содержание .. 48 49 50 51 ..
ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 50
Для животных, производящих продукты питания, исследования включают
измерение ректальной температуры у достаточного количества животных до и после
вакцинации; для других животных такие измерения проводятся, если лабораторные
исследования указывают на вероятность наличия проблемы. Необходимо
записывать размер и продолжительность любых местных реакций и количество
животных, у которых возникли местные или соматические реакции. Если это
уместно, проводятся измерения характеристик животных.
В. ЭКОТОКСИЧНОСТЬ
Необходимо проводить оценку возможного вредного воздействия вакцины на
окружающую среду и выявлять необходимость каких-либо предупредительных мер
для уменьшения такого риска. Следует провести оценку вероятной степени
воздействия вакцины на окружающую среду с учетом: вида, для которого
предназначена вакцина, и способа ее применения; выведения продукции;
утилизации неиспользованной вакцины. Если эти факторы указывают на то, что на
окружающую среду будет оказано значительное воздействие со стороны продукции,
проводится оценка потенциальной экотоксичности с учетом свойств вакцины,
выявленных, например, в ходе тестов, описанных в данном разделе.
5.2.7. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИН
Во время разработки вакцины проводятся тесты, направленные на
подтверждение того, что вакцина является эффективной при применении каждым из
рекомендованных способов и методов вакцинации с использованием
рекомендованного графика для каждого вида и категории животных, для которых
предназначена данная вакцина. Тип тестов на эффективность, которые будут
проводиться, будет значительно варьироваться в зависимости от конкретного типа
вакцины.
В качестве части тестов, выполняемых во время разработки вакцины для
определения эффективности, или в дополнение к ним возможно проведение тестов,
приведенных в разделе «Производство» соответствующей монографии; необходимо
учитывать следующее.
Доза, которая будет использоваться, представляет собой количество
продукта, рекомендуемое к применению и содержащее минимальный титр или
мощность, ожидаемый в конце срока годности.
Для производства живых вакцин используется вакцина, приготовленная из
наиболее ослабленного цикла, который будет участвовать в производстве.
Все заявления об эффективности должны подтверждаться доказательствами.
Например, утверждение о том, что вакцина защищает от респираторных
заболеваний, должно подкрепляться как минимум доказательством защиты от
клинических проявлений респираторных заболеваний. Если о вакцине заявляется,
что она защищает от инфекций, это должно быть доказано с использованием
методов реизоляции. Если таких утверждений несколько, для каждого из них
требуется подкрепляющее доказательство.
Необходимо провести адекватную оценку влияния пассивно приобретенных
антител или антител материнского происхождения на эффективность вакцины. Все
утверждения, выраженные или подразумеваемые, касающиеся начала и
продолжительности защиты, должны подкрепляться данными испытаний.
Эффективность каждой из составляющих многовалентных и комбинированных
продуктов должна демонстрироваться с использованием комбинированной вакцины.
Если рекомендуется одновременное применение вакцин или оно входит в
обычный график вакцинации, необходимо провести исследования иммунологической
совместимости. Если продукт рекомендуют применять в качестве составляющей
15
плана по вакцинации, необходимо продемонстрировать возбуждающий или
усиливающий эффект или вклад продукта в план вакцинации в целом.
ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕСТЫ
В принципе, демонстрация эффективности должна проводиться в хорошо
контролируемых лабораторных условиях при помощи введения в организм
животного, для которого предназначена вакцина, вещества, провоцирующего
выделение антител, после введения вакцины, с соблюдением всех рекомендуемых
условий применения. В качестве вещества, провоцирующего выработку антител,
применяют штамм, отличный от использованного в производстве вакцины.
Насколько это возможно, условия введения этого штамма должны быть приближены
к естественным условиям заражения, например, что касается количества
организмов, провоцирующих выработку антител, или метода их введения.
Если возможно, необходимо определить механизм иммунитета (клеточный/
гуморальный, местный/ общий, классы иммуноглобулина), вызываемый после
введения вакцины животным, для которых она предназначена.
ПОЛЕВЫЕ ИСПЫТАНИЯ
В общем, результаты лабораторных тестов должны дополняться данными от
полевых испытаний, проводимых с контрольными животными, которым не вводилась
вакцина. Если лабораторные испытания не могут подтвердить эффективность,
приемлемым может быть только результат полевых испытаний.
5.2.8.
СНИЖЕНИЕ РИСКА ПЕРЕДАЧИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГУБЧАТОЙ
ЭНЦЕФАЛОПАТИИ ЧЕРЕЗ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА
1. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
2. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ОБЩЕЙ ГЛАВЫ
3. ПРОИЗВОДСТВО (ВКЛЮЧАЯ СБОР МАТЕРИАЛОВ-ИСТОЧНИКОВ)
3.1. Животные как источник материала
3.2. Части тела животных, жидкости и выделения как исходные материалы
3.3. Проверка процесса
3.4. Возраст животных
3.5. Конкретная продукция
4. ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
1. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Инфекционные губчатые энцефалопатии (ИГЭ) включают почесуху овец и коз,
хроническую карликовую болезнь мулов, оленей и лосей, бычью губчатую
энцефалопатию (БГЭ) скота, а также куру и болезнь Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ) у
людей. Возбудители этих болезней размножаются в инфицированных особях,
обычно без признаков инфекции, которые можно обнаружить при помощи
имеющихся диагностических тестов, проводимых in vivo. После инкубационного
периода продолжительностью до нескольких лет возбудители вызывают болезнь и в
конце концов ведут к смерти. Методов лечения неизвестно.
Диагноз основан на клинических признаках, подтверждающихся во время
вскрытия, характерных гистопатологических поражений мозга или при помощи
16
обнаружения фибриллярные белков, характерных для губчатых энцефалопатий. Для
подтверждения диагноза может также применяться демонстрация инфективности
при помощи инокуляции предполагаемо пораженных тканей в лабораторных
животных, но инкубационный период при этом длится месяцы или годы. Имеются
сведения о ятрогенной передаче губчатых энцефалопатий. Что касается овец,
почесуха была случайно передана им во время применения вакцины «Louping III»,
приготовленной из объединенных овечьих мозга и селезенки, обработанных
формальдегидом, в которую ненамеренно был включен материал от зараженных
почесухой овец. В случае с человеком, имеются случаи передачи БКЯ,
приписываемые неоднократному парентеральному приему гормона роста и
гонадотропина, полученных из гипофиза умерших людей. Кроме того, случаи БКЯ
приписываются использованию зараженных инструментов при операциях на
головном мозге и трансплантациях оболочек головного мозга и роговицы у людей.
Информация о характеристиках этих возбудителей ограничена. Они
чрезвычайно устойчивы к большинству химических и физических процедур,
инактивирующих обычные вирусы. Они не вызывают обнаруживаемой иммунной
реакции. Существуют естественные барьеры, ограничивающие межвидовое
распространение инфекции, но при соответствующих обстоятельствах их можно
преодолеть. Обычно это зависит от штамма, дозы, метода воздействия и размера
барьера между видами. Исследования лабораторных животных показали, что
наиболее эффективным методом является внутримозговая инокуляция.
В естественных условиях человек подвергался воздействию возбудителя
овечьей почесухи в течение как минимум 200 лет, но несмотря на проведенные
обширные эпидемиологические исследования, не было обнаружено признаков
передачи почесухи людям. БГЭ впервые был распознан в Великобритании в 1986 г.
Им было поражено большое количество скота и отдельных стад. Очевидно, что БГЭ
является заболеванием, передающимся через пищу. В других странах наблюдались
случаи БГЭ, либо после вывоза животных из Великобритании, либо у местных
животных. Хотя биологические свойства возбудителя БГЭ отличаются от свойств
возбудителя почесухи, вероятно, что межвидовые барьеры могут быть разными.
Имеются убедительные доказательства, показывающие, что новая разновидность
БКЯ вызывается возбудителем, вызывающим БГЭ у скота.
Появление новой разновидности БКЯ у людей вызвало озабоченность, что и
возбудитель БГЭ может передаваться человеку. Таким образом, необходимо с
осторожностью использовать для производства лекарственных средств
биологические материалы от видов, поражаемых этими болезнями, за пределами
экспериментов.
Таким образом, для снижения риска заражения необходимо выполнять
приведенные ниже рекомендации. Несмотря на эту общую главу, следует
подчеркнуть, что потенциальный риск, связанный с конкретным лекарственным
средством, должен рассматриваться в каждом случае отдельно в свете конкретных
обстоятельств и имеющихся знаний.
2. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ОБЩЕЙ ГЛАВЫ
Данная общая глава рассматривает значение ИГЭ для лекарственных средств
для человека и животных и меры по снижению риска передачи болезни через них.
Таким образом, она касается материалов животного происхождения, в особенности
от жвачных животных, которые применяются для приготовления:
-
активных веществ;
-
наполнителей;
-
сырья или исходного материала и реагентов, используемых в производстве
(например, бычий сывороточный альбумин, ферменты, культуральные среды, в
том числе для приготовления рабочих банков клеток или новых контрольных
банков клеток).
17
Данная общая глава также касается материалов, имеющих непосредственных
контакт с оборудованием, участвующим в производстве
(а значит, имеющих
потенциал заражения), например, в контрольной среде, применяющейся для
проверки завода и оборудования.
Данная общая глава касается материала от жвачных животных.
Предлагаемые меры особенно актуальны для бычьего материала и могут
потребовать модификации для мер, касающихся материала от овец, коз и других
видов, подверженных ИГЭ за рамками экспериментов.
В свете имеющихся научных знаний, несмотря на географическое
происхождение, вероятность того, что молоко представляет риск заражения ИГЭ,
очень мала. Следовательно, молоко и материалы, полученные из него, исключаются
из области применения общей главы, при условии, что молоко получено от здоровых
животных в тех же условиях, в которых получают молоко для потребления
человеком19. Продукты из молока от жвачных животных, приготовленные с
использованием других материалов от жвачных животных
(таких как казеин,
переработанный ферментами поджелудочной железы), не исключаются из области
применения данной общей главы благодаря использованию таких других
материалов от жвачных животных.
Продукты из шерсти или волос жвачных животных, такие как ланолин, спирт
шерстяного жира и аминокислоты также исключаются из области применения
данной общей главы, при условии, что шерсть и волосы получены от живых
животных. Продукты из шерсти и волос жвачных животных, приготовленные с
использованием других материалов от жвачных животных (таких как ферменты
поджелудочной железы), не исключаются из области применения данной общей
главы благодаря использованию таких других материалов от жвачных животных.
Данную общую главу следует читать в комплексе с различными Решениями
Комиссии Европейского Сообщества, которые приводятся в исполнение с 1991 г.
3. ПРОИЗВОДСТВО (ВКЛЮЧАЯ СБОР ИСХОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ)
Если у производителей лекарственных средств есть выбор между
использованием материала от жвачных животных и материала от нежвачных
животных, использование материала от нежвачных животных предпочтительнее.
Замена материалов, полученных от жвачных животных, на материалы от вида,
страдающего ИГЭ, или вида, который может быть ими заражен в ходе
экспериментов оральным путем, обычно считается неприемлемым.
Необходимо иметь данные об источнике материалов
(в том числе
географическое происхождение животного) и других мерах, прдпринятых для
уменьшения риска передачи возбудителей ИГЭ. Производитель лекарственного
средства должен провести проверку поставщика таких материалов для того, чтобы
удостовериться, что они получены и обрабатываются в соответствии с этой общей
главой и соответствующими системами контроля качества.
Риск передачи возбудителей инфекции можно намного уменьшить при помощи
контроля некоторых параметров. Эти параметры включают:
- источник животных;
- природа животных тканей, применяемых в производстве;
- производственный процесс (-ы).
Один из подходов не обеспечит безопасность продукции и, таким образом, все три
подхода, приведенные выше, должны дополнять друг друга для снижения риска
контаминации.
19 Для оценки риска, связанного с ветеринарными лекарственными средствами, предназначенными для
жвачных животных, и его снижения следует учитывать дополнительные факторы, касающиеся только этого
вида.
18
3.1. ЖИВОТНЫЕ КАК ИСТОЧНИК МАТЕРИАЛА
Самым важным критерием для безопасности лекарственных средств является
тщательный отбор источников материала.
3.1.1. Самым лучшим источником материала являются страны, в которых не
зарегистрировано случаев БГЭ, в которых есть:
- обязательное уведомление;
- обязательная клиническая и лабораторная проверка подозрительных случаев.
Должна иметься официальная сертификация происхождения. Кроме того,
необходимо обеспечить введение риска инфекции БГЭ при помощи следующих
факторов:
- ввоз скота из стран с высоким уровнем заболеваемости БГЭ;
- ввоз потомства пораженных животных;
- использование в корме жвачных животных мяса и костной муки, содержащей какой-
либо белок жвачных животных, полученный из стран с высоким или низким уровнем
заболеваемости БГЭ или стран с неопределенным статусом.
3.1.2. Материал может также быть получен из стран с небольшим количеством
случаев заболевания местных животных, если в дополнение к факторам из пункта
3.1.1:
- туши зараженных животных уничтожаются;
- потомство зараженных самок не используется;
- существует запрет на кормление жвачных животных белком млекопитающих.
Животные-источники должны быть рождены после ввода запрета на корм.
Если дата рождения животного неизвестна, в целях безопасности источника следует
учесть как дату ввода запрета, так и инкубационный период ИГЭ.
Стада, в которых имелись случаи заболевания БГЭ, не используются в
качестве источников.
3.1.3. Нельзя использовать исходные материалы из стран с высоким уровнем
заболеваемости БГЭ.
В дополнение к этим мерам производители лекарственных средств должны
обосновать свою стратегию выбора источников по отношению к категории
материалов, количеству исходного материала и предполагаемому использованию
конечного лекарственного средства. В странах-поставщиках исходные материалы из
надежно наблюдаемых стад могут иметь дополнительный запас надежности.
3.2. ЧАСТИ ТЕЛ ЖИВОТНЫХ, ЖИДКОСТИ И ВЫДЕЛЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ
ИСХОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ
Различные органы и выделения пораженного ИГЭ животного имеют
различный уровень инфекционности. На основании данных о натуральной почесухе
была произведена классификация органов, тканей и жидкостей по четырем
основным группам с различным потенциалом риска, как показано в Таблице 5.2.8.-1.
Хотя сейчас известно, что распространение инфекционности пораженного БГЭ скота
более ограничено, при выборе исходных материалов следует продолжать учитывать
классификацию тканей и жидкостей животных, приведенную в таблице. Категории в
таблице являются только показательными, и важно учитывать следующие моменты:
- классификация тканей в Таблице 5.2.8.-1 основана на титрации инфекционности у
мышей внутримозговым способом. В экспериментальных моделях с
использованием штаммов, адаптированных к лабораторным животным, могут
наблюдаться более высокие титры и немного другая классификация тканей;
19
- в определенных ситуациях возможна перекрестная контаминация тканей
различных категорий инфекционности. На возможный риск оказывают
воздействие обстоятельства, при которых происходит удаление тканей, особенно
при контакте материала низкой группы риска с материалом высокой группы риска.
Таким образом, перекрестная контаминация некоторых тканей может
увеличиваться, если зараженные животные убиваются проникающим оглушением
мозга или если мозг и/ или спинной мозг разрезаются. Риск перекрестной
контаминации снижается, если жидкости собирают с минимальными
повреждениями тканей, а клеточные компоненты удаляются, и если кровь плода
собирают без заражения другими тканями матери или плода, в том числе
плацентой, амниотическими и аллантоисными жидкостями.
- риск, представляемый перекрестным заражением, зависит от некоторых
дополнительных факторов, включая:
- предосторожности, принимаемые для предотвращения контаминации во
время сбора тканей (см. выше);
- уровень контаминации (количество контаминирующей ткани);
- количество материала, которое нужно использовать;
- процесс, которому будет подвергнут материал во время производственного
процесса.
Производители лекарственных средств должны предоставлять оценку риска.
Таблица 5.2.8.-1. Относительные титры инфекционности почесухи в тканях и
жидкостях тела от зараженных естественным путем овец и коз с клинической
почесухой20
Категория I
Высокая инфекционность
Головной мозг, спинной мозг, (глаз)
Категория II
Средняя инфекционность
Подвздошная кишка, лимфатические узлы, проксимальная
толстая кишка, селезенка, миндалевидная железа,
(твердая
мозговая оболочка, пинеальная железа, плацента),
спинномозговая жидкость, гипофиз, надпочечная железа
Категория III
Низкая инфекционность
Дистальная толстая кишка, слизистая оболочка носа,
периферические нервы, костный мозг, легкое, печень,
поджелудочная железа, вилочковая железа
Категория IV
Нет обнаруживаемой инфекционность 21
Кровяной сгусток, экскременты, сердце, почка, грудная железа,
молоко, яичник, слюна, слюнная железа, семенной пузырек,
сыворотка, скелетная мышца, яичко, щитовидная железа,
матка, ткани плода,
(желчь, кости)22, хрящевая ткань,
соединительная ткань, волосы, кожа, моча
20 Ткани, взятые в скобки, не титровались в исходных исследованиях, но их относительная инфекционность
устанавливается другими данными о губчатых энцефалопатиях. Не вошедшие в список материалы могут
классифицироваться по аналогии с указанными на основе их состава.
21 Во время биологических проб, включающих прививку до 5 мг ткани в головной мозг грызунов, не
наблюдалось передачи инфекционности.
22 Череп и позвонки см. также пункт 3.2 о перекрестной контаминации.
20
3.3. ПРОВЕРКА ПРОЦЕССА
В достижении приемлемого уровня безопасности продукции самым важным
критерием является контролирование источников, так как существуют
документальные подтверждения того, что возбудители ИГЭ устойчивы к
большинству процедур по инактивации.
Анализ беспристрастности процедур удаления/ инактивации сложно
интерпретировать, так как необходимо учитывать природу введенного материала и
его значимость для естественной ситуации, план исследования
(в том числе
пропорциональное уменьшение масштаба процессов) и метод обнаружения
возбудителя
(тест in vitro или in vivo) после введения и после лечения. Для
понимания наиболее подходящей методологии анализа беспристрастности
необходимы дальнейшие исследования. Таким образом, исследования для анализа
беспристрастности в настоящее время обычно не требуются. Однако если
выдвигаются заявления о способности производственных процессов удалить или
инактивировать возбудителей ИГЭ, их необходимо доказать при помощи
соответствующих исследований для анализа беспристрастности, которые будут
зависеть от процесса.
Кроме особых ограничений, касающихся исследований анализа
беспристрастности по возбудителям ИГЭ и их интерпретации, основной преградой
является определение шагов по эффективному удалению или инактивации
возбудителей ИГЭ в процессе производства биологических лекарственных средств.
Поощряется продолжение производителем исследований методов удаления и
инактивации для определения шагов/ процессов, которые принесут пользу в
обеспечении удаления или инактивации возбудителей ИГЭ.
В любом случае производственный процесс, где это возможно, должен
проходить с учетом имеющейся информации о предполагаемых методах удаления
или инактивации возбудителей ИГЭ.
Некоторые производственные процедуры могут в значительной мере
способствовать снижению риска заражения ИГЭ, например, процедуры,
используемые в производстве жира и его производных (см. ниже).
3.4. ВОЗРАСТ ЖИВОТНЫХ
Так как накопление инфекционности ИГЭ происходит в течение
инкубационного периода продолжительностью в несколько лет, разумным может
оказаться использование в качестве источника молодых животных.
3.5. КОНКРЕТНАЯ ПРОДУКЦИЯ
- Жир, применяющийся в качестве исходного материала для выпуска производных
жира, должен изготовляться по крайней мере таким же безопасным и точным
методом, как методы, предусмотренные международными предписаниями.
Производные жира, такие как глицерин и жирные кислоты, производимые из жира
при помощи точных процессов, изучались в течение некоторого времени, и
считаются неинфекционными. Примерами точных процессов являются:
-
трансстерификация или гидролиз при не температуре не ниже
200ºС в
течение не менее 20 минут под давлением (производство глицерина, жирных
кислот и сложных эфиров жирных кислот;
-
омыление NaOH 12 M (производство глицерина и мыла):
- серийный процесс: при температуре не ниже 140 ºС в течение не менее 3
часов;
- непрерывный процесс: при температуре не ниже 140 ºС, давлении 2 бара
(2000 гПа) в течение не менее 8 минут, или эквивалентная обработка.
- Желатин:
21
-
Для желатина, производимого из костей коров23, безопасность продукта будет
обеспечена соблюдением всех следующих параметров:
- географическое происхождение животного-источника;
- черепа и костный мозг должен удаляться из исходного материала24;
-
рекомендуется также исключение позвонков, особенно с учетом
географического происхождения;
- предпочитаемым в настоящее время методом производства является
натронная варка;
- при наблюдении за производственным процессом и для разграничения
партий (например, определения партии, разделения партий, уборка между
партиями и т.д.) необходимо следовать таким системам, как сертификация
ISO 9000 и АОККТ (Анализ опасностей и критическая контрольная точка);
- должны существовать процедуры для обеспечения отслеживания и проверки
поставщиков исходного материала.
- Для желатина из шкур коров:
-
следует предотвращать перекрестную контаминацию потенциально
инфекционными материалами.
Производители лекарственных средств должны предоставлять оценку риска.
4. ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Оценка риска, связанного с ИГЭ требует тщательного учета всех
перечисленных параметров, и предпочтительнее всего будет в производстве
продукции фармацевтической промышленности отказаться от использования
материалов, полученных от животных, подверженных ИГЭ
(вне рамок
экспериментов). Приемлемость конкретного лекарственного средства, содержащего
такие материалы, или получающего эти материалы в результате производственного
процесса, зависит от некоторого количества факторов, среди которых:
- документирование и запись источников животных;
- природа тканей животных, применяемых в производстве;
- производственный процесс (-ы);
- способ применения препарата;
- количество ткани, используемое в лекарственных средствах;
- максимальная терапевтическая дозировка (суточная доза и продолжительность
лечения);
- предназначение продукции.
Производители лекарственных средств животного происхождения несут
ответственность за выбор и обоснование адекватных мер. Следует учитывать
уровень науки и технологии.
23 Исходным материалом считаются кости до обезжиривания.
24 Невозможно предсказать, в какие географические регионы распространяться в будущем БГЭ/ ИГЭ. Любое
изменение в географическом распространении БГЭ/ ИГЭ может привести, в самом худшем случае развития
ситуации, к отзыву фармацевтических средств, содержащих желатин. Так как желатин содержится в большом
количестве лекарственных средств в качестве наполнителя и имеет большой срок хранения начиная от
производства до окончания срока годности фармацевтических средств, любой отзыв может иметь серьезные
последствия по отношению к поставкам важнейших лекарственных средств. Таким образом, необходимо
удалять череп и спинной мозг из исходного материала для желатина, получаемого из коровьих костей,
независимо от географического происхождения животных-источников.
22
Несмотря на данную общую главу, следует отметить, что потенциальные
риски, связанные с конкретным лекарственным средством, должны учитываться
индивидуально в свете конкретных обстоятельств и имеющихся знаний.
Настоящее руководство должно использоваться и при оценке отдельных
продуктов на основании суждения «Риск/Преимущество».
23
5.3. СТАТИСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОБРАБОТКИ РЕЗУЛЬТАТОВ
АНАЛИЗА
5.3.1. СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Данная глава является руководством для планирования тестов биологической
активности, описанных в Фармакопее и для анализа их результатов. Она предназначе-
на для специалистов, у которых статистика не является основной специальностью и
сферой деятельности, в том случае, если они несут ответственность за проведение
количественного анализа или интерпретацию результатов этих анализов, и не могут
прибегнуть к помощи и советам специалистов в области статистики. Приведенные в
данной главе методы расчета не являются обязательными при выполнении количест-
венных определений биологической активности, предусмотренных Фармакопеей. До-
пускается использование альтернативных методов при условии, что они не уступают
по надежности методам, описанным в данной главе. Существует широкий спектр про-
граммного обеспечения, которое может быть полезно в зависимости от средств, дос-
тупных аналитику, и от его знаний и опыта.
Следует обращаться за помощью к профессионалам в ситуациях, когда:
-
требуется детальная проработка плана и методов анализа, подходящих для на-
учного исследования или разработки нового лекарственного средства;
-
анализ требуется для расширенных нелинейных графиков зависимости доза-
эффект, например с такой ситуацией можно столкнуться при проведении коли-
чественных иммунологических определений;
-
нельзя придерживаться ограничений, накладываемых данной главой на план ко-
личественного определения, например, необходимость корректировки планов
количественного определения может быть вызвана специфическими лаборатор-
ными условиями, или невозможностью применения равных количеств одинаково
раздельных доз.
1.1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ТОЧНОСТЬ
Биологические методы анализа применяют для количественного определения та-
ких субстанций и препаратов, активность которых не может быть корректно оценена
при помощи химических или физических методов анализа. Везде, где возможно, в ос-
нову количественных определений положен принцип сравнения со стандартным пре-
паратом, с тем, чтобы определить какое количество анализируемой субстанции даст
такой же биологический эффект как определенное количество (Единица) стандартного
препарата. Существенным условием проведения таких биологических количественных
определений является то, что анализ стандартного препарата и исследуемой субстан-
ции должен быть выполнен в одно и тоже время и при идентичных условиях.
Для некоторых количественных определений (например, определения титра виру-
са) активность испытуемого образца не выражается относительно стандарта. Такой тип
количественного определения рассмотрен в Разделе 4.5.
Любая оценка активности, полученная в ходе биологического количественного оп-
ределения включает случайную ошибку, обусловленную свойственной биологическим
реакциям изменчивостью и, если это возможно, следует провести вычисление ошибки,
результатов каждого количественного определения, даже в случае использования
официального метода определения. В этой связи ниже приведены методы планирова-
ния количественных определений и вычисления их ошибок. Каждый раз, перед тем как
остановиться на том или ином статистическом методе, следует провести предвари-
тельное исследование с определенным числом повторений, чтобы убедиться в приме-
нимости этого метода.
Доверительный интервал активности характеризует точность, с которой была
оценена активность при количественном определении. Он рассчитывается исходя из
плана эксперимента и объема выборки. При биологических количественных определе-
ниях обычно выбирается 95% доверительный интервал. Для расчета границ этого ин-
тервала применяются методы математической статистики, с тем, чтобы гарантировать
утверждение, что существует 95% вероятность того, что действительное значение ак-
тивности находится в данном интервале. Является ли эта точность приемлемой для
Фармакопеи, зависит от требований, установленных в частной статье на конкретный
препарат.
Термины «среднее» и «стандартное отклонение» используются в данном разделе
в соответствии с их определением в большинстве руководств по биометрии.
Термины «заявленная активность» или «активность, указанная в маркировке», «уста-
новленная активность», «предполагаемая активность», «отношение активностей» и
«рассчитанная активность» используются в данном разделе для обозначения следую-
щих понятий:
-
«заявленная активность» или «активность, указанная в маркировке»: для готового
препарата - номинальное значение, установленное на основании известной актив-
ности исходного материала; для исходного материала - активность, установленная
производителем;
-
«установленная активность» - активность стандартного препарата;
-
«предполагаемая активность»: временно установленная активность испытуемого
препарата, на основании которой рассчитываются дозы, которые были бы эквива-
лентны дозам используемого стандартного препарата;
-
«отношение активностей» испытуемого препарата; отношение равноактивных доз
стандартного препарата и испытуемого препарата в условиях количественного оп-
ределения;
-
«рассчитанная активность» - активность, рассчитанная на основании данных коли-
чественного определения.
В разделе 9 (глоссарий символов) приведены наиболее важные, используемые в
данной главе символы. Если в тексте используется символ, не приведенный в этом
разделе, или символ используется в другом значении, то его определение дается в той
части текста.
2. РАНДОМИЗАЦИЯ И НЕЗАВИСИМОСТЬ КОНКРЕТНЫХ ИССЛЕДОВА-
НИЙ
Применение различных методов воздействий к различным экспериментальным
объектам (животные, пробирки и т.д.) должно быть осуществлено определенным стро-
го случайным образом. Любой другой выбор экспериментальных условий, который
преднамеренно не учитывается в плане эксперимента, также должен быть выполнен
случайным образом. Например, выбор размещения боксов в лаборатории и порядок
проведения исследований. В частности, группа животных, получающих одинаковую до-
зу какого-нибудь препарата, не должна одновременно подвергаться исследованию (в
то же самое время или в том же самом месте), до тех пор, пока не будет весомых дока-
зательств того, что источник вариации (например, между временем или между положе-
ниями) является незначительным. Рандомизация может быть осуществлена с исполь-
зованием компьютера при помощи встроенной функции случайных чисел. Каждый раз,
после запуска программы аналитик должен убедиться, что генерируется новая после-
довательность случайных чисел.
Препараты, назначаемые каждому экспериментальному объекту, должны быть на-
столько независимы, насколько это возможно. В пределах каждой экспериментальной
группы, разведения, назначенные каждой группе, должны быть не просто разведения-
ми одной и той же дозы, но и должны быть приготовлены индивидуально. Без выпол-
нения данного условия, вариабельность, свойственная препарату, не будет полностью
представлена в дисперсии ошибки эксперимента. В результате будет недооценена не-
исключенная погрешность, что может привести к:
1) необоснованному ужесточению исследования при дисперсионном анализе (см. Раз-
делы 3.2.3 и 3.2.4);
2) недооценке действительных доверительных интервалов при испытании, которые,
как показано в Разделе 3.2.5, рассчитаны исходя из оценки s2 (средний квадрат не-
исключенной ошибки).
3. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОСНОВАННЫЕ НА КОЛИЧЕ-
СТВЕННЫХ ЭФФЕКТАХ
3.1. СТАТИСТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ
3.1.1 ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ
Количественные определения биологической активности, включенные в Фарма-
копею, основаны на «принципе разведения». Это означает, что анализируемый испы-
туемый препарат предположительно содержит то же самое активное вещество, что и
стандартный препарат, но отличается от последнего соотношением активного и неак-
тивного компонентов. В этом случае испытуемый препарат можно теоретически полу-
чить из стандартного путем его разведения неактивными компонентами. Для того, что-
бы проверить, подчиняется ли какой-либо конкретный тест количественного определе-
ния «принципу разведения», необходимо сравнить зависимость доза-эффект стан-
дартного и испытуемого препаратов. Если эти зависимости различаются статистически
значимо, то теоретическая модель «принципа разведения» не является достоверной.
Статистически значимые различия в зависимостях доза-эффект для стандартного и
испытуемого препаратов позволяют предположить, что один из препаратов, кроме ак-
тивного компонента, содержит другие компоненты, которые обладают активностью или
влияют на измеряемые результаты.
Для того, чтобы в теоретической модели достигнуть более выраженного эффек-
та разведения, следует преобразовать зависимость доза-эффект в линейную функцию
в наибольшем возможном интервале доз. В качестве модели для рассматриваемых
количественных определений биологической активности интерес представляют две
модели: модель параллельных линий и модель угловых коэффициентов.
Применение той или иной модели зависит от выполнения следующих условий:
1) различные воздействия у экспериментальных объектов были выполнены случай-
ным образом;
2) результаты каждого исследования подчиняются закону нормального распределе-
ния;
3) стандартные отклонения эффектов в каждой исследуемой группе, как для стан-
дартного, так и для испытуемого препаратов, статистически не отличаются друг от
друга.
При разработке методики количественного определения, аналитик должен убе-
диться, что полученные данные от различных количественных определений удовле-
творяют этим теоретическим условиям.
-
Условие 1 может быть выполнено при помощи использования Раздела 2.
-
Условие 2 является предположением, которое на практике почти всегда выполняет-
ся. Незначительные отклонения от этого предположения, в основном, не вносят
серьезных ошибок в анализ, поскольку исследование включает несколько повторе-
ний. В случае сомнения, может быть выполнена проверка на нормальность (напри-
мер, при помощи критерия Шапиро-Уилка (Shapiro-Wilk)1).
-
Для проверки выполнения Условия 3 могут быть использованы тесты проверки од-
нородности дисперсий (например, критерий Бартлетта (Bartlett)2, критерий Кокрена
(Cochrane)3). Для этих целей также может быть использовано графическое пред-
ставление результатов анализа (см. примеры в Разделе 5).
Если условия 2 и/или 3 не выполняются, то преобразование результатов может
привести к улучшению выполнения этих условий. Примерами таких преобразований
являются логарифмическое (ln y), квадратичное (
y , y2).
-
Логарифмическое преобразование значений y в ln y, может быть полезно если од-
нородность дисперсий неудовлетворительна. Оно также может улучшить нормаль-
ность распределения, если оно смещено вправо.
-
Преобразование y в
y можно использовать в случае, если результаты подчиняют-
ся распределению Пуассона, то есть, если они получены путем вычислений.
-
Преобразование y в y2 может быть использовано, если, например, доза в большей
мере пропорциональна площади ингибирования зоны роста микроорганизмов, чем
измеренному диаметру этой зоны роста.
Существует другая категория тестов, когда при анализе результат не может быть
количественно измерен для каждого экспериментального объекта, а определяется как
часть выборки у которой получен ответ на воздействие. Эта категория рассмотрена в
Разделе 4.
3.1.2 ПОСТОЯННЫЕ РУТИННЫЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
При постоянном проведении количественного определения, практически отсут-
ствует возможность систематически контролировать выполнение условий 1-3, так как
ограниченное число измерений в каждом анализе может влиять на чувствительность
статистических тестов. Однако специалисты по статистическому анализупоказали, что
при симметричных сбалансированных анализах, небольшие отклонения от однородно-
сти дисперсий и нормальности распределения не оказывают существенного влияния
на результаты количественного определения. Вопрос о применимости статистической
модели следует ставить под сомнение только в том случае, если ряд полученных ре-
зультатов имеет сомнительную достоверность. При этом может возникнуть необходи-
мость выполнить новую серию предварительных исследований, как описано в Разде-
ле 3.1.1.
1 Wilk, M.B. and Shapiro, S.S. (1968). The joint assesment of normality of several independ-
ent samples, Technometrics 10, 825-839.
2 Bartlett, M.S. (1937). Properties of sufficiency and statistical tests, Proc. Roy. Soc. London,
Series A 160, 280-282.
3 Cochran, W.G. (1951). Testing a linear relation among variances, Biometrics 7, 17-32.
В зависимости от применяемой статистической модели следует контролировать
выполнение двух дополнительных условий:
Для модели параллельных линий:
4А) Взаимосвязь между логарифмом дозы и результатом может быть представлено в
виде прямой линии во всем диапазоне исследованных доз.
5А) При анализе прямая линия для любого испытуемого препарата параллельна соот-
ветствующей прямой линии для стандартного препарата.
Для модели угловых коэффициентов:
4В) Во всем диапазоне исследованных доз отношение между дозой и полученным эф-
фектом для каждого препарата может быть представлено в виде прямой линии.
5В) При анализе для любого испытуемого препарата прямая линия пересекает ось y
(при дозе, равной нулю) в той же точке, что и прямая линия для стандартного пре-
парата (другими словами, при анализе графики результирующей функции эффек-
тов всех испытуемых препаратов должны пересекаться с графиками результирую-
щей функции эффектов стандартного препарата в одной и той же точке).
Условия 4А и 4В могут быть проверены при количественных определениях в ко-
торых использовано как минимум по три разведения для каждого протестированного
препарата. Использование результатов количественного определения, полученных при
одном или двух разведениях, может быть обосновано лишь в том случае, если накоп-
ленный опыт свидетельствует, что условия линейности, параллельности или совпаде-
ние точек пересечения всегда выполняются.
После получения результатов количественного определения и перед вычисле-
нием относительной активности каждого препарата, выполняется дисперсионный ана-
лиз с целью проверки выполнения условий 4А и 5А (или 4В и 5В). Для этого общую
сумму квадратов делят на определенное число сумм квадратов, соответствующих каж-
дому выполняемому условию. Оставшиеся суммы квадратов представляют собой не-
исключенную (остаточную) погрешность определения. При помощи ряда F-отношений
можно оценить отсутствие или наличие значимых источников вариации, для этой неис-
ключенной (остаточной) погрешности определения.
Когда методика анализа провалидирована, активность каждого испытуемого
препарата по отношению к стандартному может быть рассчитана и выражена как от-
ношение активностей или преобразована в определенные единицы активности, напри-
мер, в международные единицы. Также, для каждого ряда данных анализа могут быть
установлены доверительные интервалы.
В Разделе 3.2. рассматриваются методики анализа, основанные на использова-
нии модели параллельных линий, а в Разделе 3.3. - основанные на использовании мо-
дели угловых коэффициентов.
Если хотя бы одно из перечисленных пяти условий (1, 2, 3, 4А, 5А или 1, 2, 3, 4В,
5В) не выполняется, применение приведенных в данной статье методов вычисления не
может быть обосновано и следует провести специальный анализ результатов количе-
ственного определения.
Аналитик не должен применять другой метод преобразования, до тех пор, пока
не убедится, что невыполнение условий является не случайным, а обусловлено систе-
матическим изменением условий испытания. В этом случае, прежде чем принять новое
преобразование для постоянных (рутинных) количественных определений, следует по-
вторить исследования, описанные в Разделе 3.1.1.
Высокое число недостоверных результатов анализа, возникающих вследствие
непараллельности или нелинейности, при выполнении постоянных (рутинных) количе-
ственных определений в результате сравнения подобных материалов, чаще всего сви-
детельствует о неправильном планировании эксперимента и числа повторений. Обыч-
но это обусловлено недостаточно полной идентификацией всех источников вариации,
воздействующих на количественное определение, что в результате может привести к
заниженной оценке неисключенной погрешности и, соответственно, к увеличению F-
отношений.
В рамках конкретного количественного определения не всегда можно принять во
внимание все возможные источники вариации (например, вариация в серии «изо-дня-в-
день»). В этом случае доверительные интервалы повторных результатов количествен-
ных определений одного и того же препарата могут не совпадать, и следует соблю-
дать осторожность при оценке отдельных доверительных интервалов. Для того, чтобы
получить более надежную оценку доверительного интервала, необходимо выполнить
несколько независимых количественных определений, объединить полученные ре-
зультаты и получить одну оценку активности и доверительный интервал (см. Раздел 6).
Для контроля качества постоянных (рутинных) количественных определений рекомен-
дуется результаты оценки угловых коэффициентов и оценки остаточной ошибки зано-
сить в контрольные карты.
-
довольно высокая неисключенная (остаточная) погрешность может свидетельство-
вать об определенной технической проблеме. Эту ситуацию следует проанализиро-
вать и, если в ходе выполнения количественного определения выявятся нарушения,
определение следует повторить. Необычно высокая неисключенная (остаточная)
погрешность также может указывать на наличие случайного выброса или аналогич-
ного результата. Эффект, достоверность которого ставится под сомнение из-за не-
правильного выполнения количественного определения, следует отбросить. Обос-
нованным также можно считать отбрасывание аномального эффекта после завер-
шения количественного определения, если удается проследить причину выброса и
убедиться, что она обусловлена нарушениями в ходе количественного определе-
ния. Произвольное отбрасывание или сохранение очевидных выбросов может ока-
заться серьезным источником погрешности измерения. В целом не рекомендуется
отбрасывать результаты лишь на основании значимости исследования на выбросы.
-
Время от времени может возникать довольно низкая неисключенная (остаточная)
погрешность, что приводит к тому, что F-отношения превышают критические значе-
ния. В этом случае может быть оправданным замена неисключенной (остаточной)
погрешности отдельного количественного определения на среднюю неисключенную
(остаточную) погрешность, полученную на основании архивных данных, зафиксиро-
ванных в контрольных картах.
3.1.3 ВЫЧИСЛЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ
Согласно общим принципам надлежащего планирования эксперимента на план
анализа обычно накладываются следующие три ограничения. Они обеспечивают выиг-
рыш как в простоте вычислений, так и в их точности.
а) число разведений должно быть одинаковым для каждого из тестируемых препара-
тов;
в) при использовании модели параллельных линий отношение двух последовательных
доз должно быть всегда постоянным для всех испытаний; при использовании моде-
ли угловых коэффициентов, должна быть постоянной разница (интервал) двух по-
следовательных доз.
с) число тестируемых объектов должно быть одинаковым во всех исследованиях.
Если используемый план удовлетворяет этим условиям, то вычисления упро-
щаются. Формулы вычислений приведены в Разделах 3.2 и 3.3. Рекомендуется исполь-
зовать программное обеспечение, разработанное специально для этих целей. Сущест-
вует ряд статистических программ, при помощи которых можно легко обрабатывать
планы количественных определений, приведенные в частных статьях. Не все програм-
мы могут использовать одни и те же формулы и алгоритмы, но они все должны приво-
дить к одинаковым результатам.
Планы количественных определений, не отвечающие вышеуказанным требова-
ниям, могут быть также допустимы и корректны. Однако, необходимые для таких вы-
числений формулы слишком сложны и поэтому в данной статье не приводятся. Крат-
кое описание методов расчета приводится в Разделе 7.1. Эти методы могут также ис-
пользоваться для ограниченных планов, в этом случае они эквивалентны упрощенным
формулам.
Формулы для ограниченных планов, приведенные в данной статье, могут быть ис-
пользованы, например, для создания специальных программ с использованием элек-
тронных таблиц. Для лучшего понимания статистики и проверки правильности резуль-
татов таких программ, могут быть использованы примеры, приведенные в Разделе 5.
3.2. МОДЕЛЬ ПАРАЛЛЕЛЬНЫХ ЛИНИЙ
3.2.1 ВВЕДЕНИЕ
На рисунке 3.2.1.-1. показана модель параллельных линий. Логарифмы доз от-
кладывают по оси абсцисс (х), таким образом, чтобы их значения возрастали слева на-
право. Эффекты откладывают по оси ординат (у). Конкретные значения эффектов для
каждого из исследований показаны в виде черных точек. Две линии представляют со-
бой рассчитанное соотношение «ln(доза-эффект)» для стандартного и испытуемого
препаратов.
Рисунок 3.2.1.-1. Модель параллельных линий в случае анализа (3+3). Оценка предпо-
лагаемой активности испытуемого препарата завышена по отношению к истин-
ной.
Примечание: В данной статье во всех случаях используется натуральный лога-
рифм (ln или logе). Везде, где используется термин «антилогарифм», подразумевается
значение ех. Тем не менее, также можно пользоваться логарифмом Бриггса или деся-
тичным логарифмом (lg или log10). В этом случае соответствующий «антилогарифм»
равен 10х.
Для удовлетворительного количественного определения предполагаемая актив-
ность испытуемого препарата должна быть близка к действительной активности. Исхо-
дя из предполагаемой активности испытуемого препарата и принятой активности стан-
дартного препарата, готовятся разведения с одинаковой (по возможности) активно-
стью, то есть соответствующие дозы стандартного и испытуемого препаратов должны
иметь одинаковую активность. Если нет информации о предполагаемой активности,
выполняют серию предварительных определений в широком диапазоне доз, для уста-
новления области, в которой эта зависимость является линейной.
Чем точнее определена принятая предполагаемая активность испытуемого препарата
к принятой активности стандартного препарата, тем ближе одна к одной будут эти ли-
нии, поскольку они должны давать одинаковые эффекты при одинаковых дозах. Гори-
зонтальное расстояние между линиями представят собой «истинное» значение актив-
ности испытуемого препарата по отношению к его предполагаемой активности. Чем
больше расстояние между линиями, тем менее точна предполагаемая активность ис-
пытуемого препарата. Если линия, соответствующая испытуемому препарату, смещена
вправо от линии, соответствующей стандартному препарату, то оценка предполагае-
мой активности была завышена и при расчетах оцененная активность будет ниже
предполагаемой. Аналогично, если линия, соответствующая испытуемому препарату,
расположена слева от линии, соответствующей стандартному препарату, то предпола-
гаемая активность была занижена и при расчетах оцененная активность будет выше
предполагаемой.
3.2.2 ПЛАН КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Для оптимизации точности плана анализа будет полезным соблюдение следую-
щих требований:
1) отношение между угловым коэффициентом и неисключенной (остаточной) по-
грешностью должно как можно бóльшим;
2) диапазон доз должен быть максимально возможным;
3) линии должны располагаться как можно ближе одна к другой, т. е. предполагае-
мая активность должна с хорошей точностью давать оценку «истинной» актив-
ности.
Распределение экспериментальных объектов (животные, пробирки и т.д.) для раз-
личных исследований может быть осуществлено разными способами.
3.2.2.1 Схема полной рандомизации
Если вся совокупность экспериментальных объектов представляется достаточно
однородной и нет никаких оснований полагать, что разброс результатов будет мень-
шим внутри определенным образом сформированных подгрупп, распределение объек-
тов в разные группы выполняется случайным образом.
Если объекты в подгруппах единиц, таких как положение в пространстве или да-
та исследования распределены более однородно, чем вся совокупность в целом, точ-
ность количественного определения может быть повышена путем введения в план ис-
следований одного или нескольких ограничений. Тщательно продуманное распределе-
ние объектов с использованием этих ограничений позволяет исключить незначимые
источники вариации.
3.2.2.2 Схема рандомизированных блоков
В основе этой схемы лежит возможность выделить идентифицируемый источник
вариации (например, различная чувствительность у нескольких приплодов экспери-
ментальных животных или различие между чашками Петри в случае микробиологиче-
ского определения активности методом диффузии). В соответствии с данной схемой
каждое исследование должно быть повторено одинаковое число раз в каждом из бло-
ков (приплод или чашка Петри). Данная схема применима только тогда, когда блок дос-
таточно большой для осуществления всех исследований. Пример использования такой
схемы приведен в Разделе 5.1.3. Также допускается использовать схемы рандомизи-
рованных блоков с повторениями. В пределах каждого блока исследования должны
распределяться случайным образом.
В Разделе 8.5. приведен алгоритм, при помощи которого можно получить случайное
распределение.
3.2.2.3 Схема латинского квадрата
Данная схема применяется, когда на результат воздействует два различных ис-
точника вариации, каждый из которых может характеризоваться k различными уровня-
ми или позициями. Например, в случае количественного определения антибиотиков с
использованием пластин, исследования могут быть организованы на большой пласти-
не в виде матрицы k¥k; причем каждое исследование встречается по одному разу в ка-
ждом столбце и в каждой строке. Схема применяется в случае, когда число строк,
столбцов и число исследований одинаково. Результаты записываются в виде квадрата,
называемого латинским. Вариации, обусловленные различием в результатах между k
строками и k столбцами, могут быть сгруппированы, что позволит уменьшить погреш-
ность. Пример использования схемы латинского квадрата приведен в Разделе 5.1.2. В
Разделе 8.6. дан алгоритм для построения латинских квадратов.
3.2.2.4 Перекрестная схема
Данную схему полезно применять, когда эксперимент может быть разделен на
блоки, но к каждому блоку возможно применить только два исследования. Например,
таким блоком может быть один экспериментальный объект, который может быть про-
тестирован дважды. Данная схема предназначена для повышения точности путем ис-
ключения различий результатов между объектами за счет их взаимной компенсации
при двух экспериментах с общим уровнем эффекта. Если исследуются две дозы испы-
туемого и стандартного препаратов, такую схему называют двойной перекрестной схе-
мой.
Эксперимент разбивают на две стадии, разделенные достаточным промежутком
времени. Объекты подразделяют на четыре группы, и на первой стадии эксперимента
в каждой группе выполняется одно из четырех исследований. Объекты, которые на
первой стадии получали один препарат, на второй стадии получают второй препарат.
Единицы, которые на первой стадии получали меньшие дозы, на второй стадии полу-
чают большие. Распределение доз приведено в Таблице 3.2.2.-I. Пример использова-
ния схемы показан в Разделе 5.1.5.
Таблица 3.2.2.-1.
Распределение доз при использовании перекрестной схемы.
Группа единиц
Стадия I
Стадия II
1
S1
T2
2
S2
T1
3
T1
S2
4
T2
S1
3.2.3 ДИСПЕРСИОННЫЙ АНАЛИЗ
В данном разделе приведены формулы, которые необходимы при выполнении
дисперсионного анализа. В Разделе 5.1. рассмотрены конкретные примеры, позво-
ляющие понять назначение этих формул. Если необходимо, можно также обратиться к
терминам и определениям (Раздел 9).
Приведенные формулы пригодны для симметричных количественных определе-
ний, в которых один или более испытуемых препаратов (Т, U и др.) сравниваются со
стандартным препаратом (S). Следует подчеркнуть, что формулы могут быть исполь-
зованы только в том случае, если дозы отличаются одна от другой в одинаковое число
раз, если каждый из препаратов исследуется одинаковое число раз и если каждое ис-
следование повторяется одинаковое число раз. Если эти условия не выполняются,
данные формулы не должны применяться для анализа.
За исключением некоторых уточнений остаточной ошибки, основной статистиче-
ский анализ данных количественного определения одинаков для схем полной рандо-
мизации, рандомизированных блоков и латинских квадратов. Формулы для перекрест-
ной схемы исследования сильно отличаются и приведены в примере 5.1.5.
Исходя из рассмотренных в разделе 3.1. пунктов и преобразовав, если это необ-
ходимо, эффекты, для каждой группы и для каждой дозы препарата следует вычислить
среднее значение, как описано в Таблице 3.2.3.-I. Также следует вычислить линейные
контрасты, связанные с наклоном прямых «ln(доза-эффект)». В таблице 3.2.3.-II. При-
ведены три дополнительные формулы, которые необходимы для проведения анализа.
Суммарная вариация результатов, вызванная различными препаратами, под-
разделяется далее, как описано в Таблице 3.2.3.-3; сумму квадратов при этом рассчи-
тывают с использованием данных из Таблиц 3.2.3.-1. и 3.2.3.-2. Сумма квадратов, обу-
словленная нелинейностью, может быть рассчитана только в том случае, если при ко-
личественном определении использовались, по крайней мере, по три дозы каждого из
препаратов.
Неисключенная погрешность количественного определения рассчитывается пу-
тем вычитания вариации, обусловленной схемой рандомизации эксперимента, из об-
щей вариации для эффекта (Таблица 3.2.3.-4). В этой таблице y - среднее значение
всех результатов, полученных при количественном определении. Следует заметить,
что для латинского квадрата число повторных результатов (n) равно числу строк,
столбцов и видов воздействий (dh).
Дисперсионный анализ завершают следующим образом. Находят дисперсию
(средний квадрат отклонения) путем деления каждой суммы квадратов на соответст-
вующее число степеней свободы. Далее оценивают статистическую значимость отно-
шения дисперсии для каждой переменной к неисключенной (остаточной) погрешности
(s2) ( так называемое F-отношение). Для чего можно использовать Таблицу 8.1 или со-
ответствующую подпрограмму компьютерного программного обеспечения.
Таблица 3.2.3.-1.
Формулы для количественных определений с дозами каждого из препаратов, при ис-
пользовании модели параллельных линий.
Стандартный
1-й испытуемый
2-й испытуемый
препарат
препарат
препарат
(S)
(T)
(U, и т.д.)
Средний эффект от
S1
T1
U1
минимальной дозы
Средний эффект от
S2
T2
U2
второй дозы
Средний эффект от
Sd
Td
Ud
максимальной дозы
Суммарный эффект
P
=S
+S
+..
+
P
=T
+T
+..
+
S
1
2
d
T
1
2
d
P
ит
д
U =
препарата
1
1
L
=1S
+ 2S
+ ...+ dS
±
(d
+
)
L
=1T
+2T
+ ...+ dT
±
(d
+
)
LU= ...итд
Линейный контраст
S
1
2
d
S
T
1
2
d
2
T
2
Таблица 3.2.3.-2.
Дополнительные формулы для дисперсионного анализа
2
n
12n
n(P
+
P
+...)
S
T
H
HL
=
K
=
P =
3
d
d
-d
hd
Таблица 3.2.3.-3.
Формулы для расчета суммы квадратов и степеней свободы
Источник вариации (размаха)
Степени
Сумма квадратов
свободы
(f)
Препараты
h-1
2
2
SS
prep =
HP(P +P
+
...)
-
K
S
T
Линейная регрессия
1
1
2
2
2
SS
=
H
(L
+
L
+...)
reg
L
S
T
h
2
2
Непараллельность
h-1
SS
=H
(L
+L
+ ...) - SS
par
L S
T
reg
Нелинейность(*)
h(d-2)
SS
= SS
- SS
- SS
- SS
lin
treat
prep
reg
2
2
2
Группы
hd-1
SS
=
n(S
+ ...+S
+T
+...
+T
treat
1
d
1
(*) Не рассчитывается для двухдозовых количест-
венных определений
содержание .. 48 49 50 51 ..