наряду с глу-

боким  анализом  литературы.  Мне  приятно  отметить 

глубокое  уважение  авторов  к  отечественным  школам 

14

эмбриологов (П. Г. Светлов, А. Г. Кнорре, А. П. Дыбан) и цитогенети-

ков (А. А. Прокофьева-Бельговская, А. Ф. Захаров, С. А. Назаренко).

Положительным  моментом  книги  является  обстоятельная  обще-

эмбриологическая  информация,  которой  так  недостаточно  в  нашей 

литературе.  В  ней  подробно  в  доступной  форме  изложены  основы 

проэмбрионального  и  эмбрионального  развития  человека.  Сведения 

о нормальном кариотипе человека, механизмах возникновения хромо-

сомных и геномных мутаций, фенотипах эмбрионов с хромосомными 

аномалиями преломляются под углом зрения практической значимос-

ти. Рассмотрена природа хромосомных аномалий в онтогенезе прена-

тального периода, что очень важно для практических целей диагности-

ки и профилактики наследственных болезней. Цитогенетика гамето- и 

эмбриогенеза изложена с учетом современных генетических достиже-

ний и методических возможностей (выявление мозаицизма, имприн-

тинга, однородительских дисомий, эпигенетической регуляции и др.).

Большое место в книге занимают вопросы пренатальной диагнос-

тики. Авторы сделали большой вклад в развитие этого раздела меди-

ко-генетической помощи в нашей стране. Изложенный ими опыт ци-

тогенетической пренатальной диагностики полезен для практических 

врачей-цитогенетиков, и в то же время — это современное пособие для 

изучающих  процессы  онтогенеза  человека  в  пренатальном  периоде. 

Для научных сотрудников очень важна глава «Горизонты цитогенетики 

эмбрионального развития человека».

введеНие

Нарушениям  наследственного  аппарата  принадлежит  важное  место  

в патологии человека. Мужская и женская стерильность, самопроизволь-

ные аборты, рождение детей с тяжелыми аномалиями развития, многие 

патологические состояния постнатального периода, в том числе и хро-

мосомные болезни, обусловлены поломками генома. По весьма прибли-

зительным оценкам общий генетический груз в популяции оценивается 

величиной в 5–5,5 %, из которого только на долю новорожденных прихо-

дится около 1,5 % [31]. При этом значительная часть нарушений онтоге-

неза связана с численными или структурными аберрациями всего генома 

или отдельных хромосом, и может быть выявлена цитогенетическими ме-

тодами путем анализа кариотипа гамет или клеток зародыша.

Таким образом, цитогенетические исследования играют важную роль 

в диагностике многих патологических состояний на разных стадиях он-

тогенеза человека. Их значение особенно велико, если исследования ка-

риотипа проводятся еще до рождения, то есть в течение антенатального 

периода развития человека. Именно тогда хромосомные болезни можно 

не только диагностировать, но и предупредить путем элиминации плодов  

с  нарушениями  кариотипа.  Профилактика  рождения  детей  с  хромосом-

ными болезнями составляет главную задачу такого сравнительно нового 

научно-практического  направления  как  пренатальная  диагностика.  На 

каких стадиях онтогенеза происходят поломки наследственного аппарата 

зародыша? Как они реализуются в фенотипе? Как они могут быть выявле-

ны еще до рождения? Что такое хромосомный мозаицизм, ограниченный 

плацентой и представляет ли он угрозу для плода? Ответы на эти и другие 

практической вопросы пренатальной диагностики можно найти в первых 

5 главах монографии.

Вместе с тем, исследования по цитогенетике эмбрионального раз-

вития человека отнюдь не исчерпываются решением практических за-

дач пренатальной диагностики. По твердому убеждению авторов, уже 

16

существующие  сегодня  возможности  прижизненного  исследования 

плодного материала на всех стадиях эмбрионального развития откры-

вает реальные перспективы исследования функции генома в течение 

всего  внутриутробного  периода  развития  человека.  Это  позволяет 

непосредственно на человеке начать исследования центральной про-

блемы современной биологии — проблемы реализации генетической 

информации в индивидуальном развитии. Важная роль в таких иссле-

дованиях,  безусловно,  принадлежит  цитогенетике  развития,  изучаю-

щей функции отдельных хромосом и их фрагментов в условиях хро-

мосомного дисбаланса. Впервые на млекопитающих такой подход был 

использован в модельных экспериментах на мышах с хромосомными 

транслокациями [11, 56, 380].

К сожалению, применение цитогенетических методов в исследова-

нии эмбриогенеза человека до появления пренатальной диагностики 

было  значительно  менее  продуктивным.  Выполненные  на  абортном 

материале с применением методов клеточных культур, они были весь-

ма  продуктивными  только  при  исследовании  цитологических  фено-

менов  хромосомного  дисбаланса  (гипотеза  «клеточного  синдрома») 

[47,  93,  96].  Они,  однако,  оказались  малопригодными  для  суждения  

о хромосомном контроле гаметогенеза и эмбриогенеза человека. И это 

понятно. Исследования кариотипов абортусов, представлявших собой 

мацерированные  ткани  или  остатки  абортивного  плодного  яйца,  не 

позволяли объективно судить о том, как дисбаланс той или иной хро-

мосомы или ее фрагментов мог влиять на процессы развития.

Ситуация коренным образом изменилась только в 80-х годах ХХ 

века, когда благодаря успехам ультразвуковой диагностики и про-

грессу  в  технике  забора  плодного  материала,  появилась  реальная 

возможность  прижизненного  кариотипирования  плода  [391,  427, 

694]. Масштабные цитогенетические исследования плодов в Санкт-

Петербурге были начаты в 1987 году, когда в Институте акушерства 

и  гинекологии  им.  Д.  О.  Отта  РАМН  была  организована  Лабора-

тория  пренатальной  диагностики  наследственных  и  врожденных 

болезней [15, 17]. К настоящему времени в этой лаборатории ком-

плексное цитогенетическое исследование проведено на более 8000 

плодах разных стадий развития. 

Становление и развитие пренатальной диагностики совпало с по-

явлением и бурным развитием методов экстракорпорального оплодо-

17

творения (ЭКО), позволяющих путем трансплантации в матку оплодо-

творенных in vitro яйцеклеток, решать проблему бесплодия, связанно-

го с непроходимостью маточных труб и с другими причинами [873]. 

Появление новых молекулярно-цитогенетических методов (например, 

метод FISH), а также точных методов ДНК-диагностики сделали воз-

можным пренатальную диагностику генных и хромосомных болезней 

уже на ранних доимплантационных стадиях развития и даже на уровне 

гамет (ооцитов). 

Таким  образом,  уже  к  концу  ХХ-го  века  практически  все  стадии 

раннего развития человека, включая гаметогенез, а также до- и пост-

имплантационный эмбриогенез, стали доступными для лабораторных 

исследований непосредственно на материале зародыша. 

Важно  отметить,  что  возможность  прижизненного  исследования 

плода человека на всех стадиях развития практически совпала во вре-

мени  с  триумфальными  достижениями  Международной  Программы 

«Геном  человека»  [316].  Полная  расшифровка  первичной  структуры 

всего  генома  в  апреле  2003 года  установление  точной  нуклеотидной 

последовательности  всех  23  пар  хромосом;  разработка  технологии 

одновременной  регистрации  экспрессионных  профилей  многих  ты-

сяч генов [865]; возможность визуализации работ отдельных генов и 

генных кластеров в интерфазном ядре [562], развитие представлений 

биоинформатики о «генных сетях», обеспечивающих координирован-

ную  работу  генных  ансамблей  в  процессах  морфогенеза  [41]  —  все 

эти  фундаментальные  достижения  составляют  основу  нового  напра-

вления — функциональной геномики [79]. Они открывают принципи-

ально новые, недостижимые ранее, возможности и для цитогенетики 

развития человека. В первую очередь, это касается проблемы струк-

турно-функциональной организации хромосом.

Таким образом, достижения фундаментальных наук в изучении генома 

человека и успехи клинической медицины в области пренатальной диа-

гностики  предопределили  возросший  интерес  к  цитогенетике  развития 

человека, сделали весьма актуальным изучение особенностей гаметоге-

неза и ранних стадий эмбриогенеза человека при помощи традиционных 

и современных нетрадиционных методов хромосомного анализа. 

Некоторые данные об особенности структурно-функциональной орга-

низации хромосом на разных стадиях эмбриогенеза человека приведены 

в главе 10.

введение

18

В заключительной главе книги (глава 11) суммированы взгляды ав-

торов на перспективы дальнейших исследований в области пренаталь-

ной диагностики и в плане изучения функции генома и его отдельных 

элементов (хромосом) на разных стадиях гаметогенеза и эмбриогенеза 

человека.

Кроме того, нам казалось целесообразным дополнить теоретические 

данные и практические результаты собственных исследований методами 

приготовления хромосомных препаратов из тканей зародышей человека 

на разных стадиях развития. 

Данная книга является первой монографией, посвященной проблемам 

цитогенетики эмбрионального развития человека. Авторы вполне отдают 

себе отчет в том, что это, безусловно, в высшей степени прогрессивное 

направление  функциональной  геномики  делает  только  первые  шаги,  и 

многие  актуальные  вопросы  структурно-функциональной  организа-

ции хромосом пока остаются без ответа. Естественно, это не относится  

к проблемам пренатальной диагностики, где практически все проблемы 

уже  решены.  В  этом  плане  практические  аспекты  цитогенетики  разви-

тия  значительно  опережают  теоретические  фундаментальные  аспекты 

индивидуального  развития.  Однако  нет  сомнения  в  том,  что  дальней-

шие углубленные исследования в этом направлении позволят получить 

принци пиально новую информацию о структурно-функциональных осо-

бенностях генома человека. Такая информация будет иметь большое тео-

ретическое, и несомненное практическое значение не только для ранней 

диагностики, но и для лечения наследственных болезней.

Авторы сочтут свою задачу выполненной, если эта книга послужит 

руководством не только для врачей-цитогенетиков, занимающихся вопро-

сами пренатальной диагностики, но и привлечет к себе внимание специа-

листов по цитогенетике и генетике человека, интересующихся проблема-

ми онтогенеза, а также студентов мединститутов и биофаков, понимаю-

щих необходимость и перспективность внедрения достижений генетики 

в современную медицину и биологию.

Считаем  приятным  долгом  выразить  глубокую  признательность 

всем  сотрудникам  Лаборатории  пренатальной  диагностики  наследс-

твенных и врожденных заболеваний ГУ НИИАГ им. Д. О. Отта РАМН 

за неизменную помощь в работе над монографией. Мы особенно бла-

годарны сотрудникам цитогенетической группы этой лаборатории.

ГлАвА 1 

осНовЫ ПроЭМБриоНАлЬНоГо 

и ЭМБриоНАлЬНоГо рАЗвиТиЯ ЧеловеКА

введение

Исследования  по  цитогенетике  эмбрионального  развития  челове-

ка, а также грамотное применение всего комплекса методов, связан-

ных с пренатальной диагностикой хромосомных болезней (получение 

материала, цитогенетический анализ, молекулярно-цитогенетические 

исследования  и  пр.),  предусматривают  достаточную  компетентность 

ученого и врача-генетика в вопросах антенатального развития челове-

ка. Такая информация особенно существенна для понимания тех этапов 

онтогенеза,  когда  происходят  нарушения  кариотипа,  реализующиеся 

во время развития плода и в постнатальном периоде. Она, несомненно, 

важна и для понимания патогенетических механизмов возникновения 

хромосомных аномалий и врожденных пороков развития, выявляемых 

у развивающегося зародыша.

Общая продолжительность внутриутробного развития человека со-

ставляет в среднем около 280 дней и равна примерно 1

 

% его средней 

продолжительности жизни. Существует несколько различных класси-

фикаций периодов антенатального развития человека [26, 56, 80, 383, 

694]. Согласно ставшей классической классификации Института Кар-

неги (США), основанной на уникальной коллекции зародышей чело-

века  разных  стадий,  эмбриогенез  человека  подразделяют  на  стадии,  

которые  обозначают  по  имени  автора  коллекции  как  «горизонты 

Стритера» [75, 159]. Эти горизонты, основанные на гистологическом 

описании уникальных находок, до имплантации обозначают арабски-

ми, а после имплантации — римскими цифрами. Всего выделяют 23 

горизонта [524]. При этом первые 8 горизонтов (с 1-го по 20-й д. р.)