Экспресс-тест Test Milkpro 4D на антибиотики. Руководство

Экспресс-тест Test Milkpro 4D на антибиотики. Руководство

Экспресс-тест для определения р-лактамной группы, тетрациклиновой группы, стрептомицина и хлорамфеникола в молоке.

Область применения

Тест-набор «Test Milkpro 4D» предназначен для одновременного определения в молоке 4-х групп антибиотиков - в-лактамной группы, тетрациклиновой группы, стрептомицина и хлорамфеникола. Метод основан на связывании антибиотиков, находящихся в анализируемом продукте, с антителами, вызывающими окрашиваемую иммунохроматографическую реакцию с последующим определением интенсивности окраски продуктов биохимической реакции визуальным методом или инструментально с применением специального считывающего устройства TRS-20. Время анализа 10 минут.

Предназначен для тестирования

1. Сырого, стерилизованного, пастеризованного и сухого молока с содержанием жира не более 6%

2. Коровьего, буйволиного, овечьего, козьего и кобыльего молока с содержанием жира не более 6%

Пределы обнаружения / Чувствительность: LOD (мкг/дм3)

Наименование

антибиотика

LOD

Наименование

антибиотика

LOD

1. (3-лактамная группа

Амоксициллин

2-3

Цефазолин

15-20

Ампициллин

2-3

Цефалониум

3-5

Диклоксациллин

3-6

Цефапирин

5-8

Клоксациллин

3-6

Цефацетрил

20-25

Нафциллин

8-10

Цефкином

5-7

Оксациллин

5-7

Цефоперазон

3-5

Пенициллин G

2-3

Цефтиофур

80-100

2. Тетрациклиновая группа

Доксициклин

7-10

Тетрациклин

7-10

Окситетрациклин

7-10

Хлортетрациклин

7-10

3. Стрептомицин

80-100

Дигидрострептомицин

50-60

4. Хлорамфеникол

0.2-0.3

Условия хранения и срок годности

Хранить при температуре 2-8 С0. Не замораживать. Избегать попадания прямых солнечных лучей, повышенной влажности и нагрева. Срок годности: 12 месяцев.

Тест-набор включает

1. 12 пластиковых туб, в составе которых 8 микролунок с реагентом и 8 тест-полосок

2. 1 дозатор (0,200дм3) и 100 наконечников

3. Позитивный и негативный стандарты

4. 1 инструкцию

Необходимые материалы (могут быть поставлены опционально)

1. Инкубатор (поддерживающий температуру 40±2 °С)

2. Считывающее устройство TRS-20

3. Подставка и таймер

Подготовка

1. Включите инкубатор и дождитесь пока температура не стабилизируется до 40 °С.

2. Достаньте тестовый комплект из холодильника, чтобы он нагрелся до комнатной температуры (15-30 °С)

3. Возьмите необходимое количество микролунок и тестовых полосок из тубы

4. Хорошо размешайте образцы молока до тестирования

5. Сухое молоко должно быть разбавлено водой в соотношении 1:9 (т.е. 10 г сухого молока разбавляется с 90 мл дистиллированной воды, и размешивается до получения гомогенизированного образца)

Выполнение тестирования

1. Добавьте 0,200 см3 молока в микролунку с реагентом и хорошо перемешайте дозатором вверх-вниз 5-10 раз, до получения гомогенизированного образца

2. Инкубируйте 5 минут при температуре (40±2) °С

3. Поместите тест-полоску под углом в микролунку после первой инкубации. Инкубируйте образец еще 5 минут при температуре (40±2)°С

4. Достаньте тест-полоску из микролунки, удалите пористую пластину в нижней части полоски и прочитайте результат в течении 5 минут. Результат недействителен по истечении 5 минут.

Интерпретация результатов

Визуальная

1. Проверьте наличие верхней контрольной линии (С line). Если контрольная линия (С line)

видна, то сравните ее с интенсивностью цветов линий (Tl, Т2, ТЗ и Т4 lines), в
соответствии с таблицей ниже.

2. Если контрольная линия (С line) не видна, тест недействителен

Тестовая (Т) и контрольная (С) линии

Интерпретация

результата

Результат анализа

Т>С

Отрицательный

Образец не содержит антибиотиков или их уровень находится в предельных значениях

Т = С

Граничная зона

Образец содержит антибиотики в количестве близком к предельным значениям

Т < С или нет Т

Положительный

Образец содержит антибиотики в количестве выше предельных значений

С помощью считывающего устройства TRS-20

1. Изучите инструкцию по эксплуатации считывающего устройства TRS-20

2. Отрицательный: R>1.1, Граничная зона: 0.9<R<1.1, Положительный: R<0.9.

Проведение контрольного измерения

Негативный стандарт: Добавьте 0,200 см3 дистиллированной воды в микролунку и размешайте до гомогенизированного образца. Образец готов для тестирования.

Позитивный стандарт: Добавьте 0,200 см3 молока без антибиотиков в микролунку и размешайте до гомогенизированного образца. Образец готов для тестирования. Концентрация указана на упаковке и может быть изменена путем разбавления.

Заметка: Оба восстановленных стандарта необходимо поместить в микролунку с реагентом и следовать процедуре тестирования.
Меры предосторожности

1. Рекомендуется работать на чистом столе и мыть руки перед работой с тестами, во избежание загрязнений, т.к. тесты чувствительны к антибактериальным веществам.

2. Молоко должно быть хорошо размешано и не иметь сгустков или осадка. Образец должен размешиваться непосредственно перед использованием.

3. Не используйте микролунки и тест-полоски из разных пластиковых туб. По истечении срока годности тесты являются непригодными.

4. Пластиковые тубы с микролунками и тест-полосками должны быть закрыты после их извлечения. Расходуйте содержимое полностью, затем открывайте новую тубу. Открытую тубу необходимо израсходовать в течение недели.

5. Наконечники для пипеток являются одноразовыми.

6. Аккуратно и плавно размешивайте образцы, чтобы избежать попадания молока в дозатор и его возможного загрязнения позитивным образцом.

7. Держите тест-полоски за верхнюю абсорбирующую часть. Не прикасайтесь к средней и нижней частям тест-полосок (пористая подложка и нитроцеллюлозная мембрана), т.к. это может привести к потере качества тестирования.

8. После второй инкубации прочитайте результат в течение 5 минут. Результат

недействителен по истечении 5 минут.

9. При высоком содержании жира в образце, скорость движения образца по тест-полоске будет ниже. В данных случаях рекомендуется увеличить продолжительность второй инкубации на 60 секунд.

10. При обнаружении антибиотиков повторите тестирование для двойной проверки.

11. Если на тестовых линиях имеются очевидные прерывания, повторите тестирование.

12. Тест-полоски используются для первичной проверки и окончательный результат должен быть подтвержден арбитражным методом.

Выполнение тестирования

1. Добавьте 0,200 см3 молока в микролунку с реагентом и хорошо перемешайте дозатором вверх-вниз 5-10 раз

2. Поместите микролунку в инкубатор на 5 минут, при температуре (40±2) °С

3. После первой инкубации поместите тест-полоску в микролунку. Инкубируйте еще раз 5 минут, при температуре (40±2)°С

4. Достаньте тест-полоску из микролунки, удалите пористую пластину в нижней части полоски и прочитайте результат

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ по определению наличия остаточного содержания антибиотиков в молоке с применением тест-набора «Test Milkpro 4D» производства компании Shenzhen Bioeasy Biotechnology Co., Ltd, - 2019 год

1 Область применения

Настоящие методические рекомендации распространяются на молоко сырое и устанавливают иммуноферментный метод одновременного определения наличия остаточного содержания антибиотиков (3-лактамной группы, тетрациклиновой группы, стрептомицина и хлорамфеникола с применением тест-набора «Test Milkpro 4D» производства компании Shenzhen Bioeasy Biotechnology Co., Ltd. (Китай).

2 Термины и определения

В настоящих рекомендациях приведены следующие термины и их определения:

2.1 метод иммуноферментного анализа: Иммунохимический метод определения низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция «антиген-антитело». Для выявления образовавшегося комплекса в качестве метки для регистрации сигнала применяют специфический для каждой реакции фермент или ферментзависимое вещество.

2.2 тест-система: Набор (комплект) специально подобранных реагентов (реактивов) и составных частей, предназначенный для определения одного или нескольких конкретных веществ.

3 Требования к показателям точности измерений

Настоящие методические рекомендации устанавливают следующие пределы обнаружения остаточного содержания антибиотиков в молоке.

Таблица 1

Наименование антибиотика

Предел обнаружения, мкг/дм³

1

2

Антибиотики Р-лактамной группы

Амоксициллин

2-3

Ампициллин

2-3

Диклоксациллин

3-6

1

2

Клоксациллин

3-6

Нафциллин

8-10

Оксациллин

5-7

Пенициллин-G

1,5-2

Цефазолин

15-20

Цефалониум

3-5

Цефапирин

5-8

Цефацетрил

20-25

Цефкином

5-7

Цефоперазон

3-5

Цефтиофур

80-100

Антибиотики тетрациклиновой группы

Доксициклин

7-10

Окситетрациклин

7-10

Тетрациклин

7-10

Хлортетрациклин

7-10

Стрептомицин

80-100

Дигидрострептомицин

50-60

Хлорамфеникол

0,2-0,3

4 Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы:

Тест-набор «Test Milkpro 4D» для определения наличия остаточного содержания антибиотиков в-лактамной группы, тетрациклиновой группы, стрептомицина и хлорамфеникола в молоке производства компании Shenzhen Bioeasy Biotechnology Co., Ltd, Китай, включающий:

- пластины с микролунками, содержащими реагент;

- тест-полоски;

- микролунки, содержащие «Положительный контроль», включающий ампициллин (4 мкг/кг), тетрациклин (10 мкг/кг), стрептомицин (200 мкг/кг) и хлорамфеникол (0,3 мкг/кг);

- микролунки, содержащие «Отрицательный контроль», включающий сухое молоко, свободное от антибиотиков;

дозатор пипеточный (пипет-дозатор) фиксированного объема дозирования 0,200 см3 с наконечниками.

Считывающее устройство для тест-полосок TSR-20 производства компании Shenzhen Bioeasy Biotechnology Co., Ltd, Китай/

Термостат-инкубатор MiniT-N производства компании Shenzhen Bioeasy Biotechnology Co., Ltd, Китай

Термометр лабораторный жидкостной диапазоном измерения от 0 °С до 100 °С, ценой деления шкалы 1 °С по ГОСТ 28498.

Часы электронно-механические по ГОСТ 27752.

Баня водяная термостатируемая.

Стакан В-1-100(250) ТС по ГОСТ 25336.

Палочки стеклянные оплавленные.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

5 Сущность метода

Метод основан на связывании антибиотиков, находящихся в анализируемом продукте, с антителами, вызывающими окрашиваемую иммунохроматографическую реакцию с последующим определением интенсивности окраски продуктов биохимической реакции визуальным методом или инструментально с помощью специального считывающего устройства -ридера.

Наличие антибиотиков устанавливают в результате сравнения интенсивности окрашивания зоны тест-полоски, соответствующей анализируемому продукту, с интенсивностью окрашивания контрольной зоны тест-полоски.

6 Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

температура окружающего воздуха от 15 °С до 30 °С;

относительная влажность воздуха менее 90 %;

атмосферное давление (95 ±10) кПа.
7 Отбор проб и подготовка их к измерениям

Отбор проб и подготовка их к измерениям - по ГОСТ Р ИСО 707, ГОСТ 13928, ГОСТ 26809.1.

Если измерение не может быть проведено сразу после отбора проб, неконсервированные пробы хранят в холодильнике при температуре (4±2) °С не более 36 часов.

Титруемая кислотность исследуемого молока сырого не должна превышать 21,0 °Т.

8 Подготовка к выполнению измерений

8.1 Подготовка тест-набора к проведению измерений

Перед использованием тест-набор вынимают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре не менее 15 мин, избегая воздействия влаги и солнечного света.

На всех этапах проведения измерений необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.

8.2 Подготовка термостата-инкубатора к работе

Подготовку, вывод прибора на режим, проводят в соответствии с Инструкцией, прилагаемой к прибору. Температуру термостата-инкубатора устанавливают на значении (40±2) °С

8.3 Подготовка пробы анализируемого продукта

Пробы молока перемешивают, переворачивая посуду с пробами не менее трех раз или переливая продукт в другую посуду и обратно не менее двух раз.

9 Выполнение измерений

Пробу анализируют два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-1 (пункт 3.14).

9.1 Из тубы извлекают необходимое количество микролунок, содержащих реагент.

Пипет-дозатором с одноразовым наконечником отбирают 0,200 см3 анализируемого продукта, подготовленного по 8.3, и переносят в микролунки, содержащие реагент. Содержимое микролунок перемешивают путем десятикратного пипетирования образца с реагентом.

9.2 Микролунки с анализируемым продуктом помещают в термостат-инкубатор и инкубируют при температуре (40±2) °С в течение 5 минут.

9.3 Из тубы извлекают необходимое количество тест-полосок, не касаясь области контрольной/тестовой линии, после чего тубу сразу же закрывают.

Тест-полоски помещают в микролунки с анализируемым продуктом и продолжают инкубирование при температуре (40±2) °С еще в течение 5 минут.

9.4 По окончании инкубирования тест-полоски вынимают из микролунок, удаляют с них подложки (пористая пластина в нижней части полоски) и сразу же считывают результат.

9.5 Проведение контрольного измерения

Контрольные измерения проводят для подтверждения чувствительности и контроля качества тест-набора, используя «Положительный» и «Отрицательный» контрольные образцы.

9.5.1 В микролунки, содержащие смесь «Отрицательный контроль», вносят 0,200 см3 дистиллированной воды. Содержимое микролунок перемешивают путем десятикратного пипетирования полученной смеси. Стандартный раствор «Отрицательный контроль» готов для тестирования.

9.5.2 В микролунки, содержащие смесь «Положительный контроль», вносят 0,200 см сырого молока, не содержащего антибиотиков. Содержимое микролунок перемешивают путем десятикратного пипетирования полученной смеси. Стандартный раствор «Положительный контроль» готов для тестирования.

Примечание - Концентрацию стандартного раствора «Положительный контроль» можно изменять путем разбавления.

9.5.3 В микролунки, содержащие реагент, вносят по 0,200 см3 стандартных растворов «Отрицательный контроль», приготовленного по 9.5.1, и/или «Положительный контроль», приготовленного по 9.5.2. Содержимое микролунок

перемешивают путем десятикратного пипетирования и проводят измерения согласно 9.2-9.4.

10 Обработка результатов измерений

Обработку результатов проводят в течение 5 минут после окончания проведения второго инкубирования, при этом необходимо удалить с тест-полоски подложку (пористую пластину в нижней части полоски).

10.1 Визуальная обработка результатов измерений

Интерпретация результатов анализа проводится визуально путем сравнения интенсивности окрашивания тестовых линий, соответствующих антибиотикам Р-лактамной и тетрациклиновой групп, стрептомицина и хлорамфеникола на тест-полоске, по отношению к контрольной линии.

Вид тест-полоски с действительным результатом визуальной оценки анализа приведен на рисунке 1.

Рисунок 1 - Вид тест-полоски с действительным результатом визуальной оценки анализа
Линия С - контрольная линия;

Линия Т1 - соответствует антибиотикам р-лактамной группы; Линия Т2 — соответствует стрептомицину;

Линия ТЗ — соответствует хлорамфениколу.

Линия Т4 — соответствует антибиотикам тетрациклиновой группы;

Верхняя контрольная линия (линия С) должна проявляться всегда. Если контрольная линия отсутствует, размыта, неровная или неравномерно окрашена, результат анализа считается недействительным. В этом случае проводят повторное измерение с новыми тест-полосками.

Зона определения антибиотиков (тестовые линии Tl, Т2, ТЗ и Т4) на тест-полоске расположена под контрольной линией (линия С). Тестовая линия Т1 соответствует антибиотикам р-лактамной группы, тестовая линия Т2 соответствует стрептомицину, тестовая линия ТЗ соответствует хлорамфениколу, тестовая линия Т4 соответствует антибиотикам тетрациклиновой группы.

Если тестовые линии, соответствующие антибиотикам Р-лактамной группы, тетрациклиновой группы, стрептомицину и хлорамфениколу, окрашены в более интенсивный цвет по сравнению с контрольной линией, результат анализа считается отрицательным, что свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемом продукте или о содержании антибиотиков в концентрации, меньшей предела обнаружения методики измерений.

Если интенсивность окрашивания тестовых линий и контрольной линии одинакова, либо тестовые линии окрашены менее интенсивно по сравнению с контрольной линией, результат анализа считается положительным, что свидетельствует о наличии антибиотиков в анализируемом продукте в концентрации, близкой к пределу обнаружения методики измерений.

Если тестовые линии, соответствующие антибиотикам, отсутствуют, результат анализа считается положительным, что свидетельствует о наличии антибиотиков в анализируемом продукте в концентрации, большей предела обнаружения методики измерений.

Если проба анализируемого продукта определена как положительная необходимо провести повторное измерение согласно 8.3.

10.2 Обработка результатов измерений с применением считывающего устройства для тест-полосок

Тест-полоску помещают в считывающее устройство и проводят обработку результатов анализа согласно инструкции, прилагаемой к устройству.

Результаты анализа выводятся на дисплей считывающего устройства и сохраняются в памяти прибора.

Если проба анализируемого продукта определена как отрицательная, программное обеспечение отображает значение «Negative». Это означает, что антибиотики в анализируемом продукте отсутствуют или их содержание менее предела обнаружения методики измерений.

Если проба анализируемого продукта определена как положительная, программное обеспечение отображает «Positive». Содержание определяемых антибиотиков в анализируемом продукте больше или равно пределу обнаружения методики измерений.

10.3 Если проба анализируемого продукта определена как положительная необходимо провести повторное измерение согласно 9.

10.4 Метрологические характеристики

Пределы обнаружения наличия остаточного содержания антибиотиков [3-лактамной и тетрациклиновой групп, стрептомицина и хлорамфеникола в молоке с применением тест-набора «Test Milkpro 4D» производства компании Shenzhen Bioeasy Biotechnology Co., Ltd, Китай, приведены в таблице 1.

11 Требования безопасности, охраны окружающей среды

При выполнении измерений необходимо соблюдать следующие требования:

помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных требованиями ГОСТ 12.1.005;

требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007;

требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019;

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной

Результаты анализа выводятся на дисплей считывающего устройства и сохраняются в памяти прибора.

Если проба анализируемого продукта определена как отрицательная, программное обеспечение отображает значение «Negative». Это означает, что антибиотики в анализируемом продукте отсутствуют или их содержание менее предела обнаружения методики измерений.

Если проба анализируемого продукта определена как положительная, программное обеспечение отображает «Positive». Содержание определяемых антибиотиков в анализируемом продукте больше или равно пределу обнаружения методики измерений.

10.3 Если проба анализируемого продукта определена как положительная необходимо провести повторное измерение согласно 9.

10.4 Метрологические характеристики

Пределы обнаружения наличия остаточного содержания антибиотиков р-лактамной и тетрациклиновой групп, стрептомицина и хлорамфеникола в молоке с применением тест-набора «Test Milkpro 4D» производства компании Shenzhen Bioeasy Biotechnology Co., Ltd, Китай, приведены в таблице 1.

11 Требования безопасности, охраны окружающей среды

При выполнении измерений необходимо соблюдать следующие требования:

помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточновытяжной вентиляцией в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных требованиями ГОСТ 12.1.005;

требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007;

требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019;

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной

безопасности по ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения по
ГОСТ 12.4.009.
12 Требования к квалификации оператора

Выполнение измерений может проводить специалист, имеющий специальное образование и освоивший метод в соответствии с требованиями настоящих Методических рекомендаций и Инструкцией по эксплуатации тест-наборов.

////////////////////////////