ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год)

где :

допустимая пирогенная доза эндотоксина, вводимая в течение часа на

килограмм массы тела,

максимальная рекомендованная доза продукта, вводимая в течение ча-

са на килограмм массы тела.

Предел эндотоксина для активных субстанций, предназначенных для па-

рентерального введения, указывается в частных статьях и выражается в таких

единицах, как МЕ/мл, МЕ/мг, МЕ/(единица биологической активности) и т.д.

Концентрация испытуемого раствора:

- в мг/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в массовых еди-

ницах (МЕ/мг),

- в Ед/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в пересчете на

единицу биологической активности (МЕ/Ед)

- в мл/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в объемных еди-

ницах (МЕ/мл).

чувствительность лизата в гель-тромб-методе, указанная на этикет-

ке, или низшая точка стандартной кривой в турбидиметрических или хромогенных

методах.

ПРИНЦИП ГЕЛЬ-ТРОМБА (МЕТОДЫ А И В)

Гель-тромб-методы позволяют определять наличие и количество эндоток-

синов и основываются на эффекте свертывания лизата в присутствии эндотокси-

нов. Концентрация эндотоксинов, требующаяся для свертывания лизата в стан-

дартных условиях, представляет собой указанную на этикетке чувствительность

лизата. Для обеспечения точности и достоверности испытания указанную чувст-

вительность лизата следует подтвердить, а также провести испытание на ме-

шающие факторы, описанное в подразделе «1. Предварительные испытания».

1. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ

(i) Подтверждение заявленной чувствительности лизата

Перед использованием лизата в испытаниях указанную на этикетке чувст-

вительность λ, выраженную в МЕ/мл, следует подтвердить в четырех повторно-

стях. Подтверждение чувствительности лизата выполняют при использовании но-

вой партии лизата или при любом изменении экспериментальных условий, спо-

собном повлиять на результат испытания.

Готовят стандартные растворы не менее, чем четырех концентраций, экви-

валентных 2λ, λ, 0,5λ и 0,25 λ, путем разбавления исходного стандартного раство-

ра эндотоксина водой для ИБЭ.

В каждой из пробирок смешивают раствор лизата с равным объемом одного

из стандартных растворов (например, по 0,1 мл каждого). Если используются од-

норазовые флаконы или ампулы с лиофилизированным лизатом, растворы до-

бавляют непосредственно в ампулу или флакон. Реакционную смесь инкубируют

в течение определенного периода, в соответствии с рекомендациями производи-

теля лизата (обычно 37±1⁰С в течение 60±2 минут), избегая вибрации. Исследуют

целостность геля: при использовании пробирок каждую из них по очереди извле-

кают из инкубатора и переворачивают одним плавным движением приблизитель-

но на 180⁰. Если образуется твердый гель, остающийся на своем месте после пе-

реворачивании, результат записывают как положительный. Результат отрица-

тельный, если неповрежденного геля не образуется.

Результаты испытания считают достоверными, если низшая концентрация

стандартных растворов во всех повторностях дает отрицательный результат.

За конечную точку принимают последний положительный результат в нис-

ходящем ряду концентраций эндотоксина. Вычисляют среднее значение лога-

рифмов концентраций в конечных точках и, затем, антилогарифм этого среднего

значения по следующей формуле:

Среднее геометрическое концентраций в конечных точках =

antilog [(Se)/f],

где:

Se -

сумма логарифмов концентраций в конечных точках в используемом

ряду разведений,

число повторностей.

Среднее геометрическое концентраций в конечных точках представляет со-

бой измеренную чувствительность раствора лизата (МЕ/мл). Если это значение

составляет не менее 0,5λ и не более 2λ, чувствительность, указанную на этикетке,

считают подтвержденной и используют в испытаниях, выполняемых с этим лиза-

том.

(ii) Определение мешающих факторов

Готовят растворы A, B, C и D в соответствии с Таблицей 2.6.14.-1 и исполь-

зуют не содержащий определяемых эндотоксинов испытуемый раствор в разве-

дении, меньшем МДР в соответствии с указаниями подраздела «1. Предвари-

тельные испытания. (i) Подтверждение заявленной чувствительности лизата».

Таблица 2.6.14.-1

Рас-

Концентрация эндо-

Раство-

Фактор

Исходная

Число

твор

токсина/ Раствор, к

ритель

разведе-

концентра-

повтор-

которому добавляют

ния

ция эндо-

ностей

эндотоксин

токсина

/ Испытуемый рас-

твор

2λ / Испытуемый рас-

Испы-

2λ

твор

туемый

1λ

раствор

0,5λ

0,25λ

2λ / Вода для ИБЭ

Вода для

2λ

ИБЭ

1λ

0,5λ

0,25λ

0 / Вода для ИБЭ

Раствор А - раствор испытуемого препарата, не содержащий эндотоксинов в оп-

ределяемых концентрациях,

Раствор В - тест на мешающие факторы,

Раствор С - контроль чувствительности, указанной на этикетке,

Раствор D - отрицательный контроль (вода для ИБЭ)

Среднее геометрическое концентраций в конечных точках для растворов В

и С вычисляют по формуле, приведенной в подразделе «1. Предварительные ис-

пытания. (i) Подтверждение заявленной чувствительности лизата».

Испытание на мешающие факторы повторяют в случае любых изменений

экспериментальных условий, которые могут повлиять на результат.

Результаты испытания считают достоверными, если растворы А и D во всех

повторностях дают отрицательный результат, а результат, полученный для рас-

твора С, подтверждает чувствительность лизата, указанную на этикетке.

Если чувствительность лизата, определенная для раствора В, не менее

0,5λ и не более 2λ, считают, что испытуемый раствор в условиях испытания не

содержит мешающих факторов. В иных случаях раствор оказывает влияние на

результат испытания.

Если испытуемый препарат оказывает влияние на результат испытания в

разведениях менее МДР, испытание на мешающие факторы повторяют с исполь-

зованием больших разведений, но не превышающих МДР. Использование более

чувствительного лизата позволяет применять большие разведения испытуемого

препарата, и это может содействовать исключению мешающих факторов.

Мешающие факторы могут быть удалены соответствующей обработкой, на-

пример, путем фильтрации, нейтрализации, диализа или теплового воздействия.

Для того, чтобы установить, что выбранный метод эффективно исключает ме-

шающие факторы, не удаляя эндотоксины, испытания повторяют с использовани-

ем образца испытуемого препарата, к которому был добавлен стандартный обра-

зец эндотоксина и проведена выбранная процедура удаления мешающих факто-

ров.

2. ПРЕДЕЛЬНОЕ ИСПЫТАНИЕ (МЕТОД А)

(i) Методика

Готовят растворы A, B, C и D в соответствии с Таблицей 2.6.14.-2 и выпол-

няют испытание для этих растворов в соответствии с указаниями подраздела «1.

Предварительные испытания. (i) Подтверждение чувствительности лизата, ука-

занной на этикетке».

Таблица 2.6.14.-2

Раствор

Концентрация эндотоксина/ Раствор, к кото-

Число повторностей

рому добавляют эндотоксин

0/Разбавленный испытуемый раствор

2λ/ Разбавленный испытуемый раствор

2λ/ Вода для ИБЭ

0/ Вода для ИБЭ

Растворы А и В (положительный контроль с препаратом) готовят в разведе-

ниях не выше МДР и обрабатывают в соответствии с указаниями подраздела «1.

Предварительные испытания. (ii) Определение мешающих факторов». Растворы

В и С (положительные контроли) содержат стандарт эндотоксина в концентрации,

соответствующей двукратной заявленной чувствительности. Раствор D (отрица-

тельный контроль) представляет собой воду для ИБЭ.

(ii) Интерпретация

Результаты испытания считают достоверными, если положительные кон-

трольные растворы В и С в обеих повторностях дают положительный результат, а

раствор D - отрицательный результат.

Испытуемый препарат выдерживает испытание, если для раствора А в обе-

их повторностях получен отрицательный результат.

Если для раствора А в обеих повторностях получен положительный резуль-

тат:

- если при этом испытуемый раствор разбавлен до МДР, он не выдерживает ис-

пытание,

- если степень разведения препарата менее МДР, испытание повторяют с исполь-

зованием разведения, не превышающего МДР.

В случае, если для одной из повторностей раствора А получен положитель-

ный результат, а для другой - отрицательный, испытание повторяют. Испытуемый

препарат выдерживает испытание, если в повторном эксперименте для раствора

А в обеих повторностях получен отрицательный результат.

2. ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННОЕ ИСПЫТАНИЕ (МЕТОД В)

(i) Методика

С помощью данного испытания определяют количество бактериальных эн-

дотоксинов путем титрования до конечной точки. Готовят растворы A, B, C и D в

соответствии с Таблицей 2.6.14.-3 и выполняют испытание для этих растворов в

соответствии с указаниями подраздела «1. Предварительные испытания. (i) Под-

тверждение заявленной чувствительности лизата».

Таблица 2.6.14.-3.

Рас-

Концентрация эндо-

Раство-

Фактор

Исходная

Число

твор

токсина/ Раствор, к

ритель

разведе-

концентра-

повтор-

которому добавляют

ния

ция эндо-

ностей

эндотоксин

токсина

/ Испытуемый рас-

Вода для

твор

ИБЭ

2λ / Испытуемый рас-

2λ

твор

2λ / Вода для ИБЭ

Вода для

2λ

ИБЭ

1λ

0,5λ

0,25λ

0 / Вода для ИБЭ

Раствор А - испытуемый раствор в разведении, не превышающем МДР, с кото-

рым проводилось определение мешающих факторов. Последующие разведения

испытуемого раствора не должны превышать МДР. Используют воду для ИБЭ для

получения двух рядов разведений в отношениях 1, 1/2, 1/4 и 1/8к разведению, с

которым проводилось определение мешающих факторов. При необходимости мо-

гут быть использованы и другие разведения,

Раствор В - раствор А, содержащий стандарт эндотоксина в концентрации 2λ (по-

ложительный контроль с препаратом),

Раствор С - два ряда разведений воды для ИБЭ, содержащей стандарт эндоток-

сина в концентрациях 2λ, 1λ, 0,5λ, 0,25λ,

Раствор D - вода для ИБЭ (отрицательный контроль).

(ii) Вычисления и интерпретация

Результаты испытания считают достоверными при выполнении следующих

трех условий:

(а) раствор D (отрицательный контроль) в обеих повторностях дает отрица-

тельный результат,

(б) раствор В (положительный контроль с препаратом) в обеих повторно-

стях дает положительный результат,

(с) среднее геометрическое концентраций в конечных точках для раствора

С находится в пределах от 0,5λ до 2λ.

Для определения концентрации эндотоксинов в растворе А вычисляют кон-

центрации в конечных точках для каждого ряда разбавлений в каждой из повтор-

ностей путем умножения фактора разбавления в конечной точке на λ.

За концентрацию эндотоксина в испытуемом растворе принимают среднее

геометрическое концентраций в конечных точках в повторных экспериментах (см.

формулу в подразделе «1. Предварительные испытания. (i) Подтверждение чув-

ствительности лизата, указанной на этикетке»). Если испытание проводят с раз-

бавленным испытуемым раствором, концентрацию эндотоксина в исходном рас-

творе получают путем умножения на фактор разбавления.

Если ни одно из разведений испытуемого раствора в ходе испытания с под-

твержденной достоверностью не дает положительного результата, концентрацию

эндотоксинов регистрируют как «менее λ» (или, в случае использования разбав-

ленного образца, как «менее (λ ¥ наименьший фактор разведения образца)»). Ес-

ли для всех разведений получен положительный результат, то концентрация эн-

дотоксинов регистрируется как «равная или превышающая максимальный фактор

разведения, умноженный на λ» (например, в Таблице 2.6.14.-3, это значение рав-

но исходному фактору разведения ¥ 8

¥ λ).

Препарат соответствует требованиям испытания, если концентрация эндо-

токсина менее указанной в частной статье.

ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (МЕТОДЫ С, D, E и F)

1. ТУРБИДИМЕТРИЧЕСКИЙ ПРИНЦИП (МЕТОДЫ С и F)

Данный принцип представляет собой фотометрическое испытание, основанное на

измерении увеличения степени мутности. В зависимости от используемого подхо-

да, с использованием данного метода могут быть проведены турбидиметрическое

испытание методом конечной точки и кинетическое турбидиметрическое испыта-

ние.

Турбидиметрический метод конечной точки (метод F) основан на количест-

венном соотношении между концентрацией эндотоксина и степенью мутности

(выражающейся в пропускании или поглощении света) реакционной смеси в конце

инкубационного периода.

Кинетическое турбидиметрическое испытание (метод С) заключается либо в

измерении времени, требующегося для достижения заданного значения поглоще-

ния в реакционной смеси, либо в определении скорости увеличения степени мут-

ности.

Испытание проводят при температуре инкубации, рекомендованной произ-

водителем лизата (обычно 37±1⁰).

2. ХРОМОГЕННЫЙ ПРИНЦИП (МЕТОДЫ D и E)

Данный принцип основан на измерении количества хромофора, высвобож-

даемого из соответствующего хромогенного пептида в результате реакции эндо-

токсинов с лизатом. В зависимости от используемого подхода, с использованием

данного метода могут быть проведены хромогенное испытание методом конечной

точки и кинетическое хромогенное испытание.

Хромогенный метод конечной точки (метод Е) основан на количественном

соотношении между концентрацией эндотоксина и количеством хромофора, вы-

свобождаемого к концу инкубационного периода.

Кинетическое хромогенное испытание (метод D) заключается либо в изме-

рении времени, требующегося для достижения заданного значения поглощения в

реакционной смеси, либо в определении скорости появления окраски.

Испытание проводят при температуре инкубации, рекомендованной произ-

водителем лизата (обычно 37±1⁰).

3. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИСПЫТАНИЯ

Предварительные испытания проводят для обеспечения точности и досто-

верности результатов турбидиметрических и хромогенных испытаний. В ходе

предварительных испытаний подтверждают выполнение критериев стандартной

кривой и отсутствие мешающего влияния испытуемого раствора на результаты

испытания.

При внесении любых изменений в экспериментальные условия, которые мо-

гут повлиять на результаты, требуется подтверждение пригодности метода испы-

тания.

(i) Подтверждение выполнения критериев стандартной кривой

Для получения стандартной кривой готовят не менее трех концентраций эн-

дотоксина с использованием стандартного раствора эндотоксина. Проводят испы-

тание с каждым стандартным раствором эндотоксина не менее трех раз в соот-

ветствии с рекомендациями производителя лизата (объемные отношения, время

инкубации, температура, рН и т.д.).

Если при использовании кинетических методов желаемый интервал в лога-

рифмической шкале превышает 2, в испытание должны быть включены дополни-

тельные стандарты для включения каждого увеличенного логарифмического зна-

чения в диапазон стандартной кривой.

В диапазоне концентраций эндотоксина, указанном производителем лизата,

абсолютное значение коэффициента корреляции, ½r½, должно превышать или

быть равным 0,980.

(ii) Определение мешающих факторов

Выбирают концентрацию эндотоксина в центре или недалеко от центра

стандартной кривой. Готовят растворы A, B, C и D в соответствии с Таблицей

2.6.14.-4. Проводят испытание с каждым из этих растворов не менее, чем в двух

повторностях в соответствии с рекомендациями производителя лизата (объем ис-

пытуемого раствора и раствора лизата, объемное соотношение испытуемого рас-

твора и раствора лизата, время инкубации и т.д.).

Таблица 2.6.14.-4

Раствор

Концентрация эндоток-

Раствор, к которому

Число повторно-

сина

добавляют эндоток-

стей

син

Отсутствует

Испытуемый раствор

Не менее 2

Средняя

концентрация

Испытуемый раствор

Не менее 2

стандартной кривой

Не менее трех концентра-

Вода для ИБЭ

Не менее 2

ций (низшая определяется

λ)

Отсутствует

Вода для ИБЭ

Не менее 2

Раствор А - испытуемый раствор, который может быть разбавлен без превышения

МДР,

Раствор В - испытуемый препарат в разбавлении, аналогичном раствору А, содер-

жащий добавленный эндотоксин в концентрации, соответствующей или близкой к

центру стандартной кривой,

Раствор С - стандартный раствор эндотоксина в концентрациях, использовавшихся

при валидации метода в соответствии с указаниями подраздела «3. Предваритель-

ные испытания. (i) Подтверждение выполнения критериев стандартной кривой» (по-

ложительные контроли),

Раствор D - вода для ИБЭ (отрицательный контроль)

Вычисляют среднее значение возврата эндотоксина вычитанием средней

концентрации эндотоксина в растворе (при ее наличии) из средней концентрации

эндотоксина в растворе, содержащем добавленный эндотоксин.

Считают, что испытуемый раствор не содержит мешающих факторов, если

в условиях испытания вычисленная концентрация эндотоксина, добавленного к

испытуемому раствору, находится в пределах 50-200% от известной концентра-

ции добавленного эндотоксина, после вычитания концентрации эндотоксина, об-

наруженной в растворе, не содержащем добавок стандарта.

Если возврат эндотоксина не попадает в указанные пределы, следует про-

вести операцию исключения мешающих факторов в соответствии с указаниями,

приведенными при описании принципа гелевого сгустка, подраздел «1. Предвари-

тельные испытания. (ii) Определение мешающих факторов». Эффективность об-

работки подтверждают повторным проведением испытания на мешающие факто-

ры.

4. ИСПЫТАНИЕ

(i) Метод

Следуют указаниям, приведенным в подразделе «3. Предварительные ис-

пытания. (ii) Определение мешающих факторов».

(ii) Вычисления

Для раствора А в каждой повторности определяют концентрацию эндоток-

сина с использованием стандартной кривой, полученной из ряда положительных

контролей, раствор С.

Результаты испытания считают достоверными при выполнении следующих

трех условий:

(а) результат, полученный для раствора D (отрицательный контроль), не

превышает предельное холостое значение, требуемое в описании используемого

лизата,

(б) результаты, полученные для растворов С (положительные контроли) со-

ответствуют требованиям валидации, приведенным в подразделе «1. Предвари-

тельные испытания. (i) Подтверждение выполнения критериев стандартной кри-

вой»,

(с) возврат эндотоксина, вычисленный из концентрации эндотоксина, опре-

деленной в растворе В, после вычитания концентрации эндотоксина, определен-

ной в растворе А, находится в пределах 50-200%.

(iii) Интерпретация

Испытуемый препарат соответствует требованиям испытания, если средняя

концентрация эндотоксина в повторностях раствора А, с учетом разведений и

концентрации, менее предельного значения эндотоксина для препарата.

5. РЕАГЕНТЫ

(i) Раствор лизата

Лизат амебоцитов растворяют путем осторожного перемешивания в воде

для ИБЭ или в буфере, в соответствии с рекомендациями производителя лизата.

Восстановленный лизат хранят в охлажденном или замороженном состоянии, в

соответствии с указаниями производителя.

(ii) Лизат амебоцитов

Лизат амебоцитов - лиофилизированный продукт, полученный из амебо-

цитного лизата мечехвоста (Limulus polyphemus или Tachypleus tridentatus). Этот

реагент может производиться только в соответствии с предписаниями компетент-

ных органов.

Лизат амебоцитов, кроме эндотоксинов, может реагировать и с некоторыми

β-гликанами. Имеются препараты лизата амебоцитов, не реагирующие с гликана-

ми; они изготавливаются путем удаления из лизата амебоцитов G-фактора, реа-

гирующего с гликанами, или ингибированием реакционной системы G-фактора в

лизате амебоцитов. Эти препараты могут использоваться для определения эндо-

токсинов в присутствии гликанов.

(iii) Вода для ИБЭ (вода для испытания на бактериальные эндотокси-

ны)

Вода для ИБЭ - вода для инъекций R или вода, подготовленная с исполь-

зованием других методов, не дающая реакции с лизатом на пределе чувствитель-

ности реагента.

Следующая часть публикуется в информационных целях.

ИСПЫТАНИЕ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ: РУКОВОДСТВО

1. ВВЕДЕНИЕ

Эндотоксины, источником которых являются грамотрицательные микроорга-

низмы, являются наиболее распространенной причиной токсических реакций,

приписываемых наличию в фармацевтических препаратах пирогенных примесей;

их пирогенная активность намного выше, чем у большинства других пирогенных

субстанций. Эндотоксины представляют собой липополисахариды. Несмотря на

то, что существует незначительное количество пирогенов другой структуры,

обычно по отсутствию бактериальных эндотоксинов в продукте можно сделать

вывод об отсутствии пирогенных компонентов при условии, что наличие пироген-

ных субстанций, не относящихся к эндотоксинам, можно исключить.

Присутствие эндотоксинов в продукте может маскироваться факторами,

влияющими на протекание реакции эндотоксинов с лизатом амебоцитов. Поэтому

аналитик, желающий заменить требуемое в фармакопейной статье испытание на

пирогенность с использованием кроликов тестом на бактериальные эндотоксины,

должен продемонстрировать, что этот тест может быть выполнен для данного

продукта; при этом может оказаться необходимым выполнение процедуры удале-

ния мешающих факторов.

Как указано в методике испытания на бактериальные эндотоксины, результаты

испытания образца можно считать достоверными лишь при наличии следующей

информации:

1.1. Должна быть установлена пригодность материала, используемого в испыта-

нии. Должно быть гарантировано отсутствие эндотоксинов в воде для ИБЭ и

других реагентах, а чувствительность лизата амебоцитов должна быть прове-

рена для подтверждения чувствительности, заявленной производителем.

1.2. В связи с тем, что испытуемый продукт может влиять на ход испытания, чувст-

вительность лизата амебоцитов должна быть определена в присутствии и от-

сутствии испытуемого продукта. Между двумя значениями чувствительности

не должно быть существенной разницы.

В испытании на бактериальные эндотоксины (2.6.14) указаны методы исклю-

чения мешающих факторов; в случае наличия мешающих факторов после приме-

нения этого метода должно быть проведено дополнительное испытание с целью

проверки надежности удаления или нейтрализации мешающих факторов.

В данном разделе поясняются причины требований, предъявляемых в испы-

тании на бактериальные эндотоксины, и даются указания, касающиеся регистра-

ции и интерпретации результатов.

Замена требуемого по частной статье испытания на пирогенность с использо-

ванием кроликов на испытание с участием лизата амебоцитов фактически озна-

чает использование альтернативного метода анализа и, поэтому, требует вали-

дации; в подразделе 11 приведены некоторые указания, касающихся практических

действий в данном направлении.

Ссылка на метод, который следует применять для данного продукта, содер-

жится в соответствующих частных статьях; если метод не указан, применяют ме-

тод А. Если используется метод, отличный от предписанного, должно быть про-

демонстрировано, что применяемый метод является подходящим для данного

продукта и дает результат, находящийся в согласии с результатом, получаемым

предписанным методом (см. также подраздел 13).

2. МЕТОД

Несмотря на то, что добавление эндотоксинов к амебоцитному лизату в рас-

творе может приводить к помутнению, осаждению или гелеобразованию, для оп-

ределения конечной точки фармакопейного испытания первого типа использовали

лишь образование гелевого сгустка. Преимуществом являлась простота принятия

решения о том, выдерживает ли продукт испытание, которое обосновывается на-

личием или отсутствием гелеобразования, легко определяемыми невооруженным

глазом. Количественные методы С, D, E и F были разработаны позже; они требу-

ют более сложного оборудования, но легче поддаются автоматизации для регу-

лярного контроля большого количества образцов одного и того же продукта.

Эндотоксины могут адсорбироваться на поверхности пробирок или пипеток,

выполненных из некоторых видов пластика и типов стекла. Могут возникать поме-

хи, обусловленные высвобождением веществ из пластических материалов. По-

этому используемые материалы следует подвергать проверке; последующие пар-

тии пробирок или пипеток могут иметь несколько отличающийся состав, и поэтому

рекомендуется повторять такие испытания при начале работы с новой партией

материала.

Решение об использовании испытания на бактериальные эндотоксины в каче-

стве теста на предельное содержание подразумевает, во-первых, что для испы-

туемого продукта должна быть определена пороговая концентрация эндотоксина

и, во-вторых, что требуется определить, выше или ниже этого порога концентра-

ция эндотоксина в испытуемом продукте. Количественные методы С, D, E и F да-

ют возможность определить концентрацию эндотоксина в образце, но для опре-

деления соответствия Фармакопее и при рутинном контроле качества, основной

вопрос заключается в том, превышает ли эта концентрация установленный пре-

дел.

При установлении пороговой концентрации эндотоксина в испытуемом продук-

те следует уделять должное внимание человеческой дозе этого продукта: цель

должна заключаться в том, чтобы гарантировать, что пока концентрация эндоток-

сина в продукте остается ниже такого порогового значения, даже максимальная

доза, вводимая указанным путем в течение часа, не будет содержать эндотоксин

в количестве, достаточном для возникновения токсической реакции.

Как в случае равенства концентрации эндотоксинов в продукте пороговому

значению, так и в случае значительно больших концентраций, возникает гелеоб-

разование, и продукт не выдерживает испытание, ввиду того, что характер испы-

тания «все или ничего» делает невозможным различение концентрации, в точно-

сти равной пороговой, и более высокой. Вывод о том, что концентрация эндоток-

сина не превышает пороговое значение, можно сделать лишь при отсутствии ге-

леобразования.

Для продуктов, находящихся в твердом состоянии, такая пороговая концентра-

ция эндотоксина на единицу массы или Международную Единицу продукта под-

лежит переводу в концентрацию эндотоксина в миллилитре испытуемого раство-

ра, так как испытание может быть выполнено только с раствором. Случай, когда

продукция уже пребывает в жидком виде (например, инфузионные жидкости), бу-

дет оговорен ниже.

Предельное содержание эндотоксинов: для активных субстанций, предназна-

ченных для парентерального введения, определяется на основании дозы и равно:

где :

К -

допустимая пирогенная доза эндотоксина, вводимая в течение часа на

килограмм массы тела,

М -

максимальная рекомендованная доза продукта, вводимая в течение ча-

са на килограмм массы тела.

Предельное содержание эндотоксинов зависит от продукта и пути его вве-

дения и устанавливается в частных статьях. Предлагаемые значения К приведены

в Таблице 2.6.14.-5.

Таблица 2.6.14.-5

Способ введения

К, в МЕ эндотоксина на кг массы тела в час

Внутривенно

5,0

Внутривенно, для радиофарма-

2,5

цевтических препаратов

Интратекально

0,2

Какое разведение продукта должно быть использовано в испытании для по-

лучения максимальной уверенности в том, что отрицательный результат свиде-

тельствует о том, что концентрация эндотоксина в продукте менее предельной, а

положительный результат означает, что с помощью лизата обнаруживается кон-

центрация, равная или превышающая предельную? Такое разведение зависит от

установленного предела и от чувствительности лизата: для него применяется

термин «максимально допустимое разведение» (МДР), и его значение может быть

вычислено по следующей формуле:

Предельное содержание эндотоксинов¥Концентрация испытуемого раствора

МДР

Концентрация испытуемого раствора:

- в мг/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в массовых

единицах (МЕ/мг),

- в Ед/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в пересче-

те на единицу биологической активности (МЕ/Ед)

- в мл/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в объем-

ных единицах (МЕ/мл).

λ - чувствительность лизата в гель-тромб-методе, указанная на этикетке,

или низшая точка стандартной кривой в турбидиметрических или хромогенных

методах.

В случаях, когда значение максимально допустимого разведения не являет-

ся целочисленным, для рутинных целей может быть использовано подходящее

целое число, меньшее МДР (что означает разведение раствора продукта в степе-

ни, меньшей, чем МДР). В таком случае, отрицательный результат свидетельст-

вует о том, что концентрация эндотоксина в продукте ниже предельного значения.

Однако, когда концентрация эндотоксина в продукте в таком испытании ниже пре-

дельного значения, но достаточно высока для того, чтобы реакция с лизатом при-

вела к образованию сгустка, испытание в таких условиях может дать положитель-

ный результат. Поэтому, когда испытание с использованием такой «удобной» сте-

пени разведения дает положительный результат, продукт следует развести до

МДР и повторить испытание. В любых сомнительных или спорных случаях следу-

ет использовать МДР.

Это подчеркивает важность подтверждения чувствительности лизата.

Пример

Следует провести испытание раствора фенитоина натриевой соли концен-

трацией 50 мг/мл, предназначенного для внутривенного введения. МДР опреде-

ляют, используя следующие значения переменных:

М - максимальная человеческая доза = 15 мг на килограмм массы тела в час.

с = 50 мг/мл.

К = 5 МЕ эндотоксина на килограмм в час.

λ = 0,4 МЕ эндотоксина на миллилитр.

5¥50

МДР

41,67

Для рутинных испытаний этого продукта может быть целесообразно 1 мл ис-

пытуемого раствора разбавить до 20 мл (величина МДР/2, округленная до бли-

жайшего меньшего целого числа). Однако, если испытание дает положительный

результат, следует 1 мл разбавить до 41,67 мл и повторить испытание. Разведе-

ние до 41,67 необходимо также в тех случаях, когда испытание проводится для

разрешения спорной ситуации.

3. СТАНДАРТНЫЙ МАТЕРИАЛ

Стандарт эндотоксина BRP используется в качестве препарата сравнения.

Его количественное определение проводят в сравнении с Международным стан-

дартом эндотоксина ВОЗ, и его активность выражается в МЕ эндотоксина в ампу-

ле. Международная единица эндотоксина определяется как специфическая ак-

тивность определенной массы Международного стандарта.

Для рутинных целей может быть использован другой препарат эндотоксина,

при условии проведения его количественного определения в сравнении с Между-

народным стандартом эндотоксина или BRP, и его активность выражена в МЕ эн-

дотоксина.

Примечание: Одна международная единица (МЕ) эндотоксина эквивалентна

одной единице эндотоксина (ЕЭ).

4. ВОДА ДЛЯ ИБЭ

Определение отсутствия эндотоксина в продукте путем проведения испытания

на пирогенность на кроликах было исключено по практическим и теоретическим

причинам:

4.1. Испытание на кроликах не обладает достаточной чувствительностью для

определения эндотоксина в воде для ИБЭ, предназначенной для проведения ис-

пытаний продуктов с очень низкой предельной концентрацией эндотоксинов;

4.2. Относительно низкая точность температурной реакции у кроликов привела

бы к необходимости проведения большого количества повторных испытаний;

4.3. Термины «пирогены» и «эндотоксины» относятся к группам веществ, кото-

рые не достаточно полно совпадают друг с другом.

В описании испытания на бактериальные эндотоксины указывается, что для

приготовления воды для ИБЭ, кроме трехкратной дистилляции, могут быть ис-

пользованы и другие методы. К хорошим результатам приводило использование

метода обратного осмоса; некоторые аналитики могут предпочесть перегонять

воду более трех раз. Какой бы метод ни использовался, полученный продукт не

должен содержать поддающихся определению эндотоксинов.

5. рН СМЕСИ

Оптимальное гелеобразование смеси при проведении испытания на бактери-

альные эндотоксины достигается при значениях рН от 6,0 до 8,0. Однако, добав-

ление лизата к образцу может привести к снижению рН.

6. ВАЛИДАЦИЯ ЛИЗАТА

При приготовлении растворов лизата важно следовать инструкциям произво-

дителя.

Факторы положительных конечных разведений в методах гелевого сгустка А и

В переводят в логарифмы. Причина этого заключается в том, что если построить

график частотного распределения этих логарифмических значений, то он обычно

намного ближе к кривой нормального распределения, чем частотное распределе-

ние самих факторов разведения; фактически, они настолько близки, что допуска-

ется использование нормального частотного распределения в качестве матема-

тической модели и вычисление границ доверительного интервала с помощью t-

критерия Стьюдента.

7. ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ИСПЫТАНИЕ НА МЕШАЮЩИЕ ФАКТОРЫ

Некоторые продукты не могут быть подвергнуты испытанию на наличие эндо-

токсинов непосредственно, так как они не смешиваются с реактивами, не могут

быть доведены до рН 6,0-8,0 или являются ингибиторами или активаторами геле-

образования. Поэтому требуется проведение предварительного испытания для

проверки наличия мешающих факторов; в случае их обнаружения должно быть

продемонстрировано что, процедура их удаления была эффективной.

Цель предварительного испытания состоит в проверке нулевой гипотезы о том,

что чувствительность лизата в присутствии продукта существенно не отличается

от чувствительности лизата в его отсутствии. В методах А и В используется про-

стой критерий: нулевая гипотеза принимается, если чувствительность лизата в

присутствии продукта составляет не менее 50% и не более 200% чувствительно-

сти самого лизата.

В соответствии с классическим подходом, следует вычислить среднее значе-

ние логарифма коэффициента разведения для чувствительности в присутствии и

отсутствии продукта и оценить разницу между двумя средними значениями с по-

мощью t-критерия Стьюдента.

Испытание на мешающие факторы в методах гелевого сгустка А и В требует

использования образца продукта, в котором отсутствуют эндотоксины в поддаю-

щейся определению концентрации. Это представляет теоретическую проблему

при испытании абсолютно новых продуктов. Поэтому для количественных мето-

дов С, D, Е и F был разработан другой подход.

8. ИСКЛЮЧЕНИЕ МЕШАЮЩИХ ФАКТОРОВ

Методика удаления мешающих факторов не должна приводить к уменьшению

или увеличению количества эндотоксинов в испытуемом продукте (например,

вследствие адсорбции). Корректный способ проверки этого состоит в применении

методики к обогащенному образцу продукта, т.е. к образцу, к которому было до-

бавлено известное количество эндотоксина, с дальнейшим измерением его воз-

врата.

Методы С и D. Если помехи обусловлены природой анализируемого продукта

и не могут быть исключены классическими методами, может оказаться возмож-

ным построение стандартной кривой с использованием продукта того же типа,

разбавленного или обработанного соответствующим образом для очистки от эн-

дотоксинов. Испытание на эндотоксины может быть проведено с использованием

полученной кривой.

Определено, что в большинстве случаев ультрафильтрация с использованием

асимметрических мембранных фильтров, описанная в испытании на бактериаль-

ные эндотоксины, приводит к адекватным результатам. Фильтры должны пройти

соответствующую валидацию в связи с тем, что производные целлюлозы (β-D-

гликаны) при некоторых обстоятельствах могут обусловить получение ложных по-

ложительных результатов.

Установлено, что полисульфоновые фильтры, упоминавшиеся в предшест-

вующем описании, являются непригодными, так как при их использовании были

получены ложные положительные результаты.

9. ЦЕЛЬ ПРОВЕДЕНИЯ КОНТРОЛЬНЫХ ИСПЫТАНИЙ

Цель контроля, содержащего воду для ИБЭ и стандартный препарат эндоток-

сина с концентрацией, в два раза превышающей чувствительность лизата, ука-

занную на этикетке, состоит в проверке активности лизата в условиях испытания

во время его проведения. Целью отрицательного контроля является подтвержде-

ние отсутствия поддающейся определению концентрации эндотоксина в воде для

ИБЭ.

Положительный контроль, в котором содержится испытуемый продукт в кон-

центрации, используемой при проведении испытания, предназначен для демонст-

рации отсутствия мешающих факторов в условиях испытания во время его прове-

дения.

10. РЕГИСТРАЦИЯ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Незначительные количества эндотоксина в воде для ИБЭ или в любом другом

реагенте или материале, с которым лизат находится в контакте в ходе испытания,

могут не определятся до тех пор, пока они не достигнут предела чувствительности

лизата. Однако, они могут увеличить количество эндотоксина в растворе, содер-

жащем испытуемый продукт, до значения, слегка превышающего предел чувстви-

тельности, и вызвать положительную реакцию.

Риск того, что это произойдет, может быть уменьшен путем проверки воды для

ИБЭ и других реагентов и материалов с использованием наиболее чувствительно-

го лизата из имеющихся в наличии, или, по крайней мере, более чувствительного,

чем лизат, использованный при проведении испытания продукта. Даже в этом

случае риск такого «ложного положительного результата» не может быть полно-

стью исключен. Следует, однако, понимать, что в этом отношении методика испы-

тания является безопасной, в отличие от методики испытания, допускающей лож-

ный отрицательный результат, который может привести к выпуску недоброкачест-

венного продукта, опасного для здоровья пациента.

11. ЗАМЕНА ИСПЫТАНИЯ НА ПИРОГЕННОСТЬ НА КРОЛИКАХ ИСПЫТАНИЕМ

НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ

В частных статьях, касающихся фармацевтической продукции, предназначен-

ной для парентерального применения, которая может содержать токсические ко-

личества бактериальных эндотоксинов, содержатся требования о проведении ис-

пытания либо на бактериальные эндотоксины, либо на пирогенность с использо-

ванием кроликов. В общем случае:

11.1. В любой частной статье при необходимости проведения подобного испыта-

ния содержится только один тест, либо на пирогенность, либо на бактериаль-

ные эндотоксины.

11.2. При отсутствии доказательств обратного, испытание на бактериальные эн-

дотоксины является предпочтительным по отношению к испытанию на пиро-

генность, так как обычно оно обеспечивает равную или лучшую защиту паци-

ента.

11.3. Перед включением испытания на бактериальные эндотоксины в частную

статью должны быть получены доказательства того, что один из методов, опи-

санных в разделе 2.6.14, является подходящим для испытания данного про-

дукта.

11.4. Необходимую информацию предоставляют производители. Приветствуется

предоставление компаниями любых имеющихся подтверждающих данных, ка-

сающихся применимости испытания на бактериальные эндотоксины к интере-

сующим субстанциям и готовым формам. К таким данным относятся методы

подготовки образцов и процедуры, необходимые для исключения мешающих

факторов. Кроме того, должны быть предоставлены любые доступные парал-

лельные данные по проведению испытания на пирогенность с использовани-

ем кроликов, которые могли бы подтвердить возможность замены испытания

на пирогенность тестом на бактериальные эндотоксины.

Дополнительные требования приведены в следующих подразделах.

12. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ИСПЫТАНИЯ НА БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОК-

СИНЫ, ОТЛИЧНОГО ОТ ПРЕДПИСАННОГО В ЧАСТНОЙ СТАТЬЕ

Если в частной статье предписывается проведение испытания на бактери-

альные эндотоксины, и не указан ни один из методов (А-F), описанных в разделе

2.6.14, то для данного продукта была подтверждена пригодность метода А (пре-

дельное испытание методом гелевого сгустка). Если указан один из других мето-

дов (В-F), то для этого продукта была подтверждена пригодность указанного ме-

тода.

13. ВАЛИДАЦИЯ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ МЕТОДОВ

Замена испытания на пирогенность на кроликах тестом на бактериальные

эндотоксины, а также замена установленного или подразумеваемого метода оп-

ределения бактериальных эндотоксинов другим следует считать использованием

альтернативного метода взамен фармакопейного испытания. Общее положение

по использованию альтернативного метода взамен фармакопейного теста приве-

дено в разделе «Общие положения»:

«Описанные испытания и методики количественного определения являются

официальными методами, на которых основаны стандарты Фармакопеи. По со-

глашению с компетентными органами в целях контроля могут использоваться

альтернативные методы анализа, при условии, что используемые методы позво-

ляют сделать определенное заключение о том, может ли быть достигнуто согла-

сие со стандартами статей, если бы были использованы официальные методы. В

сомнительных и спорных случаях единственными надежными методами считают

методы, приведенные в Фармакопее».

Для валидации метода испытания на бактериальные эндотоксины, отличного

от подразумеваемого или указанного в частной статье, предлагаются следующие

процедуры.

13.1. Процедура, материалы и реагенты, используемые при проведении испыта-

ния с применением лизата амебоцитов, должны пройти валидацию в соответ-

ствии с указаниями, приведенными в испытании на бактериальные эндотокси-

ны.

13.2. Должно быть проведено испытание на наличие мешающих факторов (и, при

необходимости, процедура по их исключению) на образцах, отобранных, по

меньшей мере, из трех партий продукции. Следует иметь в виду, что в мето-

дах D и Е, использующих хромогенный пептид, требуются реагенты, не ис-

пользуемые в методах А, В, С и F, и поэтому соответствие методов А, В, С и F

требованиям, предъявляемым к мешающим факторам, не может быть без со-

ответствующего подтверждения экстраполировано на методы D и Е.

14. ВАЛИДАЦИЯ ИСПЫТАНИЯ ДЛЯ НОВЫХ ПРОДУКТОВ

Процедуры, описанные в пунктах 13.1 и 13.2, должны быть выполнены для

всех новых продуктов, предназначенных для парентерального применения, кото-

рые, в соответствии с требованиями Фармакопеи, должны быть подвергнуты ис-

пытанию на наличие бактериальных эндотоксинов.

2.6.15. АКТИВАТОР ПРЕКАЛЛИКРЕИНА

Активатор прекалликреина (АПК) активирует прекалликреин, переводя его в

калликреин, и может быть определен по его способности к отщеплению хромофо-

ра от синтетического пептидного субстрата в условиях, позволяющих определять

скорость распада спектрофотометрическим методом; концентрация АПК вычис-

ляется путем сравнения со стандартным препаратом, калиброванным в Междуна-

родных Единицах.

За Международную Единицу принята активность установленного количест-

ва Международного Стандарта, представляющего собой лиофильно высушенный

активатор прекалликреина. Эквивалентность Международного Стандарта в Меж-

дународных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохране-

ния.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ СУБСТРАТА ПРЕКАЛЛИКРЕИНА

Для предотвращения активации коагуляции кровь или плазма, используе-

мая для приготовления прекалликреина, должна контактировать только с пла-

стиком или стеклянными поверхностями, обработанными силиконом.

9 объемов человеческой крови приливают к 1 объему антикоагулянтного

раствора (ACD, CPD или раствора цитрата натрия R концентрацией 38 г/л), к

которому добавлен гексадиметрина бромид R в количестве 1 мг/мл. Смесь цен-

трифугируют при 3600 g в течение 5 минут. Отделяют плазму и снова центрифу-

гируют при 6000 g в течение 20 минут для осаждения тромбоцитов. Плазму с

уменьшенным содержанием тромбоцитов отделяют и подвергают диализу против

10 объемов буфера А в течение 20 часов. Диализированную плазму наносят на

хроматографическую колонку, содержащую агарозу-DEAE для ионообменной

хроматографии R, уравновешенную с помощью буфера А, в количестве, равном

двойному объему плазмы. Колонку элюируют буфером А со скоростью

мл/см²/ч. Собирают фракции элюата, регистрируя оптическую плотность при 280

нм (2.2.25). Фракции, содержащие первый пик белка, объединяют таким образом,

чтобы объем объединенных фракций составлял 120% объема плазмы с понижен-

ным содержанием тромбоцитов.

Проверяют отсутствие калликреиновой активности в объединенном раство-

ре субстрата, смешивая его в соотношении 1:20 с предварительно подогретым

раствором хромогенного субстрата, который будет использоваться в определе-

нии, и инкубируют при 37⁰С в течение 2 минут. Субстрат может быть использован

в испытании, если увеличение оптической плотности составляет менее 0,001 еди-

ницы в минуту. К собранному раствору добавляют натрия хлорид R в количестве

7 г/л и фильтруют через мембранный фильтр (пористость 0,45 мкм). Порции суб-

страта замораживают и хранят при температуре -25⁰С; субстрат перед хранением

может быть подвергнут высушиванию из замороженного состояния.

Все процедуры от начала хроматографии до заморозки порций субстрата

выполняют в течение одного рабочего дня.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Определение предпочтительно выполнять с использованием автоматиче-

ского анализатора ферментов при температуре 37⁰С, используя такие объемы,

концентрации субстратов и времена инкубации, чтобы скорость реакции находи-

лась в линейной зависимости, по крайней мере, до концентрации 35 МЕ/мл. Стан-

дарты, образцы и субстрат прекалликреина могут быть при необходимости раз-

бавлены буфером В.

Разбавленные стандарты или образцы инкубируют с субстратом прекал-

ликреина в течение 10 минут так, чтобы объем неразбавленного образца не пре-

вышал 1/10 общего объема инкубируемой смеси, во избежание ошибок, связан-

ных с изменением ионной силы и показателя рН инкубируемой смеси. Смесь или

ее часть инкубируют не менее, чем с равным объемом раствора подходящего

синтетического хромогенного субстрата с установленной специфичностью к кал-

ликреину

(например,

N-бензоил-L-пролил-L-фенилаланил-L-аргинина

нитроанилида ацетата R или D-пролил-L-фенилаланил-L-аргинина

нитроанилида дигидрохлорида R), растворенного в буфере В. Регистрируют ско-

рость изменения оптической плотности в минуту в течение промежутка времени

от 2 до 10 минут при длине волны, специфичной для используемого субстрата.

Для каждой смеси образца или стандарта готовят контроль, в котором вместо

субстрата прекалликреина содержится буфер В.

Вносят поправки в значение DА/мин, вычитая результат, полученный для

соответствующего контроля. Строят калибровочную кривую, используя значения,

полученные таким образом для препарата сравнения в соответствующих концен-

трациях; используют полученную кривую для определения активности АПК в ис-

пытуемом препарате.

Буфер А

Трис-(гидроксиметил)-аминометан R

6,055 г

Натрия хлорид R

1,17 г

Гексадиметрина бромид R

50 мг

Натрия азид R

0,100 г

Растворяют ингредиенты в воде R, доводят значение рН до 8,0 с помощью

2М хлористоводородной кислоты и разбавляют до 1000 мл водой R.

Буфер В

Трис-(гидроксиметил)-аминометан R

6,055 г

Натрия хлорид R

8,77 г

Растворяют ингредиенты в воде R, доводят значение рН до 8,0 с помощью

2М хлористоводородной кислоты и разбавляют до 1000 мл водой R.

2.6.16. ИСПЫТАНИЯ НА ПОСТОРОННИЕ АГЕНТЫ В ВИ-

РУСНЫХ ВАКЦИНАХ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Если для проведения испытания требуется предварительная нейтрализа-

ция вируса, используют специфические антитела, не происходящие от человека

или обезьян; если выращивание вируса производилось на тканях птичьего проис-

хождения, то антитела не должны, кроме того, происходить от птиц. Для приго-

товления антисыворотки используют иммунизирующий антиген, произведенный

клеточной культурой, имеющей происхождение, отличное от происхождения вак-

цины, и не содержащей посторонних агентов. Если предписано использование

яиц SPF, яйца отбирают из групп, не содержащих указанные патогены (5.2.2).

ВИРУСНЫЙ ПОСЕВНОЙ МАТЕРИАЛ

Образцы вирусного посевного материала отбирают во время его сбора и,

если их не подвергают испытанию немедленно, хранят при температуре ниже -

40⁰С.

Половозрелые мыши. Каждой из не менее 10 половозрелых мышей мас-

сой от 15 до 20 г вводят интрацеребрально 0,03 мл и внутрибрюшинно 0,5 мл ви-

русного посевного материала. Мышей наблюдают в течение не менее 21 дня.

Производят вскрытие всех мышей, погибших или имеющих симптомы заболева-

ния по окончании первых 24 часов испытания, и исследуют их на наличие призна-

ков вирусной инфекции как путем прямого макроскопического осмотра, так и пе-

репрививкой подходящих суспензий тканей интрацеребральным и внутрибрюшин-

ным методами дополнительно не менее, чем пяти мышам, которых наблюдают в

течение 21 дня. Вирусный посевной материал выдерживает испытание, если ни

одна мышь не обнаруживает симптомов инфекции, которая может быть вызвана

посевным материалом. Результаты испытания считают достоверными, если не

менее 80% привитых мышей выживают в течение периода наблюдения.

Новорожденные мыши. Каждой из не менее 20 мышей возрастом менее

24 часов вводят интрацеребрально 0,01 мл и внутрибрюшинно не менее 0,1 мл

вирусного посевного материала. Мышей наблюдают ежедневно в течение не ме-

нее 14 дней. Производят вскрытие всех мышей, погибших или имеющих симптомы

заболевания по окончании первых 24 часов испытания, и исследуют их на нали-

чие признаков вирусной инфекции как путем прямого макроскопического осмотра,

так и перепрививкой подходящих суспензий тканей интрацеребральным и внутри-

брюшинным методами дополнительно не менее, чем пяти новорожденным мы-

шам, которых наблюдают ежедневно в течение 14 дней. Вирусный посевной ма-

териал выдерживает испытание, если ни одна мышь не обнаруживает симптомов

инфекции, которая может быть вызвана посевным материалом. Результаты испы-

тания считают достоверными, если не менее 80% привитых мышей выживают в

течение периода наблюдения.

Морские свинки. Каждой из не менее 5 морских свинок массой от 350 до

450 г вводят внутрибрюшинно 5,0 мл вирусного посевного материала. Животных

наблюдают в течение не менее 42 дней, отмечая наличие симптомов заболева-

ния. Производят вскрытие всех морских свинок, погибших или имеющих симптомы

заболевания по окончании первых 24 часов испытания, и исследуют их макроско-

пически; ткани исследуют как микроскопически, так и культурально, отмечая нали-

чие признаков инфекции. Животных, выживших в течение периода наблюдения,

умерщвляют и исследуют аналогичным образом. Вирусный посевной материал

выдерживает испытание, если ни одна морская свинка не обнаруживает призна-

ков инфекции, которая может быть вызвана посевным материалом. Результаты

испытания считают достоверными, если не менее 80% морских свинок выживают

в течение периода наблюдения.

ВИРУСНЫЙ ПОСЕВНОЙ МАТЕРИАЛ И ВИРУСНЫЕ СБОРЫ

Образцы отбирают во время сбора и, если их не подвергают испытанию

немедленно, хранят при температуре ниже -40⁰С.

Бактериальная и грибковая стерильность. Образец объемом 10 мл дол-

жен выдерживать испытание на стерильность (2.6.1).

Микоплазмы. Образец объемом 10 мл должен выдерживать испытание на

микоплазмы (2.6.7).

Микобактерии (2.6.2). Образец объемом 5 мл подвергают испытания на

наличие Mycobacterium spp. методами культивирования, обладающими известной

чувствительностью в отношении определения этих организмов.

Испытание клеточной культуры на другие посторонние агенты. Ней-

трализованные образцы, эквивалентные 500 человеческим дозам, но не менее 50

мл, если иные количества не предписаны в частной статье, испытывают на при-

сутствие посторонних агентов путем введения в непрерывные почечные обезья-

ньи и человеческие клеточные культуры. Если вирус выращен на человеческих

диплоидных клетках, нейтрализованный вирусный сбор также испытывают на от-

дельной культуре диплоидных клеток. Если вирус вакцины выращен не на чело-

веческой либо обезьяньей клеточной системе, то производят также инокуляцию

клеток данного вида из отдельной партии. Клетки инкубируют при температуре

36±1⁰С и наблюдают в течение 14 дней. Вирусный посевной материал или сбор

выдерживает испытание, если ни в одной из клеточных культур не обнаруживает-

ся признаков любых посторонних агентов, не внесенных в результате случайной

контаминации. Результаты испытания считают достоверными, если не менее 80%

клеточных культур остаются жизнеспособными.

Птичьи вирусы (требуется только для вирусов, выращенных на тканях

птичьего происхождения). Нейтрализуют образец, эквивалентный 100 челове-

ческим дозам, но не менее 10 мл. Используя по 0,5 мл на каждое яйцо, инокули-

руют группу оплодотворенных яиц SPF возрастом от 9 до 11 дней аллантоисным

путем, а другую группу, возрастом от 5 до 7 дней, - в желточный мешок. Инкуби-

руют в течение 7 дней. Вирусный посевной материал или сбор выдерживает ис-

пытание, если в аллантоисных жидкостях и жидкостях желточных мешков не об-

наруживаются гемагглютинирующие агенты и если ни один из эмбрионов и хорио-

аллантоисных мембран не обнаруживает макроскопической патологии. Результа-

ты испытания считают достоверными, если не менее 80% привитых яиц выживают

в течение 7 дней.

ПРОИЗВОДСТВЕННАЯ КЛЕТОЧНАЯ КУЛЬТУРА: КОНТРОЛЬНЫЕ КЛЕТКИ

Контрольные клетки изучают под микроскопом на отсутствие любой цитопа-

тической дегенерации вирусного происхождения. Изучение проводят в течение

периода инкубации, но не менее, чем в течение 14 дней после инокуляции. Ре-

зультаты испытания считают достоверными, если не менее 80% контрольных кле-

точных культур выживают в течение периода наблюдения.

В момент последнего сбора вирусов, но не ранее, чем на 14-й день, выпол-

няют нижеописанные испытания.

Испытание на гемадсорбирующие вирусы. Не менее 25% контрольных

культур испытывают на наличие гемадсорбирующих вирусов путем добавления

эритроцитов морских свинок. При необходимости, эритроциты морских свинок

можно хранить при температуре 5±3⁰С в течение не более 7 дней. Состояние по-

ловины культур оценивают после инкубации при температуре 5±3⁰С в течение 30

минут, а состояние другой половины - после инкубации при температуре от 20 до

25⁰С в течение 30 минут. Признаков присутствия гемадсорбирующих агентов не

должно обнаруживаться.

Испытание клеточных культур на другие посторонние агенты. Собира-

ют супернатанты контрольных клеток и испытывают на присутствие посторонних

агентов путем введения в почечные обезьяньи и человеческие клеточные культу-

ры. Если вирус вакцины выращен не на человеческой или обезьяньей клеточной

системе, то производят также инокуляцию клеток данного вида, но из отдельной

партии. На каждой клеточной системе испытывают не менее 5 мл. Инокулирован-

ные культуры инкубируют при температуре 36±1⁰С и наблюдают в течение 14

дней. Признаков присутствия посторонних агентов не должно обнаруживаться.

Если производственная клеточная культура поддерживается при темпера-

туре, отличной от 36±1⁰С, выполняют дополнительное испытание на посторонние

агенты при этой температуре с использованием клеток того же типа, который ис-

пользуется для выращивания вируса.

КОНТРОЛЬНЫЕ ЯЙЦА

Гемагглютинирующие агенты. По 0,25 мл аллантоисной жидкости каждого

из яиц испытывают на гемагглютинирующие агенты путем непосредственного

смешивания с куриными красными кровяными тельцами и после засева яиц SPF,

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАКОПЕЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ (ПЕРВОЕ ИЗДАНИЕ, 2006 год) - часть 18